Forbigående udtryk i rødbede biofarmaceutiske kandidat vaccine til Type 1 Diabetes

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at producere en oral vaccine kandidat mod Type 1 diabetes i en spiselig plante.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plante molekylært landbrug er brugen af planter til at producere molekyler af interesse. I dette perspektiv, kan planter bruges både som bioreaktorer til produktion og efterfølgende rensning af det endelige produkt og for den direkte mundtlige levering af heterolog proteiner ved brug af spiselige plantearter. I dette arbejde præsenterer vi udviklingen af en kandidat oral vaccine mod Type 1 Diabetes (T1D) i spiselige plante systemer ved hjælp af dekonstrueret plante virus-baseret rekombinant DNA-teknologi, leveret med vakuum infiltration. Vores resultater viser, at en rødbede er en passende vært for forbigående udtryk for en menneskelig afledte autoantigen knyttet til T1D, anses for at være en lovende kandidat som en T1D vaccine. Bladene producerer autoantigen blev grundigt karakteriseret for deres modstand mod gastrisk fordøjelse, for tilstedeværelsen af resterende bakteriel afgift og for deres sekundære metaboliske profil, giver en oversigt over processen for den potentielle anvendelse af planter til direkte oral levering af en heterolog protein. Vores analyse viste næsten fuldstændig nedbrydning af den frysetørrede kandidat oral vaccine efter en simuleret gastrisk fordøjelse, tyder på, at en indkapsling strategi til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine er påkrævet.

Introduction

Siden anlægget Molekylærbiologi revolution i 1980 ' erne, kan plante-baserede systemer til produktion af biopharmaceuticals betragtes som et alternativ til traditionelle systemer baseret på mikrobiel og mammale celler1. Planter viser flere fordele frem for traditionelle platforme, med skalerbarhed, omkostningseffektivitet og sikkerhed at blive den mest relevante2. Den rekombinante produkt kan renset fra transformerede plantevæv og derefter administreres, enten parenteralt eller mundtligt og i øvrigt transformeret spiselige plante kan bruges direkte til oral levering. Den mundtlige rute fremmer samtidig slimhinde og systemisk immunitet, og det fjerner behovet for nåle og specialiseret medicinsk personale. Derudover eliminerer oral levering den komplekse downstream behandling, som normalt tegner sig for 80% af de samlede produktionsomkostninger af en rekombinant protein3. Alle disse fordele kan oversættes til besparelser i produktion, levering og arbejdskraft at reducere omkostningerne i forbindelse med hver dosis, gør stoffet overkommelig for de fleste af verdens befolkning.

Flere strategier, både for stabil transformation og forbigående udtryk, var udviklet til fremstilling af rekombinante proteiner i planter. Blandt dem giver en højtydende dekonstrueret plante virus-baseret udtryk system (f.eks. magnICON) overlegen ydeevne fører høje udbytter af rekombinante proteiner over relativt korte tidsfrister4. Mange eksempler på forbigående udtryk ved hjælp af planten virus-baseret udtryk system i Nicotiana benthamiana planter er rapporteret, at være guldstandarden produktion vært. Denne model plante betragtes ikke som en spiselige arter på grund af alkaloider og andre toksiske metabolitter, der er akkumuleret i sine blade.

I dette arbejde, beskriver vi sammenligning mellem to spiselige plante systemer, rødbede (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for at give udtryk for to kandidat 65 kDa isoform af glutaminsyre decarboxylase (GAD65), udført af planten virus-baseret vektorer5. GAD65 er et større autoantigen forbundet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er i øjeblikket under efterforskning i humane kliniske forsøg til at forhindre eller forsinke T1D ved at inducere tolerance6. Produktionen af GAD65 i planter er blevet grundigt undersøgt i modellen plantearter som Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her, beskriver vi brugen af spiselige plantearter til produktion af molekyle i væv, der kan være beregnet til en direkte oral levering. Fra et teknisk synspunkt, vi studeret og valgt system for planten agroinfiltration og spiselige plante platform for GAD65 produktion ved at evaluere forskellige parametre: udtrykket rekombinante protein niveauer, de resterende mikrobielle afgift i anlægget væv beregnet til oral levering, modstanden i GAD65 til gastrisk fordøjelsen og bioækvivalens af de transformerede planter med wild-type.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. røde sukkerroer og spinat dyrkning

  1. Vokse rødbede (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i et vækst kammer, med 150 µE af lysintensitet, 65% relativ luftfugtighed, 12 h lys/mørke cyklus på 23/21 ° C, hhv.
  2. Efter frø spiring, befrugte planter to gange om ugen med en 1 g/L opløsning af et kommercielt tilgængelige gødning (Tabel af materialer). Brug fem uger gamle spinat og seks uger gamle rødbede planter til agroinfiltration.

