Tecniche di necropsia della rabbia negli animali grandi e piccoli

Neuroscience

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Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare tecniche di necroscopia sicure in animali piccoli e grandi per ottenere campioni di tessuto soddisfacenti per i test sulla rabbia.

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Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals. J. Vis. Exp. (149), e59574, doi:10.3791/59574 (2019).

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Abstract

Il New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory riceve tra 6.000 e 9.000 esemplari all'anno ed esegue test sulla rabbia per l'intero stato, con l'eccezione di New York City. Il laboratorio di rabbia necropsie una varietà di animali di dimensioni che vanno da pipistrelli a bovidi. La maggior parte di questi esemplari sono animali che presentano segni neurologici, tuttavia, meno del 10% effettivamente test positivo per la rabbia; che implica traumi, lesioni o altri agenti infettivi come causa di questi sintomi. A causa del rischio di aerosolizing di agenti infettivi non diagnosticati, il Laboratorio della Rabbia non utilizza strumenti di potere o seghe. Saranno presentate tre tecniche di necroscopia per gli animali i cui teschi sono impenetrabili con le forbici. Il laboratorio ha implementato queste tecniche per ridurre la potenziale esposizione agli agenti infettivi, eliminare inutili manipolazioni del campione e ridurre i tempi di elaborazione. I vantaggi di una tecnica preferita opposta ad un'altra sono soggetti all'individuo addestrato che elabora il campione.

Introduction

Lavorare sul pavimento della necropsia di un laboratorio di rabbia è intrinsecamente pericoloso. A volte, gli esemplari arrivano con aculei di porcospino incorporati, oggetti estranei tra cui frecce / proiettili / pellet o frammenti ossei esposti che possono penetrare l'involucro di spedizione protettivo. Un imballaggio improprio può causare perdite, mettendo in pericolo gli individui che disfare i campioni. Oltre alle lesioni fisiche, i tecnici della necropsia rischiano l'esposizione a agenti infettivi zoonotici sconosciuti provenienti dal SNC e ai fluidi corporei dei campioni. Inoltre, gli ectoparassiti trasportati dall'esemplare possono trasmettere altre malattie zoonotiche, poiché le pulci e le zecche sono comunemente viste sugli animali presentati. A seconda della posizione geografica e delle specie coinvolte, le malattie esposte variano. Arbovirus come il virus dell'encefalite equina orientale (EEEV) o il virus del Nilo occidentale (WNV), le malattie trasmesse dalle zecche tra cui la malattia di Lyme o tularemia, i batteri che causano febbre Q o tubercolosi e i prioni infettivi nominano un piccolo numero dei possibili pericoli1 , 2 Il nome del sistema , 3.

Lo scopo di questi metodi è quello di dimostrare tecniche di necroscopia sicure ed efficienti utilizzando strumenti che minimizzano il potenziale di aerosolizzazione a differenza degli utensili elettrici o delle seghe4,5. Comunemente, la necropsia dei piccoli animali nel laboratorio della rabbia richiede di tagliare i muscoli cranici e di usare un martello e uno scalpello per aprire la parte dorsale caudale del calvario6. La rimozione di quest'area di calvario espone il cervello posteriore, compreso l'intero cervelletto e il tronco cerebrale cranico. Le tecniche di necroscopia modificate possono essere eseguite sulla parte ventrale del cranio, evitando i grandi muscoli cranici e le regioni più spesse del cranio. Tuttavia, queste tecniche di necropsia modificate sono possibili solo quando il campione è senza vertebre cervicali.

Allo stesso modo, il tessuto cerebrale in grandi animali può essere rimosso separando i muscoli cranici e aprendo la parte dorsale caudale del cranio7. È necessario un notevole sforzo per esporre il cervelletto e il tronco encefalico, poiché i teschi di animali più grandi sono generalmente più spessi. Per evitare di penetrare nel cranio, la testa di un grande animale è posizionata in modo che la parte ventro-caudal del cranio sia rivolta verso il tecnico. Utilizzando strumenti modificati, il cervelletto e il tronco cerebrale vengono rimossi attraverso il forame magnum. Questo è simile al metodo di acquisizione del campione raccomandato dal TSE European Union Reference Laboratory for Transmissible Spongiform Encephalopathy (TSE) indagini8. Le vertebre craniche devono essere rimosse in anticipo per fornire l'accesso al forame magnum.

