大、小动物狂犬病的解剖技术

Neuroscience

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Summary

该协议的目的是在小型和大型动物中展示安全尸体解剖技术,以获得令人满意的组织样本进行狂犬病检测。

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Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals. J. Vis. Exp. (149), e59574, doi:10.3791/59574 (2019).

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Abstract

纽约州卫生局(NYSDOH)狂犬病实验室每年接收6,000至9,000份样本,并在整个州进行狂犬病检测,纽约市除外。狂犬病实验室对各种动物进行尸检,从蝙蝠到野猪,不一而分。这些标本大多数是有神经体征的动物,然而,只有不到10%的狂犬病检测呈阳性;暗示创伤、病变或其他传染性病原体是这些症状的原因。由于未诊断的传染性病原体有气溶胶化的风险,狂犬病实验室不使用电动工具或锯子。对于头骨无法用剪刀穿透的动物,将采用三种尸检技术。实验室已实施这些技术,以减少对传染性病原体的潜在接触,消除对标本的不必要操作,并缩短加工时间。与另一种技术相反的首选技术的优点取决于经过培训的个人处理试样。

Introduction

在狂犬病实验室的尸检地板上工作本身是危险的。有时,标本到达与嵌入豪猪毛刺,异物,包括箭头/子弹/子弹或暴露的骨头碎片,可能会穿透保护性运输包装。包装不当可能导致泄漏,危及拆包样品的个人。除了身体伤害外,尸检技术人员还冒着接触中枢神经系统中未知的人畜共体感染剂和标本体液的风险。此外,标本携带的寄生虫可能传播其他人畜共患疾病,因为跳蚤和虱子通常出现在提交的动物身上。根据地理位置和涉及的物种,所感染的疾病各不相同。如东方马脑炎病毒(EEEV)或西尼罗河病毒(WNV),由虱子传播的疾病,包括莱姆病或黄原虫病,引起Q热或结核病的细菌,以及传染性病毒,列举少数可能的危险1,2,3.

这些方法的目的是使用仪器,尽量减少气溶胶的可能性,不像电动工具或锯4,5,证明安全和有效的尸检技术。通常,狂犬病实验室中小动物的尸检需要切除颅骨肌肉,并用锤子和凿子打开6号甲鱼的胆背部分。去除这个区域的脑后暴露,包括整个小脑和颅脑干。可对颅骨的腹腔部分进行改性尸检技术,避免颅骨大颅肌肉和较厚的区域。然而,这些经过修饰的尸检技术只有在标本没有颈椎时才可能。

同样,大型动物的脑组织可以通过分离颅骨肌肉和打开头骨颅骨背部分来去除。由于大型动物的头骨通常较厚,因此需要付出相当大的努力来暴露小脑和脑干。为了避免穿透头骨,大型动物的头部被定位,因此头骨的通风口-双孔部分面向技师。使用改良的仪器,小脑和脑干通过前兆根去除。这与TSE欧盟转运海绵状脑病(TSE)调查参考实验室推荐的样品采集方法类似。颅椎应该事先切除,以便进入前胸。

这些技术的应用有利于在狂犬病实验室中经过适当培训的技术人员。由于狂犬病实验室接收了从幼蝙蝠到成年马9的各种样本,技术人员根据个人情况有多种选择方法。为大型动物演示的方法也适合在野外进行尸检的兽医,因为运送整个大型动物头进行狂犬病检测既繁琐又昂贵。实施这些技术将降低气溶胶生产的潜力,减少试样处理并节省加工时间,从而提高安全性。然而,由于该实验室与为狂犬病检测设立的实验室没有相同的优势,因此对这些程序所做的任何修改都必须注重安全,特别是个人防护设备的使用。

