Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión

Bioengineering

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir soluciones de proteína de seda de araña recombinante soluble en agua y las formas materiales que se pueden formar a partir de esas soluciones.

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Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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Abstract

Muchas arañas producen siete tipos de sedas. Seis de las sedas son fibras en forma cuando son producidas por las arañas. Estas fibras no son solubles en agua. Con el fin de reproducir las notables propiedades mecánicas de las arañas de seda, deben ser producidos en los anfitriones heterólogos como las arañas son tanto territoriales como caníbales. Los análogos sintéticos de la seda de araña también tienden a ser insolubles en soluciones acuosas. Por lo tanto, un gran porcentaje de investigación en sedas de araña recombinante dependen de disolventes orgánicos que son perjudiciales para la producción a gran escala de materiales. El método de nuestro grupo obliga a la solvación de estas sedas de araña recombinante en agua. Notablemente, cuando estas proteínas se preparan utilizando este método de calor y presión, una amplia gama de formas de material se puede preparar a partir de la misma solución de proteínas de seda de araña recombinante (rSSp) incluyendo: películas, fibras, esponja, hidrogel, lyogel, y adhesivos. Este artículo demuestra la producción de la rssp solvatadas y las formas de material de una manera que es más fácil de entender que de los materiales y métodos escritos por sí solos.

Introduction

Los sedas de araña han cosechado el interés de los científicos materiales por su impresionante combinación de fuerza, elasticidad y biocompatibilidad. La recreación de fibras ha sido tradicionalmente el empuje de la investigación. Este esfuerzo fue obstaculizado por la proteína de la seda de araña recombinante (rSSp) insolubilidad en agua, así como la incapacidad de las técnicas de solvación tradicionales (agentes chatrópicos y detergentes) para lograr la solución acuosa. Además, las técnicas que se han desarrollado para las versiones de poder disolvente de rssp no funcionan en todas las variantes de rssp y también requieren una manipulación sustancial y el tiempo que a menudo resulta en la pérdida de proteína1,2. Esto ha dado lugar en gran parte en el campo utilizando 1, 1, 1, 3, 3, 3-Hexafluoroisopropanol (HFIP) como un disolvente de la que formar fibras, y otras formas de material limitadas. La ventaja es que todos los rSSp conocidos son solubles en HFIP, proporcionando uniformidad de datos entre cada grupo de investigación. La desventaja es que el HFIP es un solvente tóxico que es costoso y poco práctico de escalar debido a problemas de salud y consideraciones ambientales.

Se desarrolló un enfoque novedoso para la solvación de rSSp que estableció un puente entre la brecha tecnológica entre el HFIP de solvente orgánico áspero y otras técnicas que trabajaron selectivamente para la solvación de rSSp. La combinación de las presiones y los calentamientos específicos se aplicó a las suspensiones de rSSp y agua. Los resultados fueron cerca de 100% de la solvación y recuperación de la rSSp, así como altas concentraciones de proteínas; se determinó que una variedad de formas de materiales eran posibles a partir de estas formulaciones que no eran todas alcanzables usando HFIP u otros disolventes orgánicos3,4,5,6. El objetivo de este enfoque es solubilizar de manera eficiente y fácil las proteínas de araña recombinante purificadas y secas en una solución acuosa que luego puede ser utilizada para la producción de una variedad de formas de materiales.

Las fibras, las películas, los recubrimientos, los adhesivos, los hidrogeles, los lyogels, las microesferas y los materiales de esponja se logran fácilmente a partir de la misma solución de rSSp acuosa utilizando este método. La evolución continua de este método, no sólo con rSSp adicionales sino con otras proteínas, podría conducir a nuevas formas de materiales y alternativas de purificación de proteínas y soluciones de solubilización.