L'applicazione di queste tecniche è vantaggiosa per i tecnici adeguatamente formati nei laboratori di rabbia. Poiché il laboratorio della rabbia riceve campioni di varie dimensioni, dai pipistrelli giovani al girone adulto9, il tecnico ha diversi metodi tra cui scegliere in base alla circostanza individuale. Il metodo dimostrato per un grande animale è adatto anche per i veterinari che eseguono necroscopia sul campo, poiché il trasporto di un intero capo animale di grandi dimensioni per il test della rabbia è ingombrante e costoso. L'implementazione di una di queste tecniche migliorerà la sicurezza diminuendo il potenziale della produzione di aerosol, ridurrà la movimentazione del provino e farà risparmiare tempo di lavorazione. Tuttavia, poiché il campo non presenta gli stessi vantaggi di un laboratorio specifico per la sperimentazione della rabbia, è essenziale che qualsiasi modifica apportata a queste procedure si concentri sulla sicurezza, in particolare sull'uso di dispositivi di protezione personale (PPE).

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Protocol

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dal Wadsworth Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione

  1. Don PPE, al minimo protezione degli occhi (occhiali o scudo viso), maschera chirurgica o N-95, e guanti non lattice.
  2. Preparare l'area di lavoro, idealmente un mobile bio-sicurezza (BSC), con una copertura di superficie di lavoro usa e getta (ad esempio, carta kraft o pastiglie assorbenti) e strumenti di necropsia puliti (Figura 1).
  3. Posizionare il campione sul piano di lavoro e utilizzare strumenti per manipolarlo per valutare lo stato del campione, comprese le prove di decomposizione, danni al cranio, potenziali pericoli (ad esempio, aculei di istrici, lame di bisturi) e la qualità della decapitazione.

2. Metodo Ventrale

NOTA: Quando l'esemplare viene correttamente decapitato alla mascella, il forame magnum e il condilo occipitale saranno esposti. Il metodo ventrale è meno complicato per il recupero del cervelletto e del tronco encefalico.

  1. Posizionare il campione con il lato ventrale verso l'alto e il naso dirigendo distay verso la parte posteriore della BSC.
  2. Tenere un martello/ martello ortopedico nella mano destra (se destrorso) e allo stesso tempo tenere uno scalpello dei consiglieri nella mano sinistra.
  3. Posizionare lo scalpello ad un angolo di 45 gradi con il punto d'angolo dello scalpello dirigendosi tra il lato destro dell'osso temporale e l'osso occipitale facendo un'apertura "V".
  4. Colpire la parte superiore dello scalpello con il martello fino a quando le due ossa si separano. Effettuare il taglio adiacente all'osso basisphenoide.
  5. Ripetere sul lato sinistro dell'osso temporale/occipitale (Figura 2A).
  6. Piegare l'area "V" del cranio verso il basso con lo scalpello. Esporre l'intera area del rombo del cervello (cervelletto e tronco cerebrale) (Figura 2B).
  7. Scoop fuori il tronco encefalico e cervelletto con forbici e pinze. Rimuovere eventuali pezzi rimanenti dal cranio se il tronco encefalico e il cervelletto non sono usciti in un unico pezzo.

3. Metodo dorsale

NOTA: Se l'esemplare ha una scarsa decapitazione (foramen magnum non visibile) e il collo non può essere facilmente rimosso durante la necropsia o se si sospetta un danno al cervelletto, il metodo dorsale deve essere utilizzato.

  1. Posizionare il campione dorsalmente con il naso dirigendo distay verso la parte posteriore di BSC.
  2. Utilizzando tenacula tumorale, afferrare il muscolo temporale sinistro con i denti di tenacula e bloccare stringendo la maniglia.
  3. Tagliare il muscolo temporale fino all'osso con coltello da intaglio affilato.
  4. Ruotare il campione di 180 gradi con tenacula e coltello (non mano) e ripetere il processo sul muscolo temporale opposto. Esporre il cranio.
  5. Posizionare uno scalpello ad un angolo di 45 gradi con il punto d'angolo dello scalpello al centro del cranio nella giunzione dell'osso parietale e intraparietale.
  6. Colpire la parte superiore dello scalpello con un martello fino a quando non viene fatta un'apertura orizzontale sulla metà superiore del cranio all'osso parietale.
  7. Ruotare il campione di 180 gradi e ripetere il processo sul lato opposto.
  8. Inserire il punto dello scalpello alla fine del taglio 1 (Figura 3A) e a 90 gradi di apertura orizzontale. Colpire con il martello fino a raggiungere l'osso occipitale (circa 10 cm a seconda delle dimensioni del campione).
  9. Rotolare il campione e ripetere sul lato opposto alla fine del taglio 2.
    NOTA: Con il campione dorsale e il naso posizionati verso la parte posteriore della BSC, le aperture nel cranio assomigliano a una "U" capovolta.
  10. Inserire i denti della tenacula nel cranio nella parte inferiore della "U" e pry verso se stessi. Esporre l'estremità caudale del cervello e il cervelletto (Figura 3B).
  11. Utilizzare le forbici come uno scoop e ricavare l'intero cervelletto dall'interno della cavità.
  12. Utilizzare pinze tissutali per prendere in giro il cervello derivano dal forame.