2. forbigående udtryk gennem dekonstrueret plante virus-baseret teknologi

  1. Opførelsen af anlægget udtryk vektorer
    1. Indføre vektorer - 5'-modulet (pICH20111), 3' modulerne (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut og pICH7410.eGFP), forberedt som tidligere beskrevet1,2,7, og modulet integrase (pICH14011)- i Agrobacterium tumefaciens GV3101 stamme ved hjælp af standardteknikker. Vokse på LB medie som indeholder 50 μg/mL rifampicin og passende vektor-specifikke antibiotika (50 μg/mL carbenicillin til pICH20111, pICH14011 og pICH7410.eGFP), 50 μg/mL kanamycin for pICH31070 i 2 dage ved 28 ° C.
    2. Skærmen kolonier af kolonien PCR ved hjælp af de følgende specifikke primere for hver vektor: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' og 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' de 3' moduler pICH31070.GAD65mut-og pICH31070.∆87G65mut, med et optimerende temperatur på 55 ° C og en brudforlængelse tid af 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' og 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' til den tredje 3' modul pICH7410.eGFP, med et optimerende temperatur 53 ° c og en brudforlængelse tid 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' og 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' for 5' modulet, med et optimerende temperatur 53 ° c og en brudforlængelse tid 20 s og 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' og 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' til modulet integrase med et optimerende temperatur på 57 ° C og en brudforlængelse tid 45 s.
    3. Udføre PCR reaktion i en samlet maengde paa 20 μL ved hjælp af følgende specifikke reaktion cyklus: 5 min indledende denaturering ved 95 ° C, 35 cyklusser af 30 s ved 95 ° C, 30 s ved de optimerende temperatur og brudforlængelse trin ved 72 ° C (udglødning temperatur og brudforlængelse tid en re specifikke for hver primer par) og en afsluttende brudforlængelse trin i 7 min. ved 72 ° C.
  2. Sprøjte agroinfiltration
    1. Podes de tre A. tumefaciens transformants i 50 mL LB medium indeholdende 50 μg/mL rifampicin og følgende passende vektor-specifikke antibiotika: 50 μg/mL carbenicillin til A. tumefaciens omdannet med pICH20111, pICH14011 eller pICH7410.eGFP eller 50 μg/mL kanamycin for A. tumefaciens omdannet med pICH31070. Vokse ved omrystning natten over ved 28 ° C.
    2. Pellet overnight bakteriel kulturer ved centrifugering ved 4500 x g i 20 min. og resuspend dem i 100 mL (eller to bind af den oprindelige bakteriekulturen) af infiltration buffer indeholdende 10 mM 4-morpholineethanesulfonic syre (MES; pH 5,5) og 10 mM MgSO4, uden at overveje OD600. Inkuber suspensioner ved stuetemperatur (RT) for 3 h.
    3. Bland lige mængder af bakteriel opslæmninger indeholdende en af de tre moduler, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller eGFP 3' modul, med 5' modul og integrase modul. Brug suspension mix for sprøjten infiltration af røde sukkerroer og spinat blade.
    4. Anbringes 5 mL af suspensionen i en sprøjte uden nålen. Tryk på spidsen af sprøjten mod undersiden af bladet for både spinat og rødbede planter, og i mellemtiden anvende en blid counterpressure på anden siden af bladet.
    5. Infiltrere de første tre helt udvidet blade fra apex til hver plante. Mærke agroinfiltrated blade med en papir tag på blad-stilken. Returnere planterne i en vækst kammer under standardbetingelser.
      Bemærk: For sundheds- og sikkerhedsmæssige årsager bære øjenbeskyttelse og handsker under infiltration proces.
    6. Indsamle agroinfiltrated blade fra 4 til 14 dage efter infektion (dpi) og fryse dem i flydende kvælstof. Butik plantevæv ved-80 ° C.
  3. Vakuum agroinfiltration
    1. Vokse adskilt de tre A. tumefaciens transformants i 50 mL af LB medium, der indeholder 50 μg/mL rifampicin og passende vektor-specifikke antibiotika ved omrystning natten over ved 28 ° C.
    2. Pellet overnight bakteriel kulturer ved centrifugering ved 4500 x g i 20 min. resuspenderes i 1 L infiltration buffer til en OD600 af 0,35 og inkuberes suspensioner på RT for 3 h.
    3. Tilføje 0,01% v/v vaskemiddel (Polysorbat 20) til hver suspension. Bland lige mængder af bakteriel opslæmninger indeholdende en af de tre moduler, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller eGFP 3' modul, med 5' modul og integrase modul.
    4. Indsæt en plante (seks uger gamle rødbede plante, se afsnit 1) i holderen. Invertere indehaveren og Placer den oven på et bægerglas, der indeholder infiltration badekar (2 L) at oversvømme blade i infiltration suspension.
      Bemærk: Sikre, at alle bladene helt dyppet i den bakterielle suspension. Hæve niveauet med tilsætning af ekstra infiltration suspension, hvis det kræves.
    5. Overføre infiltration badet med neddykket anlægget til infiltration kammer og lukke den. Tænd vakuumpumpen og åbne vakuum indtag ventilen på infiltration kammer.
    6. Når trykket i infiltration kammer har reduceret til 90 mbar, holde vakuum i 3 min. Release vakuum til 45 s. Når infiltrationen kammer har returneret til atmosfærisk tryk, åbne salen og fjerne infiltreret planten fra bakteriel badet.
    7. Returnere planterne i en vækst kammer under standardbetingelser.
    8. Indsamle agroinfiltrated blade på de maksimale udtryk dpi, afhængigt af af rekombinante protein, og fryse dem i flydende kvælstof. Butik plantevæv ved-80 ° C.

