成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離

Biology

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Summary

涙腺 (LG) は、α平滑筋アクチン (αSMA): 筋上皮細胞 (MECs) および周皮細胞を発現する2つの細胞型を有する。MECs は外胚葉の起源であり、多くの腺組織に見られる一方、周皮細胞は endodermal 起源の血管平滑筋細胞である。このプロトコルは、マウス LGs から MECs および周皮細胞を分離する。

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Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J. Vis. Exp. (148), e59602, doi:10.3791/59602 (2019).

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Abstract

涙腺 (LG) は、涙液膜の水性層を分泌する外分泌 tubuloacinar 腺である。LG 上皮樹は、腺房、導管上皮、および筋上皮細胞 (MECs) で構成されています。MECs は、アルファ平滑筋アクチン (αSMA) を発現し、収縮機能を有する。それらは、複数の腺器官で発見され、外胚葉の起源である。さらに、LG には、血管管の表面を囲む収縮細胞で周皮細胞と呼ばれる endodermal 起源の SMA + 血管平滑筋細胞が含まれています。新しいプロトコルは、私たちは大人ネズミ LGs と顎下腺 (SMGs) から MECs と周皮細胞の両方を分離することができます。プロトコルは、 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl マウス株を使用して MECs および周皮細胞の遺伝的標識に基づいており、続いて蛍光活性化細胞選別用の LG 単細胞懸濁液の調製 (FACS).このプロトコルは、MECs による上皮細胞接着分子 (EpCAM) の発現に基づいて異なる起源のこれら2つの細胞集団を分離することを可能にし、一方、周皮細胞は EpCAM を発現しない。分離した細胞は、細胞培養や遺伝子発現解析に使用できます。

Introduction

筋上皮細胞 (MECs) は、涙腺、唾液、harderian、汗、前立腺、および乳腺を含む多くの外分泌腺に存在する。MECs は、上皮と平滑筋の表現型を兼ね備えたユニークな細胞タイプです。MECs は、α平滑筋アクチン (SMA) を発現し、収縮機能1,2を有する。MECs に加えて、涙腺 (LG) および顎下腺 (SMG) には、血管管3の表面を包み込む endodermal 起源の細胞である周皮細胞と呼ばれる SMA + 血管細胞が含まれている。MECs と周皮細胞は多くのマーカーを発現するが、SMA は他の LG および SMG 細胞13で発現されていない唯一のマーカーである。

過去40年以内に、いくつかの研究所では、非酵素的および酵素学的アプローチが適用された異なる外分泌腺組織の解離のためのアッセイを報告した。1980に発表された最初の報告の1つにおいて、フリッツと共同編集者は、コラゲナーゼ/トリプシン溶液4において逐次消化を使用して猫の耳下腺伴うを単離するためのプロトコールについて説明した。1989では、・ハンおよび共同編集者は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよび DNase5の混合物を使用してラット LGs からの伴う分離のためにこのプロトコルを調整した。1990年に、Cripps および同僚は、涙腺腺伴う6の非酵素的解離の方法を発表した。その後、1998において、Zoukhri および共同編集者は、LG および SMG 上で伴う+-イメージングを行うための酵素的解離プロトコルに戻った。過去10年間で、研究者は、外分泌腺から幹/前駆細胞の分離に焦点を当てています。プリングルおよび共同編集者は、マウス SMG 幹細胞8の単離のための2011のプロトコルを説明した。この方法は、培養において維持された幹細胞含有 salispheres の単離に基づいていた。著者らは、幹細胞関連マーカーを発現する増殖細胞は、これらの salispheres8から単離される可能性があると主張した。Shatos と共同編集者は、酵素消化と「遊離」細胞の収集を使用して、無傷成体ラット LGs から前駆細胞分離のためのプロトコルを発表しました9.後に、2015において、アッカーマンおよび共同編集者は、この手順を、複数継代10にわたってモノラル層培養として伝播することができた推定「ネズミ涙腺腺幹細胞」 (「mLGSCs」) を分離するように調整した。しかし、上記の手順のいずれも、細胞内亜型および単離された上皮細胞の個々の集団を区別するために認めた。2016で、グロモワおよび共同編集者は、FACS11を用いて成体ネズミ LGS から LG ステム/前駆細胞を単離するための手順を発表した。ただし、このプロトコルは MECs を分離するためのものではありません。

