大小動物における狂犬病壊死技術

Neuroscience

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Summary

このプロトコルの目的は、狂犬病検査のための満足のいく組織サンプルを得るために、小動物および大型動物における安全な壊死技術を実証することである。

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Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals. J. Vis. Exp. (149), e59574, doi:10.3791/59574 (2019).

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Abstract

ニューヨーク州保健省(NYSDOH)狂犬病研究所は、毎年6,000~9,000検体を受け取り、ニューヨーク市を除き、州全体で狂犬病検査を行っています。狂犬病の実験室は、コウモリからボビッドに至るまで、様々な動物を壊作します。これらの標本のほとんどは神経学的徴候を示す動物ですが、狂犬病の陽性を実際にテストする10%未満です。これらの症状の原因として外傷、病変または他の感染因子を暗示する。診断されていない感染剤をエアロゾル化するリスクがあるため、狂犬病研究所は電動工具や鋸を使用していません。頭蓋骨がはさみで不可解な動物のために3つの壊死の技術が提示されます。実験室は、感染剤への潜在的な暴露を減らし、標本の不必要な操作を排除し、処理時間を短縮するためにこれらの技術を実装しています。他とは対照的に好ましい技術の利点は、試料を処理する訓練を受けた個々の処理に従う。

Introduction

狂犬病実験室の壊死床に取り組むことは本質的に危険です。時には、標本は埋め込まれたポークパインクイル、矢印/弾丸/ペレットまたは保護出荷ラップを貫通する可能性のある露出した骨の破片を含む異物で到着します。不適切な包装は漏出をもたらし、標本を解凍する個人を危険にさらす可能性があります。身体的損傷に加えて、壊死した技術者は、CNSおよび標本の体液から未知の動物性感染因子への暴露を危険にさらす。さらに、検体によって運ばれるエトパラサイトは、ノミやダニが提出された動物に一般的に見られるように、他の人獣病を伝染させる可能性があります。地理的な場所や種に応じて、暴露された疾患はさまざまです。東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)や西ナイルウイルス(WNV)などのアルボウイルス、ライム病や結核を含むダニ媒介性疾患、Q発熱や結核を引き起こす細菌、感染性プリオンなど、少数の危険が考えられる1,2,3.

これらの方法の目的は、電動工具や鋸4、5とは異なり、エアロゾル化の可能性を最小限に抑える器具を使用して、安全で効率的な壊死技術を実証することです。一般的に、狂犬病実験室の小動物の壊死は、頭蓋の筋肉を切り取り、ハンマーとノミを使用してカルバリウム6の後部を開く必要があります。カルバリウムのこの領域を削除すると、小脳全体と頭蓋脳幹を含む後頭脳が露出します。改変された壊死技術は、頭蓋骨の大きな頭蓋筋および頭蓋骨の厚い領域を避け、頭蓋骨の腹部部で行われる。しかし、これらの改変された壊死技術は、検体が頸椎を持たない場合にのみ可能である。

同様に、大型動物の脳組織は、頭蓋筋を分離し、頭蓋骨7の口腔後部を開くことによって除去することができる。大きな動物の頭蓋骨は一般的に厚いので、小脳と脳幹を露出させるには相当な努力が必要です。頭蓋骨の貫通を避けるために、大きな動物の頭部は、頭蓋骨のベントロカドーマル部分が技術者に直面するように配置されます。修飾された器具を使用して、小脳と脳幹は、前頭マグナムを介して除去されます。これは、透過性海綿状脳症(TSE)調査8のTSE欧州連合リファレンスラボが推奨するサンプル取得方法に類似しています。頭蓋椎は、前頭骨マグナムへのアクセスを提供するために、事前に除去する必要があります。

これらの技術の適用は狂犬病の実験室で適切に訓練された技術者に有益である。狂犬病の実験室は、若年性コウモリから成人ドラフト馬9まで、様々なサイズのサンプルを受け取るように、技術者は、個々の状況に基づいてから選択するいくつかの方法を持っています。大型動物に対して実証された方法は、狂犬病検査のために大型動物の頭部全体を出荷することは面倒で高価であるため、現場で壊死を行う獣医師にも適しています。これらの技術のいずれかを実装すると、エアロゾル生産の可能性を減少させることによって安全性を向上させ、試料の取り扱いを減らし、処理時間を節約します。しかし、狂犬病検査専用の実験室と同じ利点を持たないため、これらの手順に加え、特に個人用保護具(PPE)の使用に焦点を当てることは不可欠です。