3. rekombinante protein udtryk analyse

  1. Samlede opløseligt protein (TSP) udvinding
    1. Male sprøjten eller vakuum infiltreret røde sukkerroer og spinat blade, indsamlede i trin 2.2.6 og 2.3.8, til fint pulver i flydende kvælstof ved hjælp af morter og pistil. Overførsel af pulver til 15 mL plastik rør og gemme materialet på-80 ° C.
    2. Tilføje 900 µL af ekstraktionsbuffer (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 20 mM natrium kaliummetabisulfit) til 300 mg blad pulver.
      Bemærk: De valgte forholdet mellem plante væv vægt (mg) til buffer volumen (µL) er 1:3.
    3. Rystes blandingen af vortexing i 1 min., derefter centrifugeres ved 30.000 x g i 40 min ved 4 ° C.
    4. Indsamle supernatanten i en ren rør og opbevare det ved-80 ° C.
  2. Anlægget eGFP visualisering og kvantificering
    1. Indlæse 100 µL af hver TSP ekstrakt fremstillet af eGFP udtrykker blade, i tre tekniske replikater, på en 96-brønd plade.
    2. Læg 96-brønd plade i en fluorescens læser og start måling. Bruge 485/535 nm filter angivet påkrævet for eGFP fluorescens påvisning.
    3. For den absolutte kvantificering, i den samme plade forberede en kalibreringskurve lastning forskellige mængder (62,5, 125, 500, 750 og 1000 ng) af en renset eGFP.
  3. Bicinchoninic syre (BCA) assay for tsk kvantificering
    1. Bland 50 dele af reagens A (Tabel af materialer) med 1 del af reagens B (Tabel af materialer). Forberede sig tilstrækkeligt volumen af friske BCA brugsopløsning til prøverne der skal analyseres og Kalibreringsstandarder.
      Bemærk: Mængden af BCA brugsopløsning kræves for hver prøve er 1,9 mL. For den normale procedure med 9 standarder (herunder en blank), er 17,1 mL af BCA brugsopløsning påkrævet.
    2. Der afpipetteres 0,1 mL af hver standard (herunder en blank), og TSP ekstrakter i en mærket tube.
      Bemærk: Som Kalibreringsstandarder, forberede et nyt sæt af bovint serumalbumin (BSA) standarder i området 10-1.000 μg/mL, helst ved hjælp af den samme fortyndingsmiddel som prøver, som vand. Blindprøven består af 0,1 mL fortyndingsvæske bruges til kalibreringsstandardens og forberedelse af prøver.
    3. Tilføje 1,9 mL af BCA brugsopløsning og blandes grundigt. Dække rør og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
    4. Cool rør til RT. foranstaltning absorbans ved 562 nm af alle prøver inden for 10 min.
      Bemærk: Selv på RT, farve udvikling fortsætter. Ingen væsentlige fejl vil blive indført, hvis absorbans målinger af alle rør er gjort inden for 10 min.
    5. Subtrahere 562 nm absorbans værdien af Tom fra aflæsningerne af standarderne og TSP ekstrakter.
    6. Plot blank-korrigeret 562 nm læsning for hver standard på dets koncentration. Bestemme proteinkoncentration hver TSP ekstrakt.
  4. Udføre Coomassie gel farvning som tidligere beskrevet i Gecchele et al.8.
  5. Western blot analyse
    1. Udføre western blot analysen som tidligere beskrevet i Gecchele et al.8.
    2. Efter elektroforetisk adskillelse af proteiner, overføre dem til en nitrocellulose membran ved hjælp af standardteknikker. Forberede den blokerende løsning ved at blande 4% mælk i phosphat bufferet saltvand (PBS) pH 7,4. Blokere membran med 10 mL af den blokerende løsning på RT for 1 h.
    3. Forberede kanin primære antistof på 1:10,000 for anti-GAD65/67 og anti-LHCB2, og 1:20,000 for anti-eGFP i 5 mL blokerende løsning med 0,1% vaskemiddel. Inkuber membran med rede primære antistof løsninger natten over ved 4 ° C eller til 4 h i RT med konstant agitation.
    4. Kassér den primære antistof og vaske membran 3 gange for 5 min med blokerende opløsning af 0,1% vaskemiddel.
    5. Forberede peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede anti-kanin antistof på 1:10,000 i blokerende løsning med 0,1% vaskemiddel. Inkuber membran for 1,5 h i RT med konstant agitation.
    6. Kassér den sekundær antistof og vaske membran 5 gange for 5 min med PBS-T (PBS suppleret med 0,1% vaskemiddel).
    7. Inkuber membranen med en kommercielt tilgængelig luminol løsning efter fabrikantens anvisninger. Registrere signalet ved hjælp af en kemiluminescens imaging system.

4. plante materiale forarbejdning

  1. Høst af vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-udtrykker rødbede blade på udtryk peak (11 dpi) og fryse dem i flydende kvælstof.
  2. Lyophilize de frosne blade i 72 timer ved-50 ° C og 0,04 mbar. Opbevar dem ved-80 ° C.
  3. Slibe bladene til fint pulver og gemme det på RT i en lukket beholder med silica gel til at udelukke fugten.

5. gastrisk fordøjelsen simulering og celle integritet analyse

  1. Gastrisk fordøjelsen simulering
    1. Afvejes 100 mg af slebne frysetørret rødbede blade og resuspend det i 6 mL PBS (pH 7,4).
    2. PH prøve indstilles til 2 med 6 M HCl.
    3. Tilføj 4 mg/mL pepsin fra svin mavens slimhinde i 10 mM HCl til at opnå en endelig pepsin koncentration af 1 mg/mL eller et forhold på 1:20 til totale opløselige proteiner. Ryst prøven ved 37 ° C i 120 min.
    4. Justere prøver at pH 8 med 1 M NaOH til at inaktivere pepsinet.
    5. Centrifugeres 750 µL delprøver af hver prøve på 20.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Indsamle separat supernatanten og resuspenderes i én supernatanten diskenhed for at indlæse buffer (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol og 4% 2-mercaptoethanol).
      Bemærk: For sundheds- og sikkerhedsmæssige årsager bære handsker og arbejde under stinkskab for prøveforberedelse.
    6. Analysere både supernatanten og den resuspenderede pellet ved western blot analyse8.
  2. Celle integritet analyse
    1. Forbered to prøver af 100 mg af slebne frysetørret rødbede blade og resuspend både i 6 mL PBS (pH 7,4).
    2. PH-værdien af kun en prøve til 2 med 6 M HCl. ryste begge prøver ved 37 ° C i 120 min.
    3. Centrifugeres 750 µL delprøver af hver prøve på 20.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Indsamle separat supernatanten og resuspenderes i én supernatanten diskenhed for at indlæse buffer.
    4. Analysere både supernatanten og den resuspenderede pellet ved western blot analyse.

