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Shootward movimento de CFDA Tracer carregado no fundo pia tecidos de Arabidopsis

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Summary

O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.

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Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis. J. Vis. Exp. (147), e59606, doi:10.3791/59606 (2019).

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Abstract

O Tracer symplastic 5 (6)-o diacetato do carboxyfluorescein (CFDA) foi aplicado extensamente em plantas vivas para demonstrar a conexão intercelular, o transporte do floema e o patterning vascular. Este protocolo mostra o movimento de carboxifluoresceína (CF) de baixo para cima na Arabidopsis usando o procedimento de corte radicular e o hipocótilo-pinching, respectivamente. Estes dois procedimentos diferentes resultam em eficiências diferentes do movimento do CF: aproximadamente 91% de aparência de CF nos tiros com o procedimento hypocotyl-beliscando, visto que somente aproximadamente 70% de aparência de CF com o procedimento da raiz-estaca. A simples mudança de locais de carregamento, resultando em mudanças significativas na eficiência móvel deste corante symplastic, sugere que o movimento CF pode estar sujeito à regulação symplastic, provavelmente pela junção raiz-hipocótilo.

Introduction

Muitos traçadores fluorescentes com uma escala de propriedades espectrais, tais como 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic o ácido2, Lúcifer ch amarelo (lych)3, esculin e CTER4, foram desenvolvidos e aplicado em plantas para monitorar o movimento symplastic e a atividade do floema. Geralmente, uma tintura symplastic é carregada em um corte no tecido do alvo e a dispersão seqüencial do repórter em outras partes da planta demonstrará a comunicação intercelular. Embora o mecanismo da absorção da tintura não seja compreendido inteiramente, o movimento subjacente do CF do princípio dentro das pilhas vivas foi reconhecido extensamente. A forma de éster de CF (diacetato de CF, CFDA) é não-fluorescente, mas membrana-permeável. Esta propriedade permite a difusão rápida da membrana da tintura em pilhas. Uma vez dentro das células vivas, as esterases intracelulares removem os grupos de acetato na posição 3 ' e 6 ' do CFDA, liberando a FC fluorescente e membrana-impermeable (Figura 1, alternativamente, consulte Wright et al.2); O CF pode então mover-se através dos plasmodesmos a outras partes das plantas.

Um procedimento bem estabelecido com CFDA é que ele pode ser carregado em folhas de origem e usado para monitorar o fluxo de floema e descarga de floema nos tecidos de pia de muitas espécies, por exemplo, como a descarga de CF na raiz de Arabidopsis 5, descarregamento de floema durante a tuberização da batata6, o descarregamento de floema no dissipador de Nicotiana deixa7, e assim por diante. Por abordagens similares de carga, outros estudos adotaram esse corante para demonstrar a conexão symplastic entre hospedeiro e parasita8,9, ou para revelar as relações simbióticas10,11.

Outra maneira de fazer uso deste corante é carregá-lo em células específicas ou célula única por microinjeção para determinar o seu padrão de distribuição. Tais técnicas sofisticadas facilitaram muito nossa compreensão mais profunda da comunicação intercelular mediada por Plasmodesmata, particularmente no desenvolvimento do conceito de domínio symplastic12,13. Por exemplo, a microinjeção de CFDA em células cotiledôneas de Arabidopsis resultou no padrão de acoplamento de corante na epiderme do hipocótilo, mas não acoplamento nas células subjacentes ou na epiderme radicular, portanto, a epiderme do hipocótilo forma uma domínio symplastic14. Domínios semelhantes, como as células de guarda estomática15, células de companheiro de peneira16, células de cabelo raiz14 e tampão de raiz17,18 foram identificados por técnica de microinjeção. Mais surpreendentemente, alguns domínios permitem que as moléculas traçadoras se movam em uma determinada direção. Tome o domínio do tricomas por exemplo, microinjection de uma ponta de prova fluorescente na pilha epidérmica de apoio conduz ao fluxo do Tracer no domínio do tricomas, entretanto, a injeção reversa não segura19verdadeiro. Um relatório recente também encontrou situações semelhantes nos domínios symplastic do embrião de Sedum 20. Assim, todos os casos acima implicam que a troca de locais de carregamento pode levar a novas percepções sobre a comunicação symplastic. Nosso experimento anterior com o objetivo de dissecar a rota de silenciamento móvel root-to-shoot identificou um novo domínio symplastic, ou a zona de HEJ (Hipócotilo-epicotyl Junction), que foi ainda verificada através do CFDA de carregamento de raízes (coletor não canônico) experimento21. Aqui, Nós elaboramos ainda mais o movimento da raiz para disparar CF usando um método simples e recupero um domínio symplastic potencial deslocando os locais de carregamento. Além disso, este procedimento pode ser adaptado para diferenciar origens genéticas que alteraram o transporte de longa distância root-to-shoot.