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Protocol

1. preparación de la mezcla de seda de araña recombinante de las existencias de proteína liofilizada

  1. Determine la formulación y el volumen necesarios para las formaciones de material previstas. Las formulaciones típicas oscilan entre el 3% (p/v) y el 15% (p/v). Con esta selección, calcule el rSSp, las concentraciones y las proporciones correspondientes.
    1. Utilice las siguientes formulaciones respectivas para preparar cada material descrito en este protocolo: hidrogeles/esponjas/liogeles, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; Films/revestimientos, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adhesivos, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibras, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Nota: a pesar de que la mayoría de las formulaciones están mejor equipadas para formas y materiales específicos, hay una amplia gama de formulaciones que a menudo pueden superponerse. Además, los materiales de rSSp finales también se pueden adaptar durante la formación y el procesamiento para producir las propiedades deseadas. En general, cada proteína requerirá la investigación de los parámetros apropiados o útiles.
  2. Seleccione un vial limpio y nuevo de 8 mL de cultivo de vidrio de borosilicato con un tapón de rosca revestido de caucho.
  3. Retire la tapa y coloque el vial vacío en un balance analítico. TARE la masa del vial vacío para que la balanza Lea la masa cero.
  4. Agregue el polvo de rSSp liofilizado deseado al vial vacío para cada material específico.
    1. Utilizar estas masas específicas de cada tipo de proteína para cada material, al preparar un 2 mL de solución: hidrogeles/esponjas/liogeles, 60 mg de MaSp1 y 60 mg de MaSp2; Films/recubrimientos, 80 mg de MaSp1 y 20 mg de MaSp2; adhesivos, 120 mg de MaSp1 y 120 mg de MaSp2; fibras, 200 mg de MaSp1 y 50 mg de MaSp2.
  5. Añadir la cantidad deseada de agua ultrapura, al menos 2 mL, al vial que ya contiene los polvos de rSSp ponderados.
    Nota: se recomienda un volumen mínimo de 2 mL para todos los procedimientos de solvación.
  6. Selle la tapa del vial y vórtice rápidamente el contenido para crear una mezcla de rSSp dispersa y homogénea que ahora está lista para el procedimiento de solvación. Se pueden emplear enfoques adicionales de homogeneización como la mezcla de sonicación o impulsor, o, además, la mezcla de vórtice.

2. solvatación de seda de araña recombinante

PRECAUCIÓN: durante el procedimiento de solvación se generan elevadas presiones y calores. Para este proceso se requieren equipos de protección personal adecuados, especialmente gafas, mangas largas y guantes resistentes al calor.

  1. Realizar una comprobación final del vial, o recipiente, tapón para asegurarse de que se ha apretado firmemente y con seguridad. A continuación, transfiera la mezcla de rSSp suspendida a un horno microondas convencional.
    Nota: las unidades de microondas dentro del rango de potencia de 700 a 1.500 vatios, que poseen capacidades de cámara interna más pequeñas, y plataformas giratorias se recomiendan para proporcionar mejores condiciones de solvación.
  2. Iniciar el funcionamiento del microondas con 5 s ráfagas a plena potencia. Después de cada ráfaga, abrir brevemente la puerta y mezclar/girar cuidadosamente el vial para evitar la sedimentación y mantener la mezcla suspendida.
  3. Repetir este proceso de microondas hasta que la mezcla y/o solución haya obtenido una temperatura de al menos 130 ° c, cuando se mida con un termómetro infrarrojo directamente contra la solución que contiene porciones del vial. Repita este proceso hasta que todas las partículas sólidas se hayan disuelto por completo y ya no sean visibles.
    Nota: se sugiere permitir que el vial y la solución se enfríen ocasionalmente, especialmente si la formulación tiene una alta concentración de rSSp presente. Las temperaturas superiores a 200 ° c aumentan el riesgo de fallo del sello vial. También se debe prestar especial atención para evitar que la mezcla/solución sobrecalentada toque el sello, lo que también resultará en un fallo de contención del vial.
  4. Después de resolver con éxito la mezcla de rSSp en una solución, permita que la temperatura de la solución y el tapón del vial se enfríe por debajo de 100 ° c (punto de ebullición) antes de abrir.