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Protocol

所有描述的方法都通过了沃兹沃斯中心机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

1. 准备

  1. 唐PPE,至少护眼(眼镜或面罩),外科或N-95口罩,和非乳胶手套。
  2. 准备工作区,理想情况下是生物安全柜 (BSC),带有一次性工作表面覆盖物(例如,牛皮纸或吸水垫)和清洁的尸检仪器(图 1)。
  3. 将标本放在工作面上,并使用仪器操作它来评估样品的状况,包括分解证据、颅骨损坏、潜在危险(例如,豪猪毛刺、手术刀刀片)和斩首质量。

2. 文室法

注:当试样在下颌线被正确斩首时,前颌和腹膜将暴露。腹腔方法对于检索小脑和脑干来说不太复杂。

  1. 将试样放在腹侧朝上,鼻子朝向 BSC 背面倾斜。
  2. 右手拿着矫形锤/锤子(如果右手),同时左手拿着议员凿子。
  3. 将凿子定位在 45° 角,凿子的角点在时骨的右侧和骨骼的右侧之间定向,使"V"开口。
  4. 用锤子敲打凿子的顶部,直到两根骨头分开。使切口与基形骨骼相邻。
  5. 在时态骨骼/骨骼的左侧重复重复 (图 2A)。
  6. 用凿子向下弯曲头骨的"V"区域。暴露大脑的整个红脑区域(小脑和脑干)(图2B)。
  7. 用剪刀和小脑勺子挖出脑干和小脑。如果脑干和小脑没有在一块中出来,从头骨中取出任何剩余的碎片。

3. 多尔萨尔法

注:如果标本的斩首不良(前脑大发量不可见),并且颈部在尸体解剖期间不易切除,或者如果怀疑小脑受损,则应使用背法。

  1. 将试样倾斜,鼻子朝 BSC 背面倾斜。
  2. 使用肿瘤角骨,抓住左时态肌肉与牙齿的十纳库拉和锁定挤压手柄。
  3. 用锋利的雕刻刀将时间肌肉切割到骨头上。
  4. 用天角和刀(不是手)旋转试样180°,并在相反的时间肌肉上重复这个过程。露出头骨
  5. 在颅骨和腹骨的关头,将凿子与颅骨中心的凿子角点以 45° 角放置。
  6. 用锤子敲击凿子的顶部,直到在头骨的上半部分在头骨上半部分做一个水平开口。
  7. 旋转试样 180°,并在另一侧重复该过程。
  8. 将凿子点插入切口 1 的末端(图3A)和水平开口的 90° 处。用锤子敲击,直到开口达到骨骼(取决于试样的大小约为 10 厘米)。
  9. 滚动试样,并在切2结束时在另一侧重复。
    注:标本背和鼻子位于BSC背面,头骨的开口类似于倒置的"U"。
  10. 将牙角的牙齿插入"U"底部的头骨中,然后撬向自己。露出脑和小脑的胆端 (图 3B)。
  11. 使用剪刀作为勺子,从腔内撬出整个小脑。
  12. 使用组织钳子来梳理出脑干从前人。

4. 大型动物法

  1. 放置试样,使头骨的背部分与头骨的牛骨部分接触,并朝向技师。
  2. 尽可能将改良的阶梯刀插入脊髓和脊髓脑膜之间的前胸刀中。
  3. 分数围绕脊髓分离小脑和脑茎从脊柱脑膜。刀插入前臂臂后,轻轻地将刀角沿头骨沿尽可能多。
  4. 将化学铲子或细长处理的勺子插入神经组织和脊柱脑膜之间的空间。
  5. 围绕脊髓和小脑的探针,以确保与脊髓脑膜的连接被切断。
  6. 用钳子握住脑干。用另一只手,将勺子动起来,然后倒地,把小脑铲起来。同时用钳子拉回脑干,用勺子挖出小脑。
    注意:可能需要不止一次尝试才能恢复足够的小脑进行狂犬病检测。