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Protocol

記載されたすべての方法は、ワズワースセンター機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 準備

  1. ドンPPEは、少なくとも目の保護(眼鏡またはフェイスシールド)、外科またはN-95マスク、および非ラテックス手袋。
  2. 作業領域、理想的にはバイオセーフティキャビネット(BSC)を、使い捨て作業面カバー(例えば、クラフト紙または吸収パッド)とクリーンな壊死器具で準備する(図1)。
  3. 作業面に試料を配置し、分解の証拠、頭蓋骨の損傷、潜在的な危険(例えば、ポークパインクイル、メスブレード)、および切断の品質を含むサンプルの状態を評価するためにそれを操作するために器械を使用します。

2. 通気法

注:試料が顎ラインで適切に切断されると、前頭部マグナムと後頭部のコンディクルが露出します。腹部法は、小脳および脳幹を取り出すための複雑さが少ない。

  1. 腹部側を上にして標本を位置付けし、鼻をBSCの背面に向けて遠回りに配置します。
  2. 整形外科用ハンマー/マレットを右手に持ち(右利きの場合)、同時に議員のチゼルを左手に持つ。
  3. 時骨の右側と後頭部の骨の間に向かうノミの角点を持つ45°の角度でノミを配置し、「V」の開口部を作る。
  4. 2つの骨が別れるまでハンマーでノミの上部を打ちます。ベーシスフェノイド骨に隣接してカットを行います。
  5. 側頭骨/後頭骨の左側で繰り返します(図2A)。
  6. 頭蓋骨の「V」領域をノミで下方に曲げる。脳のロンブランセファロン領域全体(小脳および脳幹)を露出させる(図2B)。
  7. はさみと鉗子で脳幹と小脳をすくい取ります。脳幹と小脳が1個で出てこなかった場合は、頭蓋骨から残りの部分を取り除きます。

3. ドーサル法

注:検体の切断が不十分で、壊死中に首を容易に取り除くことができない場合や、小脳への損傷が疑われる場合は、背中の方法を利用する必要があります。

  1. 試料をBSCの背面に向けて鼻で背面に配置します。
  2. 腫瘍テナキュラを使用して、歯手の歯で左側頭部筋をつかみ、ハンドルを絞ってロックします。
  3. 鋭い彫刻ナイフで骨に時間的な筋肉をカットします。
  4. テナキュラとナイフ(手ではない)で標本180°を回転させ、反対側の側筋でプロセスを繰り返します。頭蓋骨を露出させる。
  5. 頭蓋骨と腹膜骨の接合部に、頭蓋骨の中心にあるノミの角点を持つ45°の角度でノミを配置します。
  6. 頭頂部骨の頭蓋骨の上半分に水平開口部が作られるまで、ハンマーでノミの上部を打ちます。
  7. 試料を180°回転させ、反対側で繰り返します。
  8. 切り取り値 1 (図 3A)の端と水平方向の開口部の 90° にノミの点を挿入します。開口部が後頭骨に達するまでハンマーで打つ(試料の大きさに応じて約10cm)。
  9. 試料を転がし、カット2の終わりに反対側で繰り返します。
    注:BSCの背面に向かって標本背面と鼻を配置すると、頭蓋骨の開口部は逆さまの「U」に似ています。
  10. 「U」の底にある頭蓋骨にテナキュラの歯を挿入し、自分自身に向かって突き出します。大脳と小脳の縁方の端を露出させる(図3B)。
  11. スクープとしてはさみを使用し、空洞内から小脳全体を取り除く。
  12. 組織鉗子を使用して、前頭から脳の幹をいじめる。

4. 大型動物法

  1. 頭蓋骨の後部が頭蓋骨の側方の部分と、技術者に面した頭蓋骨の側部と壊死面に接触できるように標本を配置します。
  2. 変更されたスティレットナイフを、脊髄と脊髄髄膜の間の前部マグナムに可能な限り挿入します。
  3. 脊髄の周りのスコアは、小脳と脳の茎を脊髄髄から分離します。ナイフを前頭マグナムを通して挿入した後、ナイフをそっと角を向けて頭蓋骨に沿ってできるだけ後に続きます。
  4. 神経組織と脊髄髄膜の間の空間に、化学のへらまたは薄い、長い取り扱いスプーンを挿入します。
  5. 脊髄および小脳の周りの調査は脊髄髄膜との関係が切断されたことを確認する。
  6. 鉗子で脳幹を保持します。一方、スプーンを大げさに進め、その後、小脳をすくい上げます。同時に鉗子で脳幹を引き戻し、スプーンを使用して小脳をすくい取ります。
    注:狂犬病検査のために十分な小脳を回復するために複数の試みが必要な場合があります。