3. los hidrogeles

  1. Prepare un hidrogel de la solución después de sacarlo del microondas y dejar que se enfríe y se ajuste. Convierte el hidrogel en geometrías específicas antes de que se enfríe completamente.
    Nota: diferentes rSSps requerirá una cantidad variada de veces para la transición a un hidrogel. Por ejemplo, las secuencias de tipo MaSp2 tienden a formar hidrogeles más rápidamente en comparación con secuencias de tipo MaSp1. Las concentraciones de proteínas, la salinidad y el pH también afectan directamente a la tasa de transición a un hidrogel.

4. las esponjas

  1. Prepare una esponjas de rssp primero permitiendo que la solución primaria solvatadas forme un hidrogel.
  2. Coloque el hidrogel en un baño de agua, coloque este baño en el congelador a-20 ° c y espere hasta que el baño se congele por completo.
  3. Complete el proceso de formación de esponja quitando el hidrogel congelado y el baño de agua del congelador y descongelando a 25 ° c. La esponja resultante ahora se puede quitar del agua descongelada.

5. lyogel

  1. Prepare un lyogel rSSp congelando directamente un hidrogel formado, ya sea con o sin baño de agua, y transfiriendo la muestra de hidrogel congelado a un liofilizador (secador de congelación).
  2. Retire el material de gel liofilizado final del recipiente en el que se produjo la sublimación de humedad.

6. las películas y revestimientos

  1. Utilice uno de los tres métodos siguientes: fundición de soluciones, pulverización de soluciones o recubrimiento por inmersión para producir películas o recubrimientos de rSSp.
    1. Convertir la solución de seda solubilizada en/sobre las formas PDMS de la forma deseada.
    2. Vierta y extienda 200 μL de la solución de película y deje secar esto antes de pelarlos del sustrato de PDMS para su análisis o tratamiento.
    3. Después de permitir que se sequen, retire las películas formadas para las pruebas mecánicas o post-tratamiento de las películas para mejorar las propiedades mecánicas.
  2. Para preparar un recubrimiento o una película que no se pueda extraer del sustrato, utilice el recubrimiento por pulverización o por inmersión para producir una capa de película delgada.
    Nota: para pulverizar el abrigo, este protocolo ha encontrado el éxito con un pulverizador de pintura modelo maestro aerógrafo.
    1. Forme un recubrimiento de inmersión simplemente sumergiendo el sustrato de elección en el rSSp solubilizado y repita después del secado para lograr el espesor deseado.
    2. Realice una capa de pulverización inicial antes de aplicar una capa de inmersión para aumentar la consistencia y la efectividad del recubrimiento final.

7. adhesivos

Nota: la formación de adhesivos se logra a través de uno de los siguientes métodos.

  1. Agregue directamente el rSSp solubilizado sobre un sustrato y luego aplique un segundo sustrato sobre la parte superior de la solución. Sujete firmemente las piezas juntas y seque las muestras en un horno con una temperatura mínima de 25 ° c durante al menos 16 h.
  2. Alternativamente, pulverizar las dos superficies de sustrato con una capa de pulverización y luego sujetar los sustratos juntos.
  3. La aplicación del rSSp a través del método dip de recubrimiento de los sustratos y pegado de los sustratos también se puede utilizar para preparar y adhesivo.