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Protocol

1. crescimento vertical de Arabidopsis no meio do MS

  1. O interior do armário do fluxo laminar precisa de ser tratado com a luz UV de 30 minutos e o fluxo de ar de 15 minutos antes do uso. Certifique-se de fechar a porta de vidro quando a luz UV está ligado. Pulverize todas as ferramentas e placas com 70% de etanol antes de colocá-las no armário.
  2. Prepare o meio Murashige e Skoog (MS) em um prato de Petri padrão de 90 mm de diâmetro um gabinete de fluxo laminar.
    Nota: o meio MS contém os seguintes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1, 3 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm cocl2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, ácido etilenodiaminotetracético de 114,5 μm (EDTA), ácido nicotínico de 4, 7 μm, HCL do piridoxina de 2,44 μm, HCL do tiamina de 0,15 μm, Glycine de 2,68 milímetros, 555 μm Myo-inositol, sacarose de 87,7 mm e Agar 10 g/L.
  3. Hidratar as pontas ou palitos esterilizados tocando a ponta ou palitos para o meio MS, em seguida, mergulhe as sementes esterilizadas um por um na posição fixa de cada placa de Petri indicada pelo cartão de semeadura.
  4. Selar o prato de Petri com película de parafina e fita adesiva e colocá-lo verticalmente em um stand claro em uma sala de crescimento (22 ° c, 70% de umidade) com um ciclo de dia de 16 h de luz e 8 h de escuridão (iluminação das 6 am às 10 horas). A planta de Arabidopsis está pronta para o carregamento de CFDA no dia 9-13 após a semeadura.
    Nota: o procedimento a seguir é realizado na parte da tarde de 2 PM a 5 PM.

2. carregamento de CFDA com o procedimento de corte da raiz

  1. Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura a uma concentração de trabalho de 5 μm.
  2. Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
  3. Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel. Coloc as partes pequenas da película abaixo de cada raiz.
    Nota: a partir deste para o passo 2,6, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.
  4. Levante as plantas na tampa do prato de Petri. Corte as raízes em uma posição de cerca de 5-10 mm abaixo da junção raiz-hipocótilo. Coloque a parte do tiro de volta para o filme no meio.
  5. Aplique com cuidado 0,25 μL de CFDA na extremidade de corte de cada raiz um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
  6. Cubra a placa e deixe as plantas a luz para 2-3 h (22 ° c) na sala de crescimento.
  7. Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para detecção de fluorescência, use um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) montado para transmitir o sinal de fluorescência.

3. carregamento de CFDA com procedimento do hypocotyl-beliscar

  1. Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura (veja a tabela de materiais) a uma concentração de trabalho de 5 μm.
  2. Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
  3. Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel.
    Nota: a partir deste para o passo 3,7, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.
  4. Coloque um pequeno pedaço de filme a junção raiz-hipocótilo de cada planta.
  5. Use o fórceps para beliscar delicadamente o hipocótilo próximo à junção da raiz-hipocótilo um microscópio de dissecação.
  6. Aplique com cuidado 0,1 μL de CFDA no local da ferida um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
  7. Cubra a placa, e deixe as plantas a luz (° c 22) para 2-3 h.
  8. Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para a detecção de fluorescência, montar um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) para transmitir o sinal de fluorescência.