6. rengøringsmetoder assay

  1. Der afvejes 100 mg af frysetørrede rødbede blade. Resuspend pulver i 8 mL steril PBS (pH 7,4) og vortex for 1 min.
  2. Forberede LB medium uden antibiotika eller indeholder a 50 µg/mL rifampicin, (ii) 50 µg/mL hver af rifampicin og carbenicillin, (iii) 50 µg/mL hver rifampicin og kanamycin eller (iv) 50 µg/mL hver rifampicin, carbenicillin og kanamycin.
  3. Plade 1 mL af hver frysetørret blad homogenatet i en af de 5 selektive LB medier.
  4. Inkuber alle plader i 3 dage ved 28 ° C.
  5. Kolonierne Agrobacterium dyrkes på hver plade.
  6. Beregne og definere de resterende bakteriel afgift som antallet af kolonien danner enheder (CFU) pr. mL frysetørret blad homogenatet (CFU/mL).

7. metabolit udvinding

  1. Primære metabolit udvinding
    1. Vejer 30 mg af-80 ° C gemt, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-udtrykker rødbede blad pulver i et 2 mL plastikrør.
    2. Tilføje 750 µL koldt 70/30 (v/v) metanol/kloroform og vortex for 30 s. Incubate ved-20 ° C i 2 timer.
      Bemærk: Alle opløsningsmidler og tilsætningsstoffer skal være LC-MS grade.
    3. Tilføje 600 µL koldt vand og centrifugeres ved 17,900 x g ved 4 ° C i 10 min. indsamle og overføre den øverste hydroalkoholisk fase ind i et nyt 2 mL rør. Kassér den lavere chloroformic fase og interfasen.
    4. Sætte prøverne i et vakuum koncentrator til 3 h til at fordampe opløsningsmidler.
    5. Opløse toerstoffet fra trin 7.1.4 i 300 µL 50/50 (v/v) acetonitril/vand og sonikeres prøver i 3 min.
    6. Passere løsningerne gennem 0,2 μm membranfiltre og læg dem i en gennemsigtig fast 300 µL Indsæt glasrør.
  2. Sekundære metabolit udvinding
    1. Vejer 300 mg af-80 ° C gemt, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-udtrykker rødbede blad pulver i en 15 mL plastik rør.
    2. Tilføj 3 mL methanol, vortex for 30 s, og Læg instrumenterne i ultralydsbad på 40 kHz for 15 min.
      Bemærk: Alle opløsningsmidler og tilsætningsstoffer skal være LC-MS grade.
    3. Centrifugeres prøver på 4.500 x g ved 4 ° C i 10 min og overføre analysere til nye 15 mL rør.
    4. Fortyndet 100 µL af ekstrakt 1:3 (v/v) med vand og passerer en 0,2 μm membranfilter løsningen.
    5. Sætte løsningen i en gennemsigtig fast 300 µL Indsæt glasrør.
  3. Polar lipid udvinding
    1. Vejer 200 mg af-80 ° C gemt, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-udtrykker rødbede blad pulver i en 15 mL plastik rør.
    2. Tilføje 200 µL vand og derefter 2 mL methanol, og derefter holde på køl i 1 time.
      Bemærk: Alle opløsningsmidler og tilsætningsstoffer skal være LC-MS grade.
    3. Vortex for 30 s og sonikeres på 40 kHz for 15 min.
    4. Centrifugeres prøver på 4.500 x g ved 4 ° C i 25 min. indsamle og overføre chloroform fase til 2 mL rør. Kassér den øverste hydroalkoholisk fase og interfasen.
    5. Sætte prøverne i et vakuum koncentrator til 3 h til at fordampe opløsningsmidlet.
    6. Opløse toerstoffet fra trin 7.3.5 med 600 µL af methanol.
    7. Fortyndet 100 µL af ekstrakt 1:5 (v/v) med methanol og passerer en 0,2 μm membranfilter løsningen.
    8. Sætte løsningen i en gennemsigtig fast 300 µL Indsæt glasrør.