8. fibras Wet-hiladas

  1. Cargue la solución de droga solubilizada en una jeringa concéntrica con punta Luer-Lok a través de una aguja deslizante de 19 G. Expulse las burbujas de aire y deje que la droga se siente en el extremo Luer-Lok de la jeringa.
  2. Inserte al menos 25 mm de tubo PEEK, diámetro interno 0,01 pulgadas, en los accesorios de una sola pieza de la tubería PEEK para el dedo apretado para 1/16 pulgadas OD y 10/32 cono. Conecte este accesorio a un tubo PEEK al adaptador hembra Luer-Lok.
    1. Sustituya la aguja calibre 19 por esta configurada en la jeringa cargada.
  3. Llene un baño de vidrio alto y claro con un 99% de isopropanol puro para usar en el baño de coagulación.
    1. Llene los baños elásticos, situados debajo de los godets de estiramiento. Estos tendrán 80:20 isopropanol: agua destilada en el primer baño elástico, y 20:80 isopropanol: agua destilada en el segundo baño elástico.
  4. Ajuste el sistema de estiramiento godet de tal manera que el primer godet después del baño de coagulación y el primer godet en el primer baño elástico giran a la misma velocidad.
    1. Inicie el primer tramo ajustando las velocidades de la godet final en el baño elástico 1, el godet superior medio, y el primer godet en el baño elástico 2 a la misma velocidad. Esta velocidad será 2x tan rápido como la velocidad inicial de eliminación de fibra.
    2. Inicie el segundo tramo ajustando las velocidades de la godet final en el baño elástico 2, el último godet superior y el bobinador a la misma velocidad. Esta velocidad será 2x tan rápido como la velocidad utilizada para el primer tramo o 4x la velocidad inicial de eliminación de fibras.
    3. Coloque los guantes de nitrilo en el exterior de los godets intermedios para evitar que la fibra resbale.
  5. Empiece a extruir lentamente la solución en el baño de coagulación. En un sistema automatizado, establezca la velocidad de extrusión para que coincida con un retiro de 10 mm/s.
    1. Permita que la extrusión de fibra se convierta en uniforme antes de sacar las fibras del baño usando un gancho o fórceps finos de metal. Verifique la eliminación de la fibra del baño creado un lazo entre la punta de la tubería PEEK y la ruta de la fibra dejando el baño el baño.
  6. Guiar la fibra recuperada a través de la serie de godets tal que la fibra se sumerge en los baños elásticos, pero secar en el aire entre los baños elásticos y antes de entrar en un carrete. Este secado se logra mediante los godetos intermedios colocados más altos.
    Nota: la tasa de eliminación de fibra y/o la tasa de extrusión tendrá que ser ajustada en base a la concentración de proteína, aditivos, y el tipo de proteína para permitir un amplio tiempo de coagulación sin unir las fibras en la parte inferior del baño de coagulación.
  7. Conecte la fibra completamente estirada al carrete en el mecanismo de bobinador utilizando cinta adhesiva.

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Representative Results

A partir del método descrito de solubilización de rSSp, se puede lograr una variedad de formas de material como se ve en la figura 1. El método de solubilización es aplicar calor y presión, generados por un microondas convencional, a una suspensión de rSSp y agua. Cuando se alcanzan temperaturas y presiones críticas, la proteína se solubilizará. A partir de esta solución de rSSp solubilizada, se presentan las condiciones requeridas para siete formas materiales: hidrogeles, lyogels, esponja, adhesivos, revestimientos, películas y fibras. Los hidrogeles se preparan al permitir que el rSSp solubilizado se enfríe y se autoasocie naturalmente. Un lyogel se prepara por liofilización del hidrogel. El material de la esponja se forma congelando el hidrogel mientras se sumerge en agua. Las películas se pueden preparar lanzando el rSSp solubilizado sobre superficies PDMS (y otras superficies susceptibles) y secadas. El PDMS permite que la película se elimine fácilmente para tratamientos posteriores o análisis. Los recubrimientos y adhesivos se generan utilizando métodos de pulverización o DIP o combinaciones de spray y DIP. Las fibras requieren el procesamiento más extenso mediante la extrusión en un baño de coagulación y luego el estiramiento en serie de la fibra cruda en los baños elásticos post-spin. Las fibras se pueden generar por extrusión en un baño de coagulación solo. Sin embargo, la mejor capacidad mecánica en las fibras requiere estiramiento en los baños de estiramiento post-spin3,7,8,9.