5. ポスト壊死

  1. すべての使い捨て材料(手袋、パッド、作業領域カバー)および未使用の組織を生体有害廃棄物に廃棄します。
  2. 利用可能な方法(例えば、工業用食器洗い機、オートクレーブ、化学消毒剤、沸騰)ですべての機器をきれいにし、消毒します。
  3. 20%の漂白剤および/または70%のエタノールが付いているすべての仕事の表面をきれいにし、消毒する。

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Representative Results

2019年1月31日から2019年2月28日の間に頭蓋骨で提出されたすべての地上サンプルには、首の存在と壊死の方法に関する情報が含まれていました。その間、170頭が18種を表して壊死させた。52%(89/170)が適切に切断された。残りの骨は、3つの全身標本を含む少なくとも1つの椎骨を取り付けていた。腹部法は、当時の75%(128/170)を用いたもので、そのうち、首は49に存在していた。首で提出された標本は、可能な限り腹部法を可能にするために壊死中に除去されます。3匹の大型動物(牛、鹿、豚)が提出され、2例で大型動物プロトコルが使用された。余分な脳組織サンプルが追加のテストのために必要とされたので、大規模な動物プロトコルは豚に使用されませんでした。リスは砕いた頭蓋骨で提出され、単に皮膚露出した脳組織を切り取っただけで、上記の方法はいずれも使用されなかった(表1)。

新鮮な無傷の提出では、すべての3つの方法は、信頼性の高い狂犬病診断試験結果のために必要な組織で行われます。時折、小脳と脳幹をそのまま取り除くことはできないが、後頭脳からすべての組織を取り除いた後、これらの組織を同定し、それに応じて処理することができる。

これらの3つの貴重な方法は、実験室で受け取る前に引き起こされた不十分な試料の品質を補うことができません。外傷、分解および貧弱な切断方法は、サンプルの収集の効率にかかわらず、結果に影響を与える可能性があります。

Figure 1
図1:狂犬病壊死に使用される器具。湾曲した鋭利な鈍いマヨネーズはさみ、歯のない滑らかなティッシュドレッシング鉗子、議員整形外科骨ノミ、整形外科マレットハンマー、ロック腫瘍テナキュラ、レストラン品質の彫刻ナイフ、改造スティレットナイフ、化学スプーン、およびシャープ大さじ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:壊死の腹部法。(A) 切り込み位置: ノミの点を矢印の基部に配置し、緑色の矢印の方向にカットし、フォラメンマグナムの周りに「V」を形成する黄色の矢印に従って繰り返します。脳幹と小脳を露出させる「V」をプライ。(B)脳幹(緑色)及び小脳(青色)を壊死の腹部法を用いて曝露した場合。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:壊死のドーサル法。(A) 切り込みの位置: ノミの点を矢印の基点に配置し、矢印の方向に「U」を形成する順序でカットします。小脳をその下の脳幹で露出させる「U」をプライ。(B)背面法を用いて露出した場合の小脳(丸で囲まれた)。脳幹は真下にあり、小脳が取り除かれるまでは見えません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

椎骨が取り付けられている V=腹部、D=背部、LA=大型動物を使用する方法 合計 コメント
クマ 違います V 2
違います V 32歳
違います D 3 ハサミで頭蓋骨を開けるのに十分小さい2、1は頭蓋骨の上部を露出して調査されていたabcesを持っていた
うん V 11歳
うん D 8
違います La 1
コヨーテ 違います V 1
コヨーテ うん V 2
コヨーテ うん D 3
鹿 違います La 1
違います V 19歳
違います D 3
うん V 2 1は小さな犬でした
うん D 18歳
フェレット 違います V 1
フィッシャー 違います V 1
ムササビ うん D 1 全身
灰色のキツネ 違います V 2
灰色のキツネ うん V 4
うん V 1
ヤマアラシ 違います V 1
アライグマ 違います V 16歳
アライグマ 違います D 1 冷凍
アライグマ うん V 26歳
赤いキツネ 違います V 2
スカンク 違います V 1
スカンク うん V 3
リス 違います V 1
リス うん D 1 全身、砕かれた頭蓋骨、露出した脳腔に皮膚を切り取るためにはさみを使用
ウィースル 違います D 1
ウッド チャック うん D 1 全身
合計 170人
合計の内訳
首付き 81歳
首なし 89歳
腹部法 128の
ドーサル法 39歳
大型動物法 2
その他の方法 1
首を持つ腹部法 49歳

表1:2019年1月31日から2019年2月28日までにニューヨーク州保健狂犬病研究所に提出された頭蓋骨からの組織除去を必要とする検体の内訳。

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Discussion

狂犬病壊死のために提出された標本は、しばしば神経疾患と互換性のある臨床徴候の歴史を有する。臨床疾患の存在は、人獣共通疾患を含む様々な疾患に関連し得る。これらのリスクを低減するために、試料の取り扱いや操作を減少させる技術が実装されています。

