Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Funktionalisering af atomkraften mikroskop Cantihåndtag med enkelt-T-celler eller enkelt-partikel for immunologisk enkelt celle kraft spektroskopi
Chapters
Summary July 10th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer en protokol til funktionalisere atomkraften mikroskop (AFM) cantihåndtag med en enkelt T-celle og perle partikel for immunologiske undersøgelser. Der vises procedurer til sonde af enkeltpar T-celle-dendritisk cellebinding med AFM og overvågning af makro Fages realtids cellulære respons på en enkelt fast partikel ved AFM med fluorescens dannelse.
Transcript
Denne protokol beskriver, hvordan man bedst kan fungere afM cantilevers ved hjælp af enkelte T-celler og faste partikler. Disse tips kan derefter bruges til at sonde enkelt-par dendritiske celle-T celle interaktioner og til at overvåge cellulære reaktioner af vægelsindet størrelse, henholdsvis. En væsentlig fordel ved denne teknik er, at det bruger en biokompænbar lim til enkelt T-celle funktionalisering af cantilevers.
Denne lim er inert til eukaryote celler, og dermed holde T-celler i deres baseline aktivering fase. Disse metoder giver indsigt i immuncelleaktivering og komplekse intercellulære hændelser, såsom immunsynapsedannelse. Metoderne kan også udvides til andre systemer, der involverer celle-celle eller celle-overflade interaktioner.
For en person, der er ny til denne teknik, er det vigtigt at sikre, at T-cellerne er i god stand før brug, og at de er forbehandlet med IL-2 natten over. Når du bruger den biokompiselige lim, skal du desuden bevæge dig hurtigt for at beskytte den mod unødvendig oxidation. For at starte denne procedure skal du forberede de enkelte T-celler til mikroskopi ved at følge med i tekstprotokollen.
Derefter forberede glas coverslips seedet med DC2.4 celler, og inkubere cellerne natten over i et befugtet kammer ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Ren blød, tipless cantilevers med en lav fjeder konstant ved hjælp af piranha behandling, plasma rengøring, eller UV-ozon rengøring. Derefter monteres den rensede cantilever til AFM-scanningshovedet.
Derefter forberede en ren prøve kammer, og fylde den med rent vand. Kalibrer cantilever i vandopløsningen ved først at køre en kraftkurve på glasunderlaget for at opnå cantilevers følsomhed. Derefter optage en termisk støj spektrum til at udtrække foråret konstant.
Når cantilever er korrekt kalibreret, skal du fjerne AFM-scanningshovedet fra opløsningen. Vask den monterede cantilever med et par dråber ren ethanol, og hold cantilever tør på scanningshovedet. Forvarm en levende celle miljø kabinet til 37 grader Celsius med 5% CO2.
Derefter monteres glasdækslæbet sået med DC2.4 celler til prøvekammerets samling, og tilsæt straks 600 mikroliter af medium B til kammeret. Placer den færdige samling på AFM-prøvestadiet. Der tilsættes HUMANE IL-2-inkuberede CD4-positive T-celler i prøvekammeret.
Vent, indtil de målrettede T-celler er helt afgjort i bunden af dækslæbet, og bring derefter cellerne ind i synsfeltet under mikroskopet. Nu tilsættes en to-mikroliter dråbe biokompænbar lim på enden af den monterede cantilever med en pipette. Når den biokomplicible lim er blevet påført cantilever, de efterfølgende trin skal være færdig så hurtigt som muligt for at maksimere vedhæftning.
Hurtigt placere scanning hovedet på prøven fase, nedsænkning lim-belagt cantilever i opløsningen. Flyt eksempelstadiet, indtil en sundheds-T-celle er placeret under spidsen af udkrævn. Juster derefter dens position fint ved at flytte scanningshovedet.
Sænk derefter cantilever manuelt. Begynd med en 50-mikron trin størrelse, og derefter falde til 10, fem og to og endelig 0,5 mikron gradvist, som angivet ved skarpheden af cantilever billedet. Hold nu steppermotorernes position nede, og juster placeringen af scanningshovedet for bedre at justere cantileverspidsen og cellen.
Fortsæt, indtil fast kontakt er angivet ved en lille forskydning af laserens position, svarende til en typisk kraft på 0,5 til 1,5 nanonewtons. Efter 30 sekunders kontakt trækkes cantileveren tilbage. Hvis cellen bevæger sig med kantilever, lykkedes det at vedhæfte den vedhæftede fil.