最近では、3週齢の SMA-GFP マウス12から sma + 細胞を分離することができることが示されています。しかし、現時点では、SMA + 細胞の異なる個体群を分離していません。ここでは、成人の LGs および SMGs から分化した MECs と周皮細胞を直接分離するための新しい手順を確立しました。

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Protocol

すべての動物の仕事は国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従って行われ、スクリプス研究所の機関動物のケアと使用委員会によって承認されました。すべての努力は、マウスとその苦しみの数を最小限に抑えるために行われました。すべての実験動物は、水道水への無料アクセスで標準的な食事を受けました。

注:MEC および周皮細胞絶縁の主なステップは図 1a-Fで概略的に概説されています。この手順に使用されるすべての試薬および装置は、表 1に記載されている。

1. マウスと SMA 細胞にラベルを貼る

  1. 使用大人 (2-4 ヶ月) タモキシフェン誘導性、αSMA 駆動レポーターマウスSMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl.
    注:SMACreErt2 株は Kalajzic 博士によって親切に提供されました13.Rosa26-TdTomatofl/fl (B6.Cg-Gt (ローザ) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/Jとしても知られている) 株 (# 007909) は、ジャクソン研究所 (サクラメント、CA) から購入した。SMA + 細胞は、タモキシフェンの腹腔内 (商標) 投与によって標識した。
  2. タモキシフェン溶液の調製
    1. 濾過トウモロコシ油を準備します。コーンオイルは粘性であるため、0.22 μ m 真空フィルタを使用してください。
    2. ボトルから TM 粉末 1 g を 50 mL チューブに移します。ボトルに 1 mL のエタノールを入れ、キャップをしてすすぎ、50 mL チューブに加えます。もう 1 mL のエタノールで繰り返します。
    3. ろ過されたコーンオイルを加えて、50 mL の 20 mg/mL TM 溶液を作ります。、チューブを渦箔でラップし、45° c で振盪水浴または振盪インキュベーターに入れます。
    4. TM を溶解するのに約12-24 時間かかることがあります。時には、チューブを取り外し、残りの結晶がないか確認してください。TM が完全に溶解したら、アリコートを-80 ° c で保存します。解凍されたアリコートは再利用できます。
  3. SMA + 細胞に標識するには、2つの連続した日に TM でマウス腹腔内 (IP) を注入する。
    1. 注射3-4 週古いSMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f 任意の性別マウスに TM を持つ100μ l/20 g (または 2Mg/20g) 体重 (図 1a).マウスは、最後の TM 注入の2-3 日後に細胞単離のために使用する準備ができている。必要に応じて、注入されたマウスは、TM 注入後のより長い期間に屠殺することができる。
      注:FACS 中の適切な補償のためのコントロールとして、1つの野生型 (C57Bl/6) マウスと1つの SMA CreErt2/+: 同じ年齢の TM (「未染色」 MECs) を注射されていないRosa26-TdTomatofl/fl マウスが必要になります。2 SMA CreErt2/+ に提供される同じ計算を使用してください: Rosa26-TdTomatofl/fl マウス.未注入のSMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFl/fl は DSRed の背景の評価を可能にします。C57Bl/6 マウスは未染色細胞のネガティブコントロールとして機能する。

2. ソリューションとバッファ

注:LG は、細胞の解離を困難にする細胞外マトリックスを含む上皮起源腺である。したがって、酵素の特別な組み合わせと、以下に説明するマルチステップの消化プロセスを使用することをお勧めします。