5. 尸检后

  1. 处理所有一次性材料(手套、垫子、工作区覆盖物)和未使用组织,处理生物危险废物。
  2. 用可用的方法清洁和消毒所有仪器(例如,工业洗碗机、高压灭菌器、化学消毒剂、煮沸)。
  3. 用 20% 漂白剂和/或 70% 乙醇清洁和消毒所有工作表面。

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Representative Results

2019年1月31日至2019年2月28日期间提交的所有头骨陆地样本都有关于颈部存在和收集尸检方法的信息。在此期间,170头被尸检,有18个物种。52%(89/170)被正确斩首。其余的至少有一个椎骨连接,包括三个全身标本。腹腔法使用75%(128/170)的时间,其中,颈部存在49。用颈部提交的标本将在尸体解剖期间取出,以便尽可能采用腹腔方法。提交了三只大型动物(牛、鹿、猪),并在两种情况下使用了大型动物协议。大型动物协议没有用于猪,因为额外的脑组织样本需要额外的测试。一只松鼠被提交与粉碎的头骨,简单地切断皮肤暴露的脑组织,因此没有上述方法被使用(表1)。

在新鲜完整提交时,所有三种方法都将使用所需的组织进行可靠的狂犬病诊断测试结果。有时,小脑和脑干不能完整地去除,虽然在从后脑中取出所有组织后,这些组织可以相应地识别和处理。

这三种有价值的方法无法弥补在实验室收到之前造成的样品质量差。无论采集样本的效率如何,创伤、分解和不良斩首方法都会影响结果。

Figure 1
图1:狂犬病尸检中使用的仪器。弯曲的锋利的梅奥剪刀,光滑的组织敷料钳,无牙齿,议员骨科骨凿,矫形锤,锁定肿瘤,餐厅质量雕刻刀,改性高跟鞋刀,化学勺子,和锐化汤匙。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:尸检的通风方法。(A) 切割位置:将凿子的点放在箭头底部,朝绿色箭头方向切割,然后按照黄色箭头重复,在尖沙石周围形成"V"。撬"V"下来暴露脑干和小脑。(B) 脑干(绿色)和小脑(蓝色)在暴露时使用腹腔造尸法。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:尸体解剖的背法。(A) 切割位置:将凿子的点放在箭头底部,按箭头方向切割的顺序,并注明形成"U"。撬"U"向下露出小脑与脑干下面的。(B) 使用背法暴露时,小脑(圆形)。脑干位于正下方,直到小脑被移除才可见。请点击此处查看此图的较大版本。

物种 椎骨附着 方法使用V_通风,D_背,LA_大动物 评论
2
32
D 3 2个足够小,可以用剪刀打开头骨,1个有正在接受调查的头骨顶部
是的 11
是的 D 8
洛杉矶 1
1
是的 2
是的 D 3
鹿 洛杉矶 1
19
D 3
是的 2 1是小狗
是的 D 18
雪 貂 1
费舍尔 1
飞松鼠 是的 D 1 全身
灰狐 2
灰狐 是的 4
是的 1
豪猪 1
浣 熊 16
浣 熊 D 1 冷冻
浣 熊 是的 26
红狐 2
臭 鼬 1
臭 鼬 是的 3
松鼠 1
松鼠 是的 D 1 全身,粉碎的头骨,用剪刀切掉皮肤到暴露的脑腔
亚斯勒 D 1
土拨鼠 是的 D 1 全身
170
总计细目
与颈部 81
无颈部 89
通风法 128
背法 39
大型动物法 2
其他方法 1
颈部腹腔法 49

表1:2019年1月31日至2019年2月28日,纽约州卫生局狂犬病实验室提交的需要从头骨中取出组织标本的细目。

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Discussion

提交狂犬病尸检的标本通常具有与神经系统疾病相容的临床体征史。临床疾病的存在可能与各种疾病有关,包括人畜共患疾病,增加实验室工作人员获得感染的风险。为了减少这些风险,已经实施了减少标本处理和操作的技术。