8. Væskekromatografisk massespektrometri analyse og databearbejdning

  1. Oprette LC-MS system, som anbefalet af leverandøren.
    Bemærk: LC-sektion består af en autosampler kombineret med HPLC udstyret med en C18 forkolonnen (75 x 2,1 mm, partikel størrelse 5 µm) foran en C18 kolonne (150 x 2,1 mm, partikel størrelse 3 µm) til analyse af sekundære metabolitter og polar lipider , der henviser til, med en HILIC forkolonnen (7,5 x 2,1 mm, 3 µm) foran en HILIC kolonne (150 x 2,1 mm, partikel størrelse 2.7 µm). MS er en ion trap massespektrometer forsynet med enten en electrospray Ionisation (ESI) eller en atmosfærisk tryk kemisk ionisering (APCI) kilder.
  2. Forberede de passende opløsningsmidler til HPLC forløb. For primære metabolit analyser, bruge 20 mM ammonium formiat som opløsningsmiddel A; 95% acetonitril, 5% vand plus 10 mM ammonium formiat som opløsningsmiddel B. For sekundære metabolit analyser, bruge vand plus 0,05% myresyre (A) og acetonitril plus 0,05% myresyre (B). Polar lipid analyse, at bruge vand plus 0,05% myresyre (A) og 100% acetonitril (B).
    Bemærk: Opløsningsmidler og tilsætningsstoffer skal være LC-MS grade.
  3. Bruge gradienter rapporteret i tabel 1 for metabolitten eluering. Sæt strømmen Vurder på 0,2 mL/min. Injicér 10 µL af hver prøve for både sekundære metabolitter og polar lipider, mens indsprøjtes 5 µL for primære metabolitter.
  4. Forberede en kvalitetskontrol (QC) prøve ved blanding af lige store portioner af forskellige prøver at have en repræsentant blanding af hver eksperimentelle betingelse. Analysere QC prøven under eksperiment at overvåge instrument effektivitet. Specifikt, indsætte en QC prøve analyse efter hver 10 prøve-parti.
  5. Randomisere prøver for at undgå instrument-drevet virkninger.
  6. Efter 9 analyser, indsætte en kolonne rengøring metode og en blank analyse umiddelbart efter.
    Bemærk: Udføre et langsomt forløb mellem de to opløsningsmidler med et isocratic eluering på høj procentdel af de stærkeste opløsningsmiddel. Blindprøven består af en injektion af en ren methanol: vand (50/50, v/v) til at forbedre opbevaring tid reproducerbarhed i den følgende analyse.
  7. Indstille apparatet til at erhverve massespektre i alternative positive og negative ionisering tilstande ved hjælp af de parametre, der er anført i tabel 2.
    Bemærk: Andre parametre afhænger af den specifikke platform.
  8. Udføre den næste databehandling, som forklaret i Dal Santo et al.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette arbejde præsenteres for udviklingen af en oral vaccine i spiselige plantevæv arbejdsgang. Fokus for dette arbejde er udtryk for et mål protein i en spiselig vært plantearter og karakterisering af den potentielle oral vaccine.

Det første trin involveret evaluering af egnetheden af plante virus-baseret udtrykket teknologi til at producere rekombinante proteiner i spiselige plante systemer. Til dette formål, vi først bruge eGFP som en model protein og vi udtrykte det i to spiselige grønne plante systemer: rødbede og spinat. Planterne var manuelt agroinfiltrated med suspensioner af A. tumefaciens transporterer eGFP rekombinant udtryk vektorer. Fluorescerende proteiner udtryk blev visualiseret ved western blot analyse (figur 1A, B, D, E) og kvantificeres under UV-lys. Resultaterne viste, at ordningen med rødbede er kendetegnet ved en højere eGFP udtryk, at nå 544.9 ± 10.9 µg/g friske blade vægt (FLW) på 9 dpi (figur 1 c), end spinat, hvilke maksimale eGFP niveauer (113.4 ± 0,3 µg/g FLW) blev målt ved 11 dpi ( Figur 1F). Af disse grunde rødbede blev valgt som udtryk vært for alle efterfølgende forsøg.

Ifølge Chen et al.10, blev eGFP forbigående udtryk testet af et vakuum metode for infiltration, som er mere egnet til storstilet vaccineproduktion. Forskellige fortyndinger af natten A. tumefaciens kultur, lige fra 10-1 til 10-3, og forskellige koncentrationer af vaskemiddel (0.005-0,05%) er blevet testet ved at sammenligne eGFP ophobning niveau på maksimale udtryk dpi (9 dpi). Resultaterne fundet, at højere bakteriel titers produceret større eGFP udbytter (10-1 ~ 0,35). Dog fandtes ingen væsentlige forskelle ved hjælp af forskellige vaskemiddel koncentrationer (data ikke vist).

Derefter, planter var vakuum infiltreret med en A. tumefaciens suspension på 0,35 OD600 og 0,01% af vaskemiddel. Når udtrykket platform og leveringssystemet blev etableret, udtryk for to former for GAD65, GAD65mut og et N-terminalt afkortet form (∆87GAD65mut), blev sammenlignet på dagen for maksimal udtryk, 5 og 11 dpi, henholdsvis, som tidligere etableret11. Efter tsk udvinding fra agroinfiltrated blade, alle prøver blev analyseret af vestlige skamplet og den rekombinante proteiner var relativt kvantificeres ved en densitometri analyse (figur 2). Resultater fremhævet den 20-fold højere ydelse af formen ∆87GAD65mut over GAD65mut. Afkortede form blev derfor udvalgt som foretrukne oral vaccine kandidat, akkumulere så højt som 201.4 ± 29.3 µg/g FLW i rødbede blade på 11 dpi.

Endelig, parametre for udviklingen af en potentiel oral vaccine blev evalueret. Rekombinante protein integritet efter frysetørring af vakuum infiltreret rødbede blade at udtrykke ∆87GAD65mut blev vurderet i sammenligning med de ubehandlede (kun frosne) væv, med western blot analyse. Som vist i figur 3A, target proteinet påvist for at være stabil efter ingot proces.

Simulering af gastrisk fordøjelsen blev udført på den frysetørrede materiale ved at tilføje svin gastrisk enzym pepsin til en endelig koncentration på 1 mg/mL eller i forholdet 1:20 til tsk. Begge fordøjelsessystemet behandling forhold resulterede i rekombinante protein nedbrydning, som det fremgår af western blot analyse (figur 3 c, D, E, indberettes data kun for pepsin endelig koncentration på 1 mg/mL). Fravær af et bestemt signal i pellet prøver efter pepsin fordøjelsen (baner pepsin, p 1-3), foreslog at efter frysetørring behandling, plantecellerne mistet deres integritet, fører til målet protein nedbrydning.