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Representative Results

O movimento symplastic é frequentemente sujeito às flutuações ambientais. A perturbação do estado vegetante, e até mesmo o processo de preparo tecidual afetarão o limite de exclusão de tamanho de Plasmodesmata, afetando assim o transporte symplastic22. Para melhorar a eficiência de coloração, nós confinamos nossa operação na sala de crescimento, onde a temperatura ea umidade é firmemente controlada, e também executar todo o procedimento o mais rapidamente possível (idealmente dentro de 10-15 min depois de levantar a tampa do prato de Petri). Estas precauções durante um experimento podem efetivamente reduzir as taxas de coloração de tiro sem sucesso.

Nós descrevemos dois procedimentos ligeiramente diferentes para demonstrar o movimento da disparar-ala dos CF. Normalmente, ambos os procedimentos podem levar à coloração da FC nos brotos cerca de 2 h após a alimentação (Figura 2). No entanto, os dois procedimentos produzem diferentes eficiências de coloração. O procedimento de hipocótilo-beliscar resulta em 91% de eficiência de coloração, enquanto o procedimento de corte radicular produz 70% (teste tde Welch, p < 0, 1) (Figura 3). Nós igualmente tentamos carregar a tintura por um método da raiz-pinching e encontramos uma eficiência de mancha mesmo mais baixa comparada com o método da raiz-corte, sugerindo que a aproximação para carregar a tintura na raiz não conta para a diferença de mancha entre a raiz e o hipocótilo locais de carregamento (Figura 3). O sinal CF é encontrado principalmente na vasculatura, mas apenas poucas plantas mostram o padrão de meia folha (Figura 2) como observado em outros padrões de movimento da macromolécula21. Uma vez que o sinal CF é espalhado para o tiro, ele pode ser mantido por mais de 72 h e o sinal não pode descarregar mais para outros tipos de células; Isto é consistente com os resultados previamente publicados17.

Figure 1
Figura 1 : Uma ilustração esquemática para a captação de CFDA e o movimento dos CF nas pilhas da planta. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Sinal CF nos brotos de 9, 11 e 13 dias após a semeadura (das) Arabidopsis plantas. O sinal CF pode ser detectado tanto em cotilédonas como em folhas verdadeiras (A, B, C). Na maioria das plantas, observa-se o sinal CF na vasculatura após 2-3 horas de carga com o método de corte radicular ou hipocótilo-pinching. Somente em casos muito raros (menos de 0,5%), o método de hipocótilo-beliscar pode gerar um padrão de coloração parcial no cotilédone de 7 DAS Arabidopsis (D). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : As eficiências de coloração com o método da raiz-carga (raiz-corte e raiz-beliscando) e o método hypocotyl-beliscando. A eficiência de coloração em 9 DAS plantas foi determinada em três experimentos independentes (n = 26 no experimento raiz-pinching; n = 335 no experimento de corte radicular; n = 522 no método de hipocótilo-beliscar). Barra de erro indica erro padrão. indica p < 0, 1. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Estudos emergentes demonstraram que as plantas podem responder rapidamente aos estímulos externos23, incluindo a manipulação introduzida nos procedimentos experimentais22. Em nosso experimento inicial, nossa supervisão desse conhecimento muitas vezes leva a uma falha de coloração. Com estas lições, nós sugerimos que as seguintes precauções devam ser mantidas na mente ao executar esta experiência: (1) as sementes após a colheita devem ser mantidas em um armário de armazenamento ajustado a uma baixa temperatura e à baixa umidade; (2) a manipulação das plantas, particularmente a exposição ao ar no armário, deve ser mantida a um tempo mínimo; (3) as condições experimentais devem ser mantidas constantes, por exemplo, todos os procedimentos devem ser realizados em uma sala de crescimento.

Outro aspecto neste experimento que precisa ser apontado é que o volume de carga do CFDA deve ser mantido o mais pequeno possível. Solução em excesso, muitas vezes leva a artefatos em que o excesso de solução CFDA pode difundir até o tiro através da ação capilar, tingindo assim os tricomas de folhas de pia jovens. Embora um passo de lavagem antes da imagem possa diminuir este artefato, a melhor abordagem é carregar uma quantidade mínima para evitar complicações causadas por excesso de solução.