所展示的方法代表一个尸检事件,仅从单个动物中去除所需的组织。更常见的是,多个样品在一个班次中处理,需要小心,以确保样品之间没有交叉污染。清洁的工作台面(一次性牛皮纸或垫子)、一套新的清洁、消毒仪器和手套更换是强制性的。一旦获得组织,可以遵循单个实验室的处理方案,包括为分子方法制作用于显微镜或RNA提取的幻灯片。

在实验室或领域成功实施这些技术有几个必要的先决条件。事先接种狂犬病疫苗和PPE对于任何对狂犬病疑似动物进行尸检的人至关重要。在狂犬病实验室工作的个人应每六个月进行一次血清测试,以确保有足够水平的抗狂犬病抗体。重要的是要记住,其他人畜共患疾病,如EEEV,WNV和牛海绵状脑病(BSE),存在类似的症状,狂犬病,也可能发生在狂犬病疑似动物11,12。

适当维护良好的仪器对于安全进行尸检至关重要。一旦标本从生物危害袋中取出,它只能用仪器而不是手操作,以减少发生事故的可能性。在进行小型动物尸体解剖之前,技师应评估标本的状况,以确定是否可能通过头骨底部进行首选的腹腔处理。对于大型动物来说,全面评估标本的状况可能过于繁琐,因为额外的椎骨可能需要在通过前体取回组织之前被移除。

所有尸检技术都存在局限性,包括标本状况、组织质量和剩余颈椎的数量。颈椎不会影响狂犬病分析结果,但严重分解组织可能导致结果不理想。狂犬病诊断中更敏感的分子方法可能允许在某些无法通过直接荧光抗体检测(DFA)测试的样品中成功检测,包括严重分解的标本13。然而,任何灵敏度都无法取代对适当组织取样的需要。

狂犬病实验室的一个常见问题是,当在现场进行大型动物尸体解剖时,接受不当或不足的脑组织进行检测。如果没有所需的组织,如果无法重新提交其他组织,我们的狂犬病实验室将对可用的组织进行测试,但无法验证样本呈阴性,相反,检测效果不理想。还有其他已公布的现场组织收集方法,如稻草法或复古轨道路线14。这两种方法收集脑组织,而无需打开头骨。稻草或一次性移液器插入或插入前脑大肠或一个洞,在眼窝创建,并通过大脑推,基本上采取核心样本,不一定采样脑干的全部横截面。由于这些现场方法收集样品的方式不在我们的实验室中被认为是令人满意的,因此本文没有演示或探索这些过程。

在现场,大型动物尸体解剖对于没有受过狂犬病检测正确组织训练的个人来说可能是一个挑战。相反,整个动物的头部,可以重达20-45公斤,提交为现场兽医和狂犬病实验室技术人员创造繁琐的运输。经常要求接受大型动物尸体解剖技术的培训。本手稿的目的是将此信息分发给那些工作可以从这些技术中受益的个人和团体。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢纽约州卫生局沃兹沃斯中心对该项目的支持。我们还要感谢卫生部沃兹沃斯中心以及纽约州阿尔塔蒙特的LL牧场的艾米·威尔西和弗兰克·布莱斯德尔的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemistry spoon Any
Curved, sharp-blunt mayo scissors Sklar 14-2055 Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt
Large sharp restaurant-quality carving knife Dexter P94848 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Locking tumor-tenacula Diamond Scientific and Surgicals N/A Czerny Tenaculum Forcep
Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) Dexter P94848 Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Orthopedic mallet-hammer Mortech N/A Postmortem hammer with hook
Sharp councilman orthopedic bone chisel Shandon 60-5 Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in
Sharpened tablespoon or other long handled spoon Any
Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth Shandon 63-03 Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps
Powder-free non-latex gloves Any
Safety glasses, goggles, or faceshield Any
Surgery or N-95 mask Any
Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc Any

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References

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