Figure 1
Figura 1: solvación acuosa y materiales de rSSp. Imágenes representativas de los materiales que han sido formulados utilizando este método de solubilización de calor y presión con rssp solvatadas en agua. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Después de que las proteínas de seda de araña recombinante son purificadas tienen que ser preparadas en una solución que puede ser utilizada para la formación del material. Mezclando la proteína de seda de araña liofilizada con agua y exponiendo esta mezcla a la irradiación de microondas, para generar calor y presión, es posible preparar una solución de rSSp. Una amplia variedad de formas de material se puede producir a partir de este método simple y eficiente de la solubilización de rSSp. Cada material tiene que ser preparado y procesado de forma única para lograr el resultado y las propiedades deseadas. Con alteraciones leves en las formulaciones iniciales, condiciones de formación, y/o parámetros de procesamiento, cada material se puede ajustar fácilmente utilizando este método. Hay más formas de las que se presentan aquí y a través de otras investigaciones de otros en el campo, estos materiales seguirán evolucionando para explorar nuevas formas de materiales utilizando esta técnica.

Siempre que la solución esté compuesta principalmente de agua y proteínas (los aditivos pueden ser utilizados para retrasar la gelación y mejorar la estabilidad de las soluciones) la posibilidad de funcionalización con componentes biológicamente activos se mejora en gran medida en comparación con las soluciones rSSp basadas en HFIP. Una variedad de componentes, pero no muestreos exhaustivos se han incluido en los imbéciles y por lo tanto formas materiales incluyendo: antibióticos, antimicoticos, heparina, nanopartículas de plata, e integrinas para la adhesión de la célula. Además de los aditivos, múltiples proteínas de la seda de la araña recombinante de diversos tamaños, secuencias, natures, y fuentes se han solvatadas con éxito con este método y se utilizan en la formación de los materiales descritos en este protocolo.

Ampliando aún más la utilidad de este método de solubilización para no sólo el rssp, pero todas las proteínas solvatadas en este método, es que las soluciones son estériles, siempre que la temperatura y las presiones dentro del vial o de la cámara sean lo suficientemente altas. Estas soluciones se pueden y se han llevado directamente al cultivo celular sin contaminar las culturas.

Si estos materiales se van a tomar directamente en sistemas in vivo, deben abordarse los niveles de endotoxina. Un método de autoclave triple que destruye las endotoxinas para que sus niveles estén en, o por debajo, el 0,25 EU/mL recomendado ha sido reportado recientemente10. Mientras que el autoclave es útil para destruir la endotoxina, sus presiones y temperaturas generalmente no alcanzan la temperatura crítica o la presión requerida para resolver completamente todas las muestras de rSSp intentadas hasta la fecha6. Esto requiere una microondulación o un reactor de temperatura/presión necesario para completar la solución.

De manera única, la eliminación de la endotoxina y la solvación del material mediante calor y presión no degradan la proteína ni la capacidad mecánica de la forma de material resultante4,5,6,7. Se aprecia que es probable que haya un punto de inflexión para obtener demasiada presión y/o temperatura y demasiados ciclos de calor y presión que resulte en la capacidad mecánica degradada y/o destrucción de la proteína. Este punto de inflexión probablemente variará para el tipo de rssp solvatadas y, en cierto grado, la longitud de la rssp utilizado. Sin embargo, con este método básico de la solvación, varios experimentos de solvatación de exploración se pueden realizar en el corto plazo para delinar la temperatura de la solvación apropiada y las presiones requeridas para las proteínas específicas.

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Disclosures

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores le gustaría agradecer con gratitud la financiación de la iniciativa de investigación científica y tecnológica de Utah (USTAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

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