  1. ディスパーゼタイプ II ストックソリューション (25x)
    1. 溶解 120 mg のディスパーゼタイプ II 粉末を2ml の 50 mM HEPES/150 mM NaCl で25x 原液を調製する (最終濃度は30単位/mL でなければならない)。ミリグラムあたりの単位は、マウスの数とディスパーゼの濃度に応じて変化させることができ、それに応じて調整する必要があります.
    2. 200μ l のアリコートを用意し、-70 ° c で数日間、6ヶ月または4° c で保管してください。酵素の分解を防ぐために、ディスパーゼのアリコートを複数回凍結/解凍しないでください。
  2. DNase タイプ I ストックソリューション
    1. DNase タイプ I 粉末の 5 mg を 50% グリセロール、20 mM トリスバッファー (pH 7.5)、および 1mm MgCl2 (ストック濃度は約2000単位/mL でなければならない) の5ml 溶液中で溶解する。ミリグラムあたりの単位は、マウスの数によって異なる場合がありますので、DNase の濃度はそれに応じて調整する必要があります。
    2. 0.22 μ m フィルターと10ml シリンジを使用して、ストックソリューションをフィルタリングします。
    3. 200μ l のアリコートを用意し、-70 ° c で数日間、6ヶ月または4° c で保管してください。酵素の分解を防ぐために、2回以上凍結/解凍しないでください。
  3. 消化媒体
    1. グルタミンを含まない 10 mL の DMEM 低グルコースに、1:100 の希釈のための100μ l の細胞培養サプリメント (例えば、Glutamax、材料の表参照) を加える。
    2. 低グルコースを細胞培養サプリメントで2ml の 2 mL に添加し、ピペッティング (湿式アイスの酵素)、160μ l のディスパーゼ原液 (2.4 U/mL の最終濃度)、16μ l の DNase 型原液 (8 U/mL 最終濃度) で十分に混ぜる。、1 M CaCl2 (6 mM 最終濃度) の12μ l とする。
      注:カルシウムは、酵素活性14,15を増加させるために必要とされる。すべての計算は、2匹の成体マウスからの4つの涙腺からの細胞の単離のために提供される。消化培地の体積は、組織の量および反復の数に応じて変化し得る。2 mL 培地あたり2-4 ヶ月の古いマウスから4つ以上の涙腺を使用しないでください。
  4. ブロッキングメディア I
    1. 25 mL の DMEM/F −12に、1:100 の希釈のための FBS (15% の最終濃度)、250μ l の細胞培養サプリメント (材料の表を参照)、および50μ l の 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 mM 最終濃度) を加えます。
      注:このプロトコルのために比較された培地の異なるタイプの DMEM/F −12が最良の結果を与えた。この培地はまた、上皮細胞1617を単離/培養するために他の研究者によって使用されている。
  5. ブロッキングメディア II
    1. PBS の 25 mL に 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 mM 最終濃度) の50μ l を加えます。
  6. 回復媒体
    1. 5 mM MgCl2を添加した HBSS の2ml には、DNase タイプ I 原液の100μ l を 2 ml の最終濃度で 100 U に加える。比較的高濃度の DNase は、上皮細胞の凝集を減少させるために必要とされる。
  7. 蛍光活性化細胞選別 (FACS) バッファー
    1. 486.5 mL の PBS に、12.5 mL の血清 (2.5% の最終濃度) と 1 mL の 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 mM の最終濃度) を加えます。
      注:バッファーは4° c で最大6週間保存できます。

3. 成人マウス涙腺腺の収穫とマイクロダイセクション

  1. イソフルラン吸入によってマウスを麻酔 (イソフルラン流速または濃度を 5% 以上に調節する) および頸椎脱臼による犠牲。機関の IACUCs 勧告に従って麻酔と安楽死を行う。
  2. 微細な鉗子とはさみを使用して、目と耳の間の皮膚を取り除きます (図 2a)。
  3. LG を分析するには、ピンセットを使用して穏やかに LG を引っ張り、小さなはさみの鋭い先端を使用して LG の周りの結合組織をスクラッチして解放します (図 2b)。
  4. LG と耳下腺唾液腺は互いに非常に近くに位置し、切開前に分離しなければならないので、はさみで切断しないでください。LG と耳下腺が分離したら、はさみを使って LG を切り出します。2 mL の冷 PBS (氷を入れたまま) で 35 mm ディッシュに腺を置きます (図 1b)。
  5. LG が結合組織カプセル/エンベロープによって覆われているので、解剖顕微鏡下で周囲の脂肪と結合組織を整え、2つの鉗子で LG カプセルを除去する。
    1. すべての腺のためにこのステップを繰り返します。
  6. 細胞の標識を確実にするために、蛍光顕微鏡下で組織の小片をチェックしてください (図 1c)。

4. LG シングルセルサスペンションの準備

  1. すべての LGs を、室温 (RT) 消化培地の 0.5 mL の 35 mm 皿に移し、小さなはさみを使用して、非常に小さい部分 (約 0.2 ~ 1 μ m2) に移動します。通常、3分の1は、ミンチ 4 LGs (図 2c) にかかります。
  2. 細径ピペットフィルター先端を使用してミンチ組織を2ml の丸底管に移します。先端が切り取られた通常のサイズのピペットチップを使用します (図 2d)。
  3. 最大 2 mL の消化媒体を追加し、チューブを反転させることによって混ぜる.
  4. 37° c で、振とう器 (または振盪水浴) にチューブを置き、90分間、100-120 rpm。
  5. 30分ごとに減らされた穴のサイズの1000μ l フィルター先端を使用して腺の部分20-30 回をゆっくりピペットで留めなさい (図 2d)。インキュベーション/からむ後、10μ l のアリコートを取り、顕微鏡でクラスターを検査します。クラスターが持続する場合は、消化を継続します。
  6. 90分後、インスリン注射針 (31G) を介してサンプル2-3 回を通過し、さらに細胞を懸濁液に放出する。
    注:目に見える涙腺部分は消化が完了すると解決に残るべきではない (図 1d)。
  7. 細胞懸濁液を 15 mL チューブに移し、ブロッキングメディアタイプ I を合計 5 mL にします。混合するチューブ2-3 時間を反転します。
  8. 50 mL の管に置かれる70μ m の細胞のストレーナーを通した細胞の懸濁液を渡しなさい。1 mL のブロッキングメディアタイプ I でストレーナーを洗浄します。ステップ4.8 をもう一度繰り返します。
  9. RT で5分間 0.4 x gでサンプルを遠心分離します。
  10. 上清を吸い出す。1つの mL のピペットの先端を使用してブロック媒体のタイプ II の2つの mL の細胞を再度中断し、2つの mL マイクロ遠心管に細胞の懸濁液を移す。
  11. RT で3分間 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL ローター、材料のテーブルを参照してください) で細胞を遠心分離します。
  12. 上清を吸引し、細胞剥離溶液1ml の細胞を再懸濁させる (材料の表を参照)。
    注:ここで、細胞剥離液は、細胞表面マーカーの分析のために細胞を Accutase/解離するタンパク質分解およびコラゲナーゼ活性を有する海洋起源酵素である。
  13. 細胞を37° c、100-120 rpm で2-3 分インキュベートします。細胞剥離溶液による過剰消化は細胞膜を損傷することがある。
  14. 細胞懸濁液を 50 mL チューブに移し、10 mL のブロッキング培地タイプ I を追加します。遠心管で 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL ローター;材料の表を参照) 5 分間
  15. 上清を廃棄し、回復培地 6 mL で細胞を再懸濁し、RT で30分間細胞をインキュベートします。
  16. 10μ l の細胞懸濁液を顕微鏡下で確認し、完全な細胞解離を確保します (図 3)。
  17. セルカウンタを使用してセルを数え、トリパンを青にします。通常、4つの LGs (1 サンプル) から 4 x 105-6 x 106 セルが期待されます。
  18. 細胞を遠心分離し、0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL ローター、材料表を参照)、RT で3分間、抗体染色に進みます。

5. 抗体染色

  1. 400μ l の FACS バッファーを含む 2 ml チューブに最大5個の x105セルを追加します。ブリリアントバイオレット421抗マウス CD326 (EpCAM) と0.5 μ l のゴーストレッド 780 (実行可能性色素) 5 μ l を加えます。
  2. 並行して、FACS 補正を調整するためのコントロールを準備します。
    陰性対照-1 (野生型マウス由来の細胞)
    SMA CreErt2 からのバックグラウンドコントロール未染色細胞/+: Rosa26-TdTomatofl/fl
    Cy7-780 染色された細胞 (ゴーストレッド780生存色素で染色した野生型マウスからの細胞)
    EpCAM-ブリリアントバイオレット 421 (EpCAM-ブリリアントバイオレット421抗体を染色した野生型マウス由来の細胞)。
    注:各コントロールサンプルに対して、400μ l あたり最小 1 x 105セルを FACS バッファーで使用します。
  3. ピペッティングにより細胞を各試薬に完全に添加した後。
  4. ホイルでチューブ (s) をラップし、4° c で45分間チューブを回転させます。
  5. 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL ローター、材料のテーブルを参照) でサンプルを遠心分離し、4° c で3分間使用します。
  6. FACS バッファー1ml で細胞を再懸濁させる。補正中に背景を減少させるために、細胞を洗浄することが重要です。

6. 蛍光活性化細胞選別

  1. 細胞懸濁液を 5 mL の FACS チューブに移し、FACS 分析で進めます。氷の上にセルを保持します。
  2. 単一のカラーコントロールを使用して補正を調整します。
  3. 適切なフローサイトメーターを使用して、100μ m のノズルを介して 20 psi でセルをソートします (資料の表を参照)。ゲーティング strategy18 が図 1eおよび図 4に示されています。
  4. ダウンストリームの手順に応じて、ソートされたセルを中、RNA 後、FACS または溶解バッファーに集めます (図1e、F)。

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Representative Results

SMA + MECs および周皮細胞を隔離するマウスモデル
確立された議定書は LGs および SMGs からの MECs および周皮細胞の2つの純粋な人口の分離を可能にする (表 1参照)。これらの2種類のセルは、サイズと外観が異なります。微小血管周皮細胞は、毛細血管の壁の周りに発達し (図 5a)、正方形の形状を有する (図5b) 一方、MECs は LG 分泌伴うを囲み、長いプロセスを有し、比較的大きな領域を占める (図 5a、B).記載された手順は、TM 誘導性SmaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl マウス株における SMA + の遺伝的細胞標識に基づいています。さら、EpCAM 抗体は、上皮 SMA+: EpCAM+外胚葉起源 (MECs) および SMA+epcam 細胞 endodermal 起源の細胞 (周皮細胞) を区別するために研究者を可能にします。

単一細胞懸濁液の調製
LG には、完全に消化しなければならない糸状の細胞外マトリックスが含まれています。提供された議定書は FACS の分析およびそれ以上の適用のための単一の細胞の解決の準備を可能にする。細胞を解離させる例を図 3に示す。

MEC および周皮細胞の分離
周皮細胞から MECs を区別するために、単一細胞が抗体で染色された EpCAM に、上皮細胞のみを検出した。細胞の主な集団は、前方および側散乱領域ゲーティングによって決定されました (図 4a)。ダブレットは、前方散乱領域対幅をプロットし、横散乱領域対幅 (図 4b) で除外しました。死細胞の排除は、ゴーストレッド 780 (実行可能性染料) を介して行われました (図 4c)。ラベルのないコントロール (図 4e)、バックグラウンドコントロール、および単一の一次抗体で標識された抗体制御を使用して、バックグラウンドノイズ (非特異的抗体結合) を決定し、最適な分離のために適切に補償を確立信号間 (図 4d)。データ分析は、FlowJo ソフトウェアを使用して実行しました。

MECs および周皮細胞は、DsRed 標識によってゲートされた。DsRed+ dim (図示せず) と DsRed+周皮細胞細胞集団内の明るい細胞が検出された (図 4d)。標識された細胞の明るさは、TM 注入19の際の SMA 発現のレベルまたはレポーター活性化の程度に依存し得る。完全に分化した細胞だけが必要であったため、DS Red+明るい細胞集団だけが集められました。DS の赤+薄暗い細胞集団は、さらなる調査を必要とします。

ダウンストリームアプリケーション
MECs が外分泌腺で重要な収縮機能を果たしていることはよく知られています。また、彼らは非常にプラスチック細胞であり、幹細胞の特徴を持っています。したがって、分離された MECs は複数のアプリケーションで使用できます。例えば、細胞は、培養することができ、RNA 単離または移植のために使用される (図 1f)12202122

パラメーター 涙腺 顎下腺
試料当たりのマウス数 2 1
サンプルあたりの腺の数 4 2
解剖腺 耳下腺から分離 舌下腺から分離
サンプルあたりのコラゲナーゼの濃度 6mg/2ml 9 mg/2 mL
酵素解離後のおおよその細胞数 4x105-6x105 9x105-1.5 x106
回復ステップ (「成人マウス涙腺腺単一細胞解離」、点15を参照) 6 ml のリカバリメディアでセルを再停止する 12 mL のリカバリ・メディアでセルを再中断
抗体染色中の FACS バッファーの量 400μ l 400μ l によって2つの管;各チューブが6x10 を超えていない2または3のチューブにセルを分割することをお勧めします

表 1: 顎下腺 (SMG) からの細胞の単離のためのプロトコルの変更。この表は、マウス MECs に対する手順と比較して、ネズミ SMG からの周皮細胞および分離を単離するために必要な主要な変更について説明する。

Figure 1
図 1: 実験を模式的に表現したもの。(A) SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/flマウスの TM の IP の注入。(B) LG または SMG の分離およびミンチ。(C) 蛍光顕微鏡を用いた細胞標識の分析(D) 単一細胞溶液を調製するための多段階酵素消化。細胞がクラスタから放出されることを確実にするために、軽い顕微鏡の下で消化のステップをチェックすることは重要です。(E) SMA + ブライト ds レッド +/EpCAM + (MECs) と DS レッド + ブライト/EpCAM-(周皮細胞) を示すゲーティングの例。(F) 収集された MECs および周皮細胞は、細胞培養、RNA 単離および遺伝子発現分析および細胞移植を含む異なる下流の手順を受けることができた。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: LG 隔離/ミンチの重要なステップ(A) 目と耳の間に皮膚を除去して、lg を解剖する。黄色の破線は lg の位置を示します。(B) LG 解離。黄色の矢印は、涙腺と耳下腺の間の領域を指します。(C) LG は、湾曲した、鈍い末端を有するはさみを使用して消化媒体でミンチ。(D) ミンチ状の組織を2ml のチューブに移す。黄色の矢印は、転送に必要な広いボアサイズ 1 ml のチップを示しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4

図 3: 共焦点と差動干渉コントラスト (DIC)マウス LG からの単一細胞の解離を示す画像。(A − C) 1 つの4ヶ月の古い SMA CreErt2/+ の2つの LGs から単離された単一細胞: Rosa26-TdTomatofl/fl マウス。核は DAPI (青色) で染色される。白色の矢印は SMA + (DS Red) 細胞: MECs または周皮細胞を示します。スケールバー = 15 μ mこの図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3

図 4: FACS を用いてネズミの LG MECs および周皮細胞の同定。(A) 前方および側散乱領域ゲーティングによる LG 細胞の主な集団の決定。(B) フォワード・スキャッタ・エリア対幅によるダブレットの除外。(C) ゴーストレッド780による死細胞排除 (生存性染料)。(D) MEC (sma+ブライト/epcam+) および周皮細胞 (sma+ブライト/epcam-) 個体群は、EpCAM 抗体による染色に基づいて区別した。(E) 未標識対照 (野生型マウス由来の細胞)。各プロットでは、ゲートセルの% が提供されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: マウス LG から単離された MECs と周皮細胞の間の分布および形状の違いを示す共焦点画像。(A) 周皮細胞との間の分配の相違を示す標識された細胞が付いている LG の全体の台紙の準備。(B) MEC と周皮細胞の形状が異なる。周皮細胞は比較的小さく、五王形状であるのに対し、MEC は大きく、不規則な形状といくつかの長いプロセスを有している。矢印 = MECs と周皮細胞。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この原稿は、LG と SMG からの MEC および周皮細胞分離のプロトコルを説明した。この手順は、SMA、MECs および周皮細胞の唯一の信頼できるバイオマーカーの遺伝的標識に基づいていました。

このプロトコルを開発する緊急性は、ネズミ LGs および SMGs からの MECs の分離を強調する文献のほぼ全ての欠如によって動機づけられた。遺伝子標識が以前に使用されていたが、SMA-GFP マウスを使用して、若い3週齢の LGs12から sma + 細胞を単離することは、成人マウスにおけるシグナルの部分的な喪失による細胞の単離のためにこれらの古いマウスを使用することを許可しなかった。加えて、GFP 標識細胞は、FACS アプリケーション23において比較的高いバックグラウンドを与え、追加の補償を必要とする。対照的に、 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl マウスラインは、マウスの生後の発達、成人期および老化の間に、NO または低バックグラウンドと SMA ラベリング活性化の高レベルを示しています。SmaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl マウスの使用法は、疾患の進行または老化に焦点を当てた研究にとって特に重要であり、これらのマウスの SMA + 細胞は、疾患開発の前に標識され、後で研究疾患/老化が進行する。プロトコルのもう一つの重要なステップは、徹底的な LG ミンチと次の消化です。このステップにより、FACS 分析中に得られる細胞数を減らすことができる。全体的に、一次細胞の単離および即時分析は、培養24において維持される細胞の転写プロファイルにおける著しい変化のためにも重要である。

さらに、マウス LGs からの MEC および周皮細胞分離のための説明されたプロトコルは、異なる下流の手順を可能にする。タンパク質、RNA および DNA 抽出は両方の単一細胞集団から可能であるが、いくつかのマウス/サンプルは細胞数を増加させるために並列または逐次的に処理される必要がある。まとめると、得られた結果は、異なるネズミ腺組織からの MEC および周皮細胞分離のための効果的かつ比較的簡単な方法を実証する。

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Disclosures

著者らは、競合する金銭的利益や他の利害の対立を宣言していません。

Acknowledgments

私たちは、Kalajzic 博士は、 SMACreErt2 マウス株、マウスのテーリングとジェノタイピングのための Umazume たけし、図2のためのプロの写真を取得するためのマーク・シェリーに感謝します。また、科学的な英語編集のための科学エディターとマーク・シェリーのスクリプス評議会に感謝します。スクリプス研究所のフローサイトメトリーコアは、細胞選別と、FACS データ解析に関する複数の議論/アドバイスのための Dr. ロビン Willenbring に感謝しています。

この作品は、国立衛生研究所、国立眼科研究所助成金 5 R01 EY026202 と 1 R01 EY028983 によって支持されました H.P.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety Cabinet SterilCard Baker 19669.1 Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-910 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-908 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352196
25 mL Disposable serological pipets VWR 89130-900 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes Fisher Scientific, Falcon 14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352070
Antibiotic-antimycotic Invitrogen 15240-062
Appropriate filter and non-filter tips Any available Any available
BD Insulin Syringes Becton Dickinson 328468 with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL Becton Dickinson 309604 Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) Biolegend 118225 Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution BioVision B1010 sterile
Cell culture dishes 35 mm Corning 430165 Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I Wortington LS004194
Corn oil Any avaliable Any avaliable From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm Sigma-Aldrich CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D Corning Item# UX-84302-50
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt McKesson Argent 487350 Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I Akron Biotech, catalog number AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) Sigma-Aldrich D5546-500ML with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) Millipore DF-042-B without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller Eppendorf 4430000018 with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific 12-812
FlowJo version 10 Any available Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2 Carl Zeiss ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye Tonbo Biosciences 13-0865-T100
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific, Gibco 35050061
Glycerol 99% Sigma-Aldrich G-5516
Hand tally counter Heathrow Scientific HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma Millipore H6648-500ML Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092 With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-51B 02-671-51B
HEPES 1 M solution ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-080 Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution JT Baker 5618-03 To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator New Brunswick Scientific SKU#: Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors Aurora Surgical AS12-021 Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic Southern Anesthesia Surgical (SAS) PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution Sigma-Aldrich 63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL ThermoFisher Scientific 3451 Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point Any available Any available
NaCl powder Sigma-Aldrich S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters Fisher Scientific 724-2020
Pen Strep Gibco 15140-122
pH 510 series Benchtop Meter Oakton SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023 pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Red blood cell lysis buffer 10x BioVision 5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator Cole Parmer MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf Biopur 22600044 PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors Office Depot 375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ Beckman Coulter B25982 With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002441 All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific ID# 21550 RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope Carl Zeiss 455054SV6 With transmitted light base
Tamoxifen Millipore Sigma T5648-1G
Trizma base powder Sigma-Aldrich T1503
Trypan blue solution Millipore Sigma T8154
Two Dumont tweezers #5 World Precision Instruments 500342 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope Any available Any available With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line VWR 10040-436
Variable volume micropipettes Any available Any available

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References

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