Evaluering af celle integritet viste, at når tørrede plantevæv var genopslemmes i buffer med neutral pH (pH 7,4), ∆87GAD65mut var delvist solubilized, tyder på, at i det mindste nogle celler blev brudt under blad slibning og tørring. Ophvirvling af tørrede plantevæv i sure betingelser, i stedet ført til påvisning af ∆87GAD65mut kun i de uopløselige brøkdel. Det var sandsynligvis på grund af den ∆87GAD65mut nedbør forårsaget af den lave pH, ud over proteinindholdet i ubrudt celler11. Disse analyser viser, at fryse tørring kunne vælges som behandling for udarbejdelsen af vaccine kandidaten.

Derudover blev de resterende mikrobielle afgift i agroinfiltrated rød-sukkerroer blade evalueret.

Rengøringsmetoder assay vises, at behandlinger udnyttes til kandidat vaccine forberedelse elimineret bakteriemængde11.

Den metaboliske bioækvivalens af ∆87GAD65mut og kontrol rødbede planter blev vurderet af fingeraftryk af primære og sekundære metabolitter og polar lipider genereret af LC-MS fra ni rødbede planter at udtrykke ∆87GAD65mut, ni agroinfiltrated kontrol og ni wild-type kontrolelementer. PCA statistik afslørede en wild-type plante klynge adskilt fra alle de andre prøver. Ingen væsentlige forskelle blev i stedet fremhævet mellem ∆87GAD65mut og infiltreret og negativ kontrol planter. Ingen signifikant forskel mellem de tre grupper af planter med hensyn til polar lipid profiler var desuden identificeret11.

Figure 1
Figur 1: sammenligning af eGFP udtryk niveauer i agroinfiltrated røde sukkerroer og spinat blade. Western blot analyse (A, D) og tilsvarende lastning kontrolelementer (RuBisCO store subunit) farves med Coomassie strålende blå (B, E) af protein ekstrakter fra eGFP-udtrykker blad prøver indsamlet under tidsforløb analyse fra 4 til 14 dage efter infektion (dpi). EGFP indhold af hvert blad proteiner ekstrakt blev kvantificeres ved fluorescens målingen (C, F). Resultater fra agroinfiltrated red-sukkerroer blade prøver vises i venstre panel, hvor agroinfiltrated spinat prøver er vist i den rigtige. Lige store mængder af protein ekstrakter er blevet indlæst, 3,5 µg for den vestlige skamplet og 30 µg for Coomassie farvning. En anti-eGFP antistoffer er blevet brugt som en sonde i western blot analyse. Side tal angiver molekylære masse markører i kDa. p.c., positiv kontrol, 10 ng af kommercielle rekombinante humane GAD65; n.c., negativ kontrol, uddrag fra bladene infiltreret udelukkende med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. Fejllinjer udgør standardafvigelsen fra tre uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra Bertini et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: GAD65mut og Δ87GAD65mut udtryk niveauer i rødbede blade. Western blot analyse (A) og tilsvarende lastning kontrol (RuBisCo store subunit) farves med Coomassie strålende blå (B) af protein ekstrakter fra tre rødbede bladene udtrykker Δ87GAD65mut (venstre) og GAD65mut (til højre). En anti-GAD antistof er blevet brugt som en sonde i western blot analysen (banerne, der var lastet med 20 μL af ekstrakt til GAD65mut og 1 μL af ekstrakt for Δ87GAD65mut). I Coomassie farvede gel, blev den samme mængde protein ekstrakter (10 μL/lane) indlæst til GAD65mut og Δ87GAD65mut. Side tal angiver molekylære masse markører i kDa. p.c., positiv kontrol, 10 ng af kommercielle rekombinante humane GAD65; n.c., negativ kontrol, ekstrakt fra bladene infiltreret kun med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. (C) ved hjælp af den vestlige skamplet positive kontrol som en reference til en densitometric analyse, relative udtryk niveauer af to protein former er afbildet. Fejllinjer udgør standardafvigelsen fra tre uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra Bertini et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Oral vaccine kandidat evaluering. I venstre side, analyser af protein stabilitet efter frysetørring behandling (A, B). Western blot analyse (A) og tilsvarende gel farves med Coomassie strålende blå (B) der repræsenterer tre uafhængige uddrag fra bladene udtrykker Δ87GAD65mut. Høstede blade var direkte frosne (friske) eller frysetørret ved-50 ° C, 0,04 mbar til 72 h (frysetørret). Forskellige væv: buffer nøgletal var ansat under tsk udvinding for at overveje vandtab på grund af dehydrering. Lige saa stort volumen af uddrag blev indlæst, 0,25 og 10 µL til vestlige skamplet og Coomassie farvning henholdsvis. En anti-GAD antistof er blevet brugt til den vestlige skamplet sondering Side tal angiver molekylære masse markører i kDa. n.c., negativ kontrol, uddrag fra bladene infiltrated udelukkende med A. tumefaciens bærer 5'- og integrase moduler. På højre side, in vitro-simuleret gastrisk fordøjelsen af Δ87GAD65mut (C, D, E). Vestlige skamplet analyser (C, D) og tilsvarende gel farves med Coomassie strålende blå (E) repræsenterer tre uafhængige ekstrakter af bladene udtrykker Δ87GAD65mut efter simuleret gastrisk fordøjelsen. 1 mg/mL af pepsin er blevet føjet til 100 mg af frysetørrede væv, mens en kontrolprøve uden enzym er blevet brugt. 24 µL og 16 µL, for supernatanter (s) og pellets (p) henholdsvis fremstillet i den afsluttende centrifugering skridt, har været brugt i SDS-PAGE analyse. Anti-GAD (C) og anti-LHCB2 (D) antistoffer blev brugt som sonder i western blot analyse. Side tal angiver molekylære masse markører i kDa. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Primære metabolitter (100 min) Tid (min) % A % B Varighed (min) Type
Indledende 0 100 - Oprindelige tilstand
0 0 100 10 Isocratic
10 15 85 15 Gradient
25 15 85 5 Isocratic
30 50 50 10 Gradient
40 50 50 30 Isocratic
70 0 100 1 Gradient
71 0 100 29 Isocratic (re-ligevægt)
Sekundære metabolitter (60 min) Tid (min) % A % B Varighed (min) Type
Indledende 98 2 - Oprindelige tilstand
0 90 10 2 Gradient
2 80 20 10 Gradient
12 75 25 2 Gradient
14 30 70 7 Gradient
21 30 70 5 Isocratic
26 10 90 1 Gradient
27 10 90 14 Isocratic
41 98 2 1 Gradient
42 98 2 18 Isocratic (re-ligevægt)
Polar lipider (90 min) Tid (min) % A % B Varighed (min) Type
Indledende 50 50 - Oprindelige tilstand
0 0 100 10 Gradient
10 0 100 65 Isocratic
75 50 50 1 Gradient
76 50 50 14 Isocratic (re-ligevægt)