Hvis ikke, gentages vedhæftningstrinnet op til tre gange, før du skifter til en ny cantilever. Placer den vedhæftede T-celle over en DC2.4-celle ved at flytte prøvestadiet og scanningshovedet. Når du har konfigureret korrekte parametre, skal du køre kraftspektroskopi over prøven.
For en ny runde af sondering, montere en ny, ren cantilever. Kalibrer det i rent vand, og gå derefter tilbage til et T-celle-dendritisk cellepar, og gentag scanningen. Monter en renset glasdækslæd til prøvekammerets samling.
Til venstre side af coverslip, tilsæt en dråbe af en perleopløsning, der er blevet fortyndet i ethanol og indeholder seks mikron diameter polystyren perler. Når opløsningsmidlet fordamper, skal du kontrollere afstanden mellem perlerne ved hjælp af et skarpt feltmikroskop udstyret med et 20x mål. Sørg for, at de enkelte perler er godt adskilt.
Derefter dyppe en mikropipette spids eller en tandstikker i en godt blandet epoxy lim, og overføre en lille mængde af limen til tre separate pletter med successive blide rører på højre side, men tæt på midten af coverslip, som vist her. Dernæst montere en renset, tipless cantilever til AFM scanning hovedet, og kalibrere det i luften med en ren overflade for at opnå foråret konstant. Derefter placere cantilever spidsen over venstre grænse af den sidste epoxy lim stedet, og langsomt bringe cantilever tæt på limen ved hjælp af små trin størrelser på stepper motorer.
Når der er taget kontakt med limen, skal du hurtigt trække i cantilever sidelæns ved at flytte AFM-scanningshovedet bagud. Fjern eventuel overskydende lim ved at gnide den af mod glasset, så kun en lille mængde af limen i slutningen af spidsen. Flyt det cantilever tip oven på en velisoleret perle.
Nærme den enkelte perle langsomt, og gøre en fast kontakt med det i intervallet to til fem nanonewtons i ca 10 sekunder. Når du kommer i kontakt, skal du bruge justering med fin spids til at placere perle i slutningen af spidsen. Træk spidsen tilbage for enden af kontakten.
Hvis perle forsvinder fra det oprindelige brændpunkt, er der opstået en vellykket vedhæftningshændelse. Endelig afmontere perle-modificeret cantilever omhyggeligt, og gemme det i en cantilever boks natten over for epoxy til fuldt ud at helbrede. Her er typiske kraft-afstand kurver fra bindende interaktion mellem en enkelt T-celle og en enkelt dendritisk celle i løbet af en tilgang-tilbagetrækning cyklus.
Den lyse røde kurve er forlængelseskurven, og den mørkerøde er tilbagetrækningskurven. Minimumsværdien i kurven giver et mål for den maksimale vedhæftningskraft mellem T-cellen og dendritiske celle, og området under kurven repræsenterer det arbejde, der kræves for at adskille dem. De skarpe og trinvise brudhændelser kan fortolkes som membranstriske, der trækkes ud fra celleoverfladen på grund af den stærke binding ved cellecellegrænsefladen og derefter bryder diskret under den kontinuerlige træk.
Her vises konventionel T-cellebinding til dendritiske celler med grå, og regulerende T-cellebinding til dendritiske celler vises med blåt. Vedhæftningskræfterne mellem en konventionel T-celle og en regulatorisk T-celle genkender peptidantigener præsenteret af antigen-præsenterende celler, mens regulerende T-celler er suppressor T-celler, der lukker konventionelle T-celle-medieret immunitet mod slutningen af en immunreaktion. Denne skematisk af en fluorescently mærket, fagocytisk RAW264.7 celle viser cellen nærmer sig med en enkelt nøgen, seks-mikron diameter, polystyren perle.
Ved aktivering af perle sorteres membran PIP2 på kontaktstedet, nær b, som derefter inducerer membranrekruttering af moesin, hvilket resulterer i en fagocytisk hændelse. Ud over den procedure, der er beskrevet her, kan AFM-baserede encellede kraftspektroskopi bruges sammen med fluorescensscanning til at studere immuncelleaktivering i realtid på encelleniveau. Kombineret fluorescens teknikker, denne metode giver mulighed for at løse mere komplekse cellulære processer i realtid, såsom dannelsen af en immun synapse mellem dendritiske celle og T-celle par.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.