実証された方法は、単一の動物からのみ所望の組織を除去する壊死事象を表す。より一般的に複数の標本はシフトで処理され、サンプル間のクロス汚染を確実にするために注意が必要です。クリーンなワークサーフェス(使い捨てクラフト紙またはパッド)、清潔で消毒された器具の新しいセット、および手袋の変更は必須です。組織が得られると、顕微鏡検査やRNA抽出のためのスライドを作るなど、個々の実験室の処理プロトコルに従うことができます。

これらの技術を実験室や分野で正常に実装するための重要な前提条件がいくつかあります。以前の狂犬病ワクチン接種とPPEは、狂犬病の疑いのある動物を壊死させる人にとって重要です。狂犬病研究所で働く個人は、抗狂犬病抗体の適切なレベルが存在することを確認するために、6ヶ月ごとに血清検査を受ける必要があります10.EEEV、WNVおよびウシ海綿状脳症(BSE)などの他の人獣共通疾患は、狂犬病として同様の徴候を示し、狂犬病の疑い動物にも発生する可能性があることを覚えておくことが重要です 11,12.

適切な整備された器具は、壊死を安全に行うために不可欠です。バイオハザードバッグから標本を取り出すと、事故の可能性を減らすため、手ではなく器具で操作する必要があります。小動物の壊死の前に、技術者は、頭蓋骨の基部を通して好ましい腹部アプローチが可能であるかどうかを決定するために、標本の状態を評価する必要があります。大型動物では、追加の椎骨を取り除く必要があるため、サンプルの状態を完全に評価するのが面倒すぎる場合があります。

限界は、標本の状態、組織の質および残りの頸椎の量を含むすべての壊死の技術に現れる。頸椎は狂犬病分析の結果には影響しないが、重度に分解された組織は不十分な結果をもたらす可能性がある。狂犬病診断におけるより敏感な分子方法は、重度に分解された標本13を含む直接蛍光抗体アッセイ(DFA)によって試験することができない特定のサンプルにおいて成功した試験を可能にし得る。しかし、感度の量は、適切な組織サンプリングの必要性を置き換えることができない。

狂犬病研究室の一般的な問題は、大規模な動物の壊死が現場で行われたときにテストのための不適切または不十分な脳組織を受け取っています。必要な組織がなく、追加の組織が再提出できない場合、狂犬病研究室は利用可能な組織に対して検査を行いますが、検体を陰性で確認することはできません。ストロー法やレトロ軌道ルート14などのフィールド組織コレクションのための他の公開された方法があります。どちらの方法も、頭蓋骨を開く必要なしに脳組織を収集します。ストローまたは使い捨てピペットは、前頭マグナムまたは眼窩に作成された穴を通して挿入され、本質的にコアサンプルを採取し、必ずしも脳幹の完全な断面をサンプリングする必要はありません。これらのフィールド方法は、当社の研究室での試験に満足できると考えられる方法でサンプルを収集しないため、これらのプロセスは実証も検討もされていません。

フィールドで大きな動物の壊死は狂犬病のテストのための正しい組織を除去する訓練を受けていない個人のために挑戦することができます。代わりに、20〜45キロの間の重量を量ることができる動物の全体の頭部は、フィールド獣医と狂犬病の実験室の技術者の両方のための面倒な輸送を作成するために提出されます。私たちの研究室には、大型動物壊死技術に関するトレーニングの頻繁な要求が行われています。この原稿の目的は、これらの技術の恩恵を受けることができる個人やグループにこの情報を配布することです。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

このプロジェクトを支援してくださったニューヨーク州保健省のワズワース・センターに感謝しています。また、エイミー・ウィルシーとフランク・ブレイズデル保健省ワズワース・センター、およびニューヨーク州アルタモントのLLランチからの支援を認めしたいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemistry spoon Any
Curved, sharp-blunt mayo scissors Sklar 14-2055 Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt
Large sharp restaurant-quality carving knife Dexter P94848 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Locking tumor-tenacula Diamond Scientific and Surgicals N/A Czerny Tenaculum Forcep
Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) Dexter P94848 Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Orthopedic mallet-hammer Mortech N/A Postmortem hammer with hook
Sharp councilman orthopedic bone chisel Shandon 60-5 Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in
Sharpened tablespoon or other long handled spoon Any
Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth Shandon 63-03 Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps
Powder-free non-latex gloves Any
Safety glasses, goggles, or faceshield Any
Surgery or N-95 mask Any
Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc Any

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References

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