Tabel 1: Gradient betingelser for metabolitten eluering i LC-MS analyse.

Massespektrometer komponenter Funktion Parametre
Primære metabolitter Sekundære metabolitter Polar lipider
Electrospray Ionisation (ESI) kilde Forstøvningsudstyr gas 50 psi, 350 ° C 50 psi, 350 ° C -
Tørring gas 10 L min-1 10 L min-1
Atmosfærisk tryk kemisk ionisering (APCI) kilde Forstøvningsudstyr gas - - 50 psi, 350 ° C
Tørring gas 10 L min-1
Vaporizer 450 ° C
Ion trap og detektor scanning Formatindstilling for fuld scanning 13.000 m/z pr. sekund 13.000 m/z pr. sekund 13.000 m/z pr. sekund
50-1.500 m/z 50-1.500 m/z 50-1.500 m/z
Skan vifte 200 m/z 400 m/z 700 m/z
Målrette masse
Kollision gas Helium
Vakuum pres 1.4 x 10-5 mbar
Kapillar kilde +4,500 V +4,500 V +4,000 V
Ende plade forskydning -500 V -500 V -500 V
Hulske 40 V -40 V 40 V
Cap exit 106 V -121 V 143,5 V
1 oktober DC 12 V -12 V 12 V
Okt 2 DC 1.7 V -1.7 V 2 V
Lens 1 -5 V 5 V -5 V
Linse 2 -60 V 60 V -60 V
ICC for positive ionisering tilstand 20
ICC for negative ionisering tilstand 7

Tabel 2: Parametre for massespektre erhvervelse i alternative positive og negative ionisering tilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse viste vi foreløbig analyse for udformningen af en kandidat oral vaccine for autoimmune diabetes. Target proteinet for dette eksperiment var en muteret form for den menneskelige 65 kDa glutamat Decarboxylase, hvilke produktions- og funktionalitet er let påviselige og målbare12. Dens udtryk i forskellige spiselige plantevæv blev formidlet af vektorer5, der mægle et højt niveau af rekombinante protein produktion i en meget kort tidsramme. Udvælgelse af den bedste kandidat plante spiselige vært blev udført baseret på eGFP udtrykket i rødbede og spinat blade af manuel agroinfiltration. Dette trin kan være kritisk for industriel skala-up på grund af den tidskrævende procedure af manuel agroinfiltration og hårdhed i spinat blade væv infiltration.

Identifikation af den specifikke dpi af høst der giver den højeste rekombinante protein ophobning niveau for en rekombinant protein er et kritisk skridt og skal være testet og valgt på et sag til sag grundlag. Analyse af fluorescerende proteiner udtryk ved forskellige dpi (fra 4 til 12), lov til at identificere dag i maksimale udtryk i hvert anlæg system. Sammenligning mellem eGFP koncentrationen (µg/g FLW), i disse maksimale udtryk dage, fremhævet denne røde sukkerroer er den bedste platform for rekombinante protein udbytter.

Af denne grund, blev rødbede yderligere testet for levering af plante virus-baseret vektorer af et vakuum system, der betragtes som mere egnet til vaccine industriel masseproduktion13.

Standard vakuum infiltration protokol er optimeret til tobak arter5, er etableringen af en række parametre for justeringen procedure for plantearter betragtes som et kritisk punkt. Derefter, rødbede vakuum agroinfiltration protokol blev optimeret. Vores dokumentation viste, at Agrobacterium fortynding er afgørende at forbedre udtryk proteinniveauet, mens den vaskemiddel koncentration til at forbedre blad permeabilitet. Resultaterne viste, at plante system og teknologi passer med dette arbejde formål.

To forskellige former for GAD65, GAD65mut og ∆87GAD65mut, der tidligere var kendetegnet for deres udtryk i N. benthamiana7, vise forskellige subcellulære lokalisering, blev udtrykt i rødbede af vakuum infiltration. Tre biologiske replikater blev udarbejdet for hver prøve. Hver biologiske replikat består af en pulje af tre infiltreret blade fra forskellige planter, stikprøven fra 2 til 14 dpi for begge GAD65 forms. Deres udtryk niveau var i forhold til at vælge den højeste akkumulere protein i plantevæv.