4. Grande metodo animale

  1. Posizionare il campione in modo che la parte dorsale del cranio sia a contatto con la superficie necroscolina con la porzione caudale del cranio e il foramen magnum rivolto verso il tecnico.
  2. Inserire il coltello a spillo modificato nel forame magnum tra il midollo spinale e le meningi spinali, per quanto possibile.
  3. Punteggio intorno al midollo spinale per separare il cervelletto e il cervello derivano dalle meningi spinali. Dopo che il coltello è stato inserito attraverso il foramen magnum, angolare delicatamente il coltello per seguire lungo il cranio il più possibile.
  4. Inserire una spatola chimica o sottile, cucchiaio lungo manico nello spazio tra il tessuto neurale e le meningi spinali.
  5. Sonda intorno al midollo spinale e cervelletto per garantire il collegamento con le meningi spinali sono stati interrotti.
  6. Tenere il tronco encefalico con le pinze. Con l'altra mano, far avanzare il cucchiaio squillo poi dorsalmente per raccogliere il cervelletto. Contemporaneamente tirare indietro sul tronco encefalico con le pinze e raccogliere il cervelletto utilizzando il cucchiaio.
    NOTA: Potrebbe essere necessario più di un tentativo di recupero di cervelletto adeguato per i test sulla rabbia.

5. Post necropsia

  1. Smaltire tutti i materiali monouso (guanti, tamponi, rivestimenti delle aree di lavoro) e i tessuti inutilizzati nei rifiuti biopericolosi.
  2. Pulire e disinfettare tutti gli strumenti con metodo disponibile (ad esempio, lavastoviglie industriale, autoclave, disinfettante chimico, ebollizione).
  3. Pulire e disinfettare tutte le superfici di lavoro con il 20% di candeggina e/o 70% di etanolo.

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Representative Results

Tutti i campioni terrestri presentati con teschi tra il 31 gennaio 2019 e il 28 febbraio 2019 avevano informazioni sulla presenza di un collo e sul metodo di necropsia raccolto. Durante questo periodo, 170 teste sono state necropsied con 18 specie rappresentate. Il 52% (89/170) è stato correttamente decapitato. Il resto aveva almeno una vertebra attaccata, tra cui tre esemplari interi. Il metodo ventrale è stato utilizzato il 75% (128/170) del tempo, di quelli, colli erano presenti su 49. Gli esemplari inviati con un collo lo faranno rimuovere durante la necropsia per consentire il metodo ventrale quando possibile. Sono stati presentati tre grandi animali (mucca, cervo, maiale) e in due casi è stato utilizzato il grande protocollo animale. Il grande protocollo animale non è stato utilizzato sul maiale perché sono stati necessari campioni di tessuto cerebrale supplementari per ulteriori test. Uno scoiattolo è stato presentato con un cranio schiacciato e semplicemente tagliando via il tessuto cerebrale esposto della pelle, quindi nessuno dei metodi di cui sopra è stato utilizzato (Tabella 1).

Su nuovi informamenti intatti, tutti e tre i metodi si tradurrà con il tessuto necessario per risultati affidabili dei test diagnostici sulla rabbia. Occasionalmente, il cervelletto e il tronco encefalico non possono essere rimossi intatti, anche se dopo aver rimosso tutto il tessuto dal cervello posteriore questi tessuti possono essere identificati ed elaborati di conseguenza.

Questi tre metodi preziosi non possono compensare la scarsa qualità del provino causata prima del ricevimento in laboratorio. Traumi, decomposizione e metodi di decapitazione inadeguati possono influenzare il risultato indipendentemente dall'efficienza con cui vengono raccolti i campioni.

Figure 1
Figura 1: Strumenti utilizzati nella necropsia della rabbia. Forbici acuta e smussate, vestizione di tessuto dalla punta liscia forza senza denti, scalpello osseo ortopedico, martello di mazzetto ortopedico, bloccando il coltello da intaglio di qualità del ristorante, coltello a spillo modificato, cucchiaio chimico e cucchiaio affilato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Metodo ventrale di necroscopia. (A) Posizione dei tagli: Punto di uno scalpello alla base della freccia, taglio in direzione della freccia verde e ripetere seguendo la freccia gialla formando una "V" intorno al forame magnum. Pry "V" verso il basso per esporre il tronco encefalico e il cervelletto. (B) Stelo cerebrale (verde) e cervelletto (blu) quando esposto utilizzando il metodo ventrale di necroscopia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Metodo dorsale di necropsia. (A) Posizione dei tagli: Posizionare il punto di uno scalpello alla base della freccia e tagliare in direzione della freccia nell'ordine indicato formando una "U". Pry "U" verso il basso per esporre il cervelletto con il tronco encefalico sotto di esso. (B) Cerebellum (cerchiato) quando esposto con il metodo dorsale. Il gambo del cervello si trova direttamente sotto e non è visibile fino a quando il cervelletto non viene rimosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

specie vertebre attaccate metodo utilizzato V,ventral, D-dorsale, LA - grande animale totale Commenti
sopportare No Presso 2 Il nome del sistema
gatto No Presso 32 Milia risse
gatto No d 3 (COM del nome 2 abbastanza piccolo da aprire il cranio con le forbici, 1 aveva abcess che era indagato esponendo parte superiore del cranio
gatto Presso 11 Del sistema di
gatto d 8 (IN vio
mucca No LA 1 : il nome del
coyote m inv No Presso 1 : il nome del
coyote m inv Presso 2 Il nome del sistema
coyote m inv d 3 (COM del nome
Cervo No LA 1 : il nome del
cane No Presso 19 del 12
cane No d 3 (COM del nome
cane Presso 2 Il nome del sistema 1 era un piccolo cane
cane d 18 mi lato
furetto No Presso 1 : il nome del
Fisher No Presso 1 : il nome del
scoiattolo volante d 1 : il nome del tutto il corpo
volpe grigia No Presso 2 Il nome del sistema
volpe grigia Presso 4 DEL psu'
maiale Presso 1 : il nome del
porcospino No Presso 1 : il nome del
procione No Presso 16
procione No d 1 : il nome del participio passato di "freeze"
procione Presso 26 del sistema di
volpe rossa No Presso 2 Il nome del sistema
puzzola No Presso 1 : il nome del
puzzola Presso 3 (COM del nome
scoiattolo No Presso 1 : il nome del
scoiattolo d 1 : il nome del corpo pieno, cranio schiacciato, usato forbici per tagliare la pelle alla cavità cerebrale esposta
weasle No d 1 : il nome del
Marmotta d 1 : il nome del tutto il corpo
totale 170 del sistema di
Ripartizione del totale
con collo 81 ( )
senza collo 89 (in questo stato del sistema
metodo ventrale 128 Del 12
metodo dorsale 39 mila: l'altro
grande metodo animale 2 Il nome del sistema
altro metodo 1 : il nome del
metodo ventrale con collo 49 del sistema di

Tabella 1: Ripartizione degli esemplari che richiedono la rimozione dei tessuti dal cranio presentata dal 31 gennaio 2019 al 28 febbraio 2019 presso il New York State Department of Health Rabies Laboratory.

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Discussion

Le spettri presentate per la necropsia hanno spesso una storia di segni clinici compatibili con una malattia neurologica. La presenza di malattie cliniche può essere associata a una varietà di disturbi, tra cui malattie zoonotiche, aumentando il rischio per il personale di un'infezione acquisita in laboratorio. Per ridurre questi rischi, sono state implementate tecniche che riducono la manipolazione e la manipolazione dei campioni.

I metodi dimostrati rappresentano un evento di necropsia per rimuovere i tessuti desiderati da un solo animale. Più comunemente più campioni vengono lavorati in un turno e la cura è necessaria per garantire nessuna contaminazione incrociata tra i campioni. Una superficie di lavoro pulita (carta kraft usa e getta o pastiglie), una nuova serie di strumenti puliti e disinfettati e cambi di guanto sono obbligatori. Una volta ottenuti i tessuti, il protocollo del singolo laboratorio per l'elaborazione può essere seguito, tra cui la realizzazione di vetrini per la microscopia o l'estrazione di RNA per i metodi molecolari.

Ci sono diversi prerequisiti essenziali per implementare con successo queste tecniche in laboratorio o nel campo. Le precedenti vaccinazioni contro la rabbia e il PPE sono fondamentali per chiunque necrosia un animale sospetto di rabbia. Gli individui che lavorano nei laboratori di rabbia dovrebbero avere il loro siero testato ogni sei mesi per garantire un adeguato livello di anticorpi anti-rabbia sono presenti10. È importante ricordare che altre malattie zoonotiche, come l'EEV, la WNV e l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE), presentano segni simili alla rabbia e possono verificarsi anche negli animali sospetti di rabbia11,12.

Strumenti adeguati e ben mantenuti sono essenziali per eseguire in modo sicuro la necroscopia. Una volta che un campione è stato rimosso dal suo sacchetto di rischio biologico, dovrebbe essere manipolato solo con strumenti, non con le mani, per diminuire il potenziale di incidenti. Prima della piccola necropria animale, il tecnico deve valutare le condizioni del campione per determinare se è possibile un approccio ventrale preferito attraverso la base del cranio. Con animali di grandi dimensioni può essere troppo ingombrante per valutare completamente la condizione del campione come vertebre aggiuntive potrebbe essere necessario rimuovere prima di recuperare il tessuto attraverso il forame magnum.

Le limitazioni si presentano in tutte le tecniche di necroscopia, tra cui la condizione del campione, la qualità dei tessuti e la quantità di vertebre cervicali rimanenti. Le vertebre cervicali non influenzeranno i risultati dell'analisi della rabbia, ma il tessuto gravemente decomposto può provocare risultati insoddisfacenti. Metodi molecolari più sensibili nella diagnostica della rabbia possono consentire test riusciti in alcuni campioni che non possono essere testati mediante analisi diretta di anticorpi fluorescenti (DFA), compresi i campioni gravemente decomposti13. Tuttavia, nessuna quantità di sensibilità può sostituire la necessità di un adeguato campionamento dei tessuti.

Un problema comune nel laboratorio di rabbia è ricevere tessuto cerebrale inappropriato o inadeguato per il test quando vengono eseguite grandi necroscropsie animali sul campo. Senza il tessuto richiesto, e se i tessuti aggiuntivi non sono disponibili per il reinvio, il nostro laboratorio di rabbia eseguirà test sul tessuto disponibile ma non è in grado di verificare il campione negativo, ma è insoddisfacente per i test. Ci sono altri metodi pubblicati per le collezioni di tessuti da campo come il metodo di paglia o il percorso orbitale retrò14. Entrambi i metodi raccolgono il tessuto cerebrale senza la necessità di aprire il cranio. Una canna o una pipetta usa e getta viene inserita attraverso il forame magnum o un foro creato nella orbita oculare e spinto attraverso il cervello, essenzialmente prendendo un campione di nucleo e non necessariamente campionando l'intera sezione trasversale del tronco cerebrale. Poiché questi metodi sul campo non raccolgono campioni in modo da essere considerati soddisfacenti per i test in laboratorio, questi processi non sono dimostrati o esplorati in questo documento.

Sul campo grande necropsia animale può essere difficile per gli individui che non sono addestrati a rimuovere il tessuto corretto per la sperimentazione della rabbia. Viene invece sottoposta a un trasporto ingombrante sia per il veterinario sul campo che per i tecnici di laboratorio sulla rabbia, viene invece sottoposta a un peso che crea un trasporto ingombrante. Frequenti richieste di formazione sulla tecnica della necroscopia animale di grandi dimensioni sono state fatte al nostro laboratorio. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di distribuire queste informazioni a individui e gruppi il cui lavoro può beneficiare di queste tecniche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati al Dipartimento di Salute Wadsworth Center dello Stato di New York per aver sostenuto questo progetto. Vorremmo anche riconoscere il sostegno di Amy Willsey e Frank Blaisdell del Department of Health Wadsworth Center, e LL Ranch, Altamont, NY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemistry spoon Any
Curved, sharp-blunt mayo scissors Sklar 14-2055 Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt
Large sharp restaurant-quality carving knife Dexter P94848 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Locking tumor-tenacula Diamond Scientific and Surgicals N/A Czerny Tenaculum Forcep
Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) Dexter P94848 Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Orthopedic mallet-hammer Mortech N/A Postmortem hammer with hook
Sharp councilman orthopedic bone chisel Shandon 60-5 Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in
Sharpened tablespoon or other long handled spoon Any
Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth Shandon 63-03 Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps
Powder-free non-latex gloves Any
Safety glasses, goggles, or faceshield Any
Surgery or N-95 mask Any
Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc Any

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References

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  14. Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. World Health Organization. 67-72 (2018).

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