Com estas precauções técnicas resolvidas, o movimento root-to-shoot de CFDA pode ser observado estàvel como mostrado na Figura 2. Quando as plantas envelhecem, dizem que mais de 24 dias, as plantas Arabidopsis parecem perder a capacidade de transmitir CF para o tiro, para o qual ainda não encontramos uma explicação exata. Uma pista possível vem do seu acúmulo intracelular. De acordo com os relatos de Wright et al.2, CF é susceptível de ser sequestrado por vacúolos, portanto, o CF livre intracelular ao longo da translocação reduz gradualmente ao sequestro nos vacúolos maiores das plantas envelhecendo.

Uma característica óbvia deste procedimento é o padrão de distribuição de CF na filmagem. Este padrão vascular é uma reminiscência daqueles carregando o corante na folha de origem1,24,25, levando assim a uma ilusão de que o corante também se move através do floema. Na verdade, a translocação de baixo para cima de CF não pode ser alcançada através do floema dado o fato de que a raiz é um tecido de pia forte e o movimento shootward de CFDA vai contra o streaming de floema. Em vez disso, esse processo pode ser facilitado pelo transporte de xilema, como mostra Botha et al.25. Resumidamente, o CFDA pode ser tomado através de vasos de xilema, processados em células de parênquima e posteriormente translocated para o elemento peneira do fluxo de floema25. Portanto, o experimento de carga desta forma pode não refletir a atividade do floema, mas o movimento symplastic da FC deve ocorrer à medida que a fluorescência forte pode ser detectada. Em outras palavras, este movimento de CF de baixo para cima pode resultar do transporte combinado de xilema e do transporte symplastic através de células parenquimáticas.

O transporte Symplastic é frequentemente sujeito à formação Symplastic13do domínio, e em determinadas circunstâncias indica o transporte unidirecional19,20. Uma maneira para uma verificação rápida é deslocar os locais de carregamento. Na verdade, quando elaboramos esse processo utilizando o mesmo método, encontramos a simples mudança do local de carregamento, do lado radicular ao lado do hipocótilo proximal à junção raiz-hipocótilo, resultaria em mudança significativa da eficiência móvel do CFDA (Figura 3). A diferenciação móvel do CF devido aos locais de carregamento distintos sugeriria que a junção da raiz-hypocotyl fosse um outro domínio symplastic, onde a barreira symplastic fosse dada forma para os sinais de shootward raiz-derivados. Um projeto experimental mais adicional com outras moléculas é necessário explorar esta possibilidade.

Até agora, este método simples pode fornecer movimento shootward estável de CFDA. Esta característica pode mais ser explorada para distinguir plantas com o movimento root-to-shoot comprometido ou aumentado que foi estudado raramente.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (31671257) e Hubei centro de inovação colaborativa para a indústria de grãos (LXT-16-18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KNO3   Sinopharm Chemical Reagent 10017218
KH2PO4  Sinopharm Chemical Reagent 10017608
MgSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10013018
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent 20011160
MnSO4·H2 Sinopharm Chemical Reagent 10013418
Na2MoO4·2H2O Sinopharm Chemical Reagent 10019818
Boric Acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10024018
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent 10008218
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent 10007216
KI Sinopharm Chemical Reagent 10017160
FeSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10012118
EDTA  Sinopharm Chemical Reagent 10009717
NaOH Sinopharm Chemical Reagent 10019718
KOH Sinopharm Chemical Reagent 10017018
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent 10021418
Myo-inositol   MACKLIN I811835
Nicotinic Acid  MACKLIN N814565
Pyridoxine HCl MACKLIN V820447
Thiamine HCl MACKLIN T818865
Glycine MACKLIN G800880
Agar powder Novon ZZ14022
Fluorescence Microscope Zeiss Axio Zoom V16
Dissecting microscope SDPTOP SRE-1030
200μl pipette Dragon Laboratory Instruments 713111110000-20-200ul
2.5μl pipette Eppendorf 3120000011
Fine forceps  TWEEZERS ST-15
Parafilm PARAFILM PM-996
Stainless steel double-sided blade Gillette Platinum-Plus Double-Edge Blade

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References

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