Den relative kvantificering af densitometri analyse viste, at ∆87GAD65mut har en 20-fold højere udtryk niveau end dens intakt modstykke. Dette kunne på grund af dens cytosole lokalisering samtidig med GAD65mut, på grund af dets restkoncentrationer, at forankre denne form til at cellemembranen, har en lavere udbytte7, som afspejler en lavere protein stabilitet. ∆87GAD65mut gennemsnitlige ophobning niveau i rødbede blad væv var 201.4 ± 29.3 µg/g FLW, som er tilstrækkelig til at starte med T1D oral vaccine udvikling.

Endelig, efter udvælgelsen af den mest egnet platform, teknologi og protein form, vi foretog ved at oprette en post-høst behandling af de inficerede blade. Da blad væv er sammensat af 95% vand, er en dehydrering behandling nyttigt til at forhindre mikroorganisme forurening. Vores resultater viste, at en freeze-drying behandling kunne anvendes til prøven, uden at det påvirker de rekombinante protein niveauer i bladene. 10-fold vand fjernelse af ingot eliminerer bakteriel forurening (rengøringsmetoder), herunder den rekombinante A. tumefaciens anvendes til agroinfiltration proceduren.

Analysen af protein bio indkapsling viste desuden, at ∆87GAD65mut helt er fordøjet efter en simuleret gastrisk fordøjelsen. Dette tyder på, at den freeze-drying behandling skader plante cellevæg, udsætter det rekombinante protein med sure og enzymatiske sammensætningen af gastrisk miljø.

Vedligeholdelse af protein eller peptid molekyle integritet over mave-tarmkanalen overgangen til webstedet for absorption udgør et problem for mundtlige drug delivery14. Derfor, efter dehydrering behandling, potentielle vaccinen bør være korrekt formuleret til at overvinde den gastrisk miljø uden at miste sin integritet. Til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine, kunne indkapsling i en relativt stabil shell anvendes som et system til at forbedre sin effektivitet gør det muligt at være beskyttede og stabil langs oral levering route15.

Forskellige teknologier har været undersøgt for at overvinde problemerne i forbindelse med den mundtlige levering af makromolekyler såsom nogle nylige undersøgelser på kompleks af syntetiske hydrogel med insulin, som viste en høj indkapsling effektivitet og hurtige insulin udgivelse i tarmen i en pH-afhængige måde16,17.

Både den primære og sekundære metabolit bioækvivalens af planter at udtrykke ∆87GAD65mut i forhold til infiltreret og ikke-infiltreret kontrol blev undersøgt ved hjælp af PCA statistik. Forskellene mellem infiltreret planterne udtryk for ∆87GAD65mut og kontrolelementerne infiltreret var ikke betydelig, hvorimod ikke-infiltreret wild-type planter dannet en separat klynge. Disse resultater tyder på, at de infiltreret planter kan skelnes fra ubehandlede planter på LC-MS analyse takket være bakteriel metabolitter eller metabolitter produceret af planter på grund af infiltration, som allerede vist i litteratur13. Samlet set demonstreret denne analyse, ophobning af ∆87GAD65mut har ringe indflydelse på det samlede stofskifte.

Helt tyder disse resultater på, at den potentielle oral vaccine, repræsenteret af frysetørrede rødbede blad væv at udtrykke ∆87GAD65mut opnået at udnytte plante virus-baseret udtryk technology, er egnet til eksperimenterende T1D mundtlige immunterapi forsøg. Plante virus udtryk vector teknologi er blevet meget attraktivt i feltet forbigående udtryk på grund af dens evne til at producere fremmede proteiner både hurtigt og på et højt niveau. Denne teknologi er baseret på en dekonstrueret vektor, der bærer kun RNA polymerase RNA afhængige og bevægelse protein5 og derfor mister det sin infektivitetsniveauet i planter; som en konsekvens, bør dens potentielle overførsel til mennesker udelukkes.

Forsøgsplan rapporteret her kunne udvides til at omfatte mange forskellige spiselige arter, såsom salat, Chenopodium capitatum og Tetragonia expansa. Da bladene af disse arter, herunder rødbede og spinat, hvis var tidligere registreret som godt udtryk plante systemer5, kan bruges som ubehandlede fødevarer, teknologi foreslået her kan anvendes til fremstilling spiselige vacciner eller produktion af minimalt forarbejdede funktionelle fødevarer eller foder.

Kombinationen af rekombinante protein/plantearter, dpi af høst, der giver den højeste rekombinante protein ophobning nødvendigt stadig at fastlægge empirisk på en sag-sag-basis afhængigt af af rekombinante protein udtrykt og værten plante arter18.

Anvendelsen af denne teknologi til fremstilling af oral vaccine, der holder store muligheder for at blive et alternativ til konventionelle vacciner i den nærmeste fremtid, ud over at bekæmpe oncolytic vira, autolog vacciner til lymfomer og solide tumorer, og monoklonale antistoffer til target kræft19,20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det fællesprojekt "Brug af planter til produktion af en autoimmun diabetes spiselige vaccine (eDIVA)" (projekt-ID: 891854) finansieret af Universitet Verona inden for rammerne af indkaldelsen 2014.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    - Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    - Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    - System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   - Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    - 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83, (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20, (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9, (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1, (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11, (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23, (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5, (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1, (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12, (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics