Funktionalisering av atomkraftmikroskop Cantispakar med Single-T-celler eller Single-partikel för immunologiska Single-cell Force spektroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att funktionalisera atomkraftmikroskop (AFM) cantispakar med en enda T-cell och pärla partikel för immunologiska studier. Procedurer för avsökning av enpar T cell-dendritiska cell bindning av AFM och för att övervaka realtid cellulära svar av makrofager till en enda solid partikel av AFM med fluorescens Imaging visas.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Atomic Force mikroskopi baserad Single cell Force spektroskopi (AFM-SCFS) är ett kraftfullt verktyg för att studera biofysiska egenskaper hos levande celler. Denna teknik gör det möjligt att sondera interaktions styrkor och dynamik på en levande cellmembran, inklusive de mellan celler, receptor och ligander, och tillsammans med många andra variationer. Det fungerar också som en mekanism för att leverera en fysisk eller biokemisk stimulans på enstaka celler i ett rumsligt kontrollerat sätt, vilket möjliggör specifik cell aktivering och efterföljande cellulära händelser som ska övervakas i realtid när de kombineras med levande-cell fluorescens-avbildning. Det viktigaste steget i dessa AFM-SCFS mätningar är AFM-cantilever funktionalisering, eller med andra ord, bifoga ett föremål av intresse för cantilever. Här presenterar vi metoder för att modifiera AFM-cantispakar med en enda T-cell och en enda polystyren-pärla respektive för immunologiska studier. Den förstnämnda innebär ett biokompatibelt lim som par enda T-celler till spetsen av en platt grenställ i en lösning, medan den senare förlitar sig på en epoxilim för enkel pärla vidhäftning i luftmiljön. Två immunologiska tillämpningar som är förknippade med varje grenställ modifiering finns också. De metoder som beskrivs här kan enkelt anpassas till olika celltyper och fasta partiklar.

Introduction

Atomic Force microskopi (AFM), ett mångsidigt verktyg, har funnit många tillämpningar inom cellbiologi forskning1,2,3,4,5. Bortsett från dess högupplöst avbildning förmåga, den infödda kraft-sondering funktionen kan biofysiska egenskaper levande celler som skall undersökas direkt på plats på encellig nivå6,7. Dessa inkluderar rigiditeter av subcellulära strukturer eller ens hela celler8,9,10,11,12, specifika ligand/receptor bindande styrkor vid enmolekylen nivå på cellytan13, och vidhäftning styrkor mellan enstaka par av fasta partiklar och celler eller mellan två celler1,2,14,15. De två sistnämnda kategoriseras ofta som Single-cell Force spektroskopi (SCFS)16. På grund av de lättillgängliga cantispakarna med olika vårkonstant, är kraft intervallet tillgänglig för AFM ganska bred från några piconewtons (pN) till micronewtons (μN), som på lämpligt sätt täcker hela sortimentet av cellulära händelser som involverar styrkor från några tiotal av pN, såsom receptor-baserad enkel molekyl bindning, till nN, såsom fagocytiska cellulära händelser15. Detta stora dynamiska kraft sortiment gör AFM fördelaktigt över andra kraft-sondering tekniker såsom optisk/magnetisk pincett och en Biomembrane kraft sond, eftersom de är mer lämpade för svaga kraftmätningar, med kraft typiskt mindre än 200 pN17 , 18. AFM kan dessutom fungera som en högprecisions manipulator för att leverera olika stimuli till enstaka celler i ett rumsligt definierat sätt4,19. Detta är önskvärt för realtid encells aktivering studier. Kombinerat med Live-cells fluorescens Imaging, den efterföljande cellulära svar på den specifika stimulansen kan övervakas samtidigt, vilket gör AFM-baserade SCFS ytterst robust som optisk avbildning ger ett praktiskt verktyg för att sond cellulära signalering. Till exempel, AFM användes för att bestämma de stammar som krävs för att framkalla kalcium transienter i osteoblaster20. I detta arbete, kalcium transienter spåras överföras genom kalcium ratiometriska Imaging efter applicering av lokaliserade styrkor på odlade osteoblaster med en AFM spets. Nyligen var AFM anställd för att sträcka kollagen fibriller på vilka hepatiska stellate celler (HSC) odlades och denna Mechano-transduced HSC aktiveringen var realtid övervakas av en fluorescerande src biosensor, vars fosforylering som representeras av fluorescensintensiteten hos biosensorn är korrelerad med HSC-aktivering3.

I AFM-baserade SCFS experiment är korrekt funktionalisering av AFM cantispakar ett avgörande steg mot lyckade mätningar. Eftersom vårt forskningsintresse fokuserar på aktivering av immunceller, funktionaliserar vi rutinmässigt cantispakar med partiklar som enstaka fasta partiklar som kan utlösa fagocytos och/eller starka immunsvar4,14 , 15 och enstaka T-celler som kan bilda en immun synaps med antigen presenterande celler, såsom aktiverade dendritiska celler (DC)2. Enstaka fasta partiklar kopplas normalt till en grenställ via ett epoxilim i luftmiljön, medan enstaka T-celler, på grund av sin icke-adhesiva natur, funktionaliseras till en grenställ via ett biokompatibelt lim i lösning. Här beskriver vi metoderna för att utföra dessa två typer av grenställ modifiering och ge två tillhörande applikationer också. Den första ansökan är att sond T cell/DC interaktioner med AFM-SCFS att förstå den suppressiva mekanismen av reglerande T-celler från cellmekanik synvinkel. Den andra innebär att kombinera AFM med levande cell fluorescens Imaging att övervaka cellulära svaret av makrofagen till en solid partikel i realtid för att avslöja den molekylära mekanismen för receptor-oberoende fosfatidylinositol 4,5-bisfosfoner (PIP2)- Moesin medierade fagocytos. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en referensram för intresserade forskare att utforma och genomföra sina egna experimentella inställningar med AFM-baserad encellsanalys för immunologisk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus experiment protokollet följer djurskötsel riktlinjerna från Tsinghua University

1. cantilever funktionalisering med enda T-celler

  1. Mus mjälte celler förberedelse
    1. Offra musen (8-16 veckors ålder (antingen kön); t. ex., C57BL/6 stam) med hjälp av koldioxid, följt av cervikal dislokation.
    2. Rengör musen med 75% etanol och gör en mittlinjen hud snitt följt av splenektomi.
    3. Homogenisera mjälten i 4 mL PBS som innehåller 2% fetalt bovint serum (FBS) med hjälp av glas bilder och ta bort aggregat och skräp genom att passera cellsuspensionen genom en 70 μm mesh nylon SIL.
    4. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i 2 ml av den röda blod cells lysbufferten (balanserad vid rumstemperatur) i 5 min. avsluta Lys reaktionen genom att tillsätta 8 ml PBS-lösning.
    5. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min och Omsuspendera celler med en densitet av 1 x 108 celler/ml i PBS innehållande 2% FBS och 1 mm EDTA (märkt som lösning a), typiskt 0,25-2 ml beroende på celltäthet. Överför de återsuspenderade cellerna till en 5 mL (12 x 75 mm) polystyren rund botten röret.
  2. Mus CD4 + T-celler förberedelse
    1. Tillsätt 50 μL/mL rått serum (se tabell över material) och 50 μl/ml CD4 + T-cell isolerings cocktail (se tabell över material) till det cellprov som erhålls från steg 1.1.5. Blanda och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    2. Vortex beståndet streptavidin-belagda magnetisk partikel lösning (se tabell över material) för 30 s eller tills partiklarna verkar jämnt spridda.
    3. Tillsätt 75 μL/mL streptavidin-belagda magnetiska partiklar till cell provet. Blanda och inkubera i 2,5 min vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt lösning A för att öka cell provet till 2,5 mL och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner för 2-3 gånger.
    5. Placera provröret (utan lock) i magneten (se tabell över material) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Häll försiktigt anrikad cellsuspensionen i en ny 5 mL polystyren rund-botten röret.
    6. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera de berikade T-cellerna i 500 μl lösning A.
      Anmärkning: de anrikade CD4 + T-cellerna innehåller både konventionella och regulatoriska T-celler.
  3. Regulatoriska T-celler separation från konventionella T-celler
    1. Tillsätt 25 μL FcR-blockerare (se tabell över material) till det anrikade T-cellsprovet som erhålls från steg 1.2.6. Blanda och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    2. Tillsätt 25 μL reglerande T-cell positivt urval cocktail (se tabell över material) till T-cellsprovet. Blanda och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    3. Tillsätt 10 μL blandning av PE-val (se tabell över material) till T-cellsprovet. Blanda och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    4. Vortex beståndet dextran-belagda magnetisk partikel lösning (se tabell över material) för 30 s eller tills partiklarna verkar jämnt spridda.
    5. Tillsätt 10 μL dextran-belagda magnetiska partiklar till T-cellsprovet. Blanda och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    6. Tillsätt lösningen A till toppen upp T-cellsprovet till 2,5 mL och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner för 2-3 gånger.
    7. Placera T-cellprovröret (utan lock) i magneten och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Häll försiktigt supernatanten till ett nytt rör.
      Anmärkning: supernatanten innehåller berikad konventionella CD4 + T-celler.
    8. Centrifugera de berikade konventionella CD4 + T-cellerna vid 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i 4 ml RPMI1640 innehållande 10% fbs, 0,05 mm β-merkaptoetanol, 0,01 M Hepes och 1% penicillin/streptomycin (märkt som medium B).
    9. Ta bort röret där regulatoriska T-celler är berikade från magneten. Tillsätt 2,5 mL lösning A till röret och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner för 2-3 gånger. Sätt tillbaka röret i magneten, inkubera i 5 min, och häll sedan försiktigt av och Kassera supernatanten. Upprepa detta steg tre gånger till.
    10. Omsuspendera de anrikade reglerande T-cellerna i 2 mL medium B.
    11. Inkubera både renade konventionella t-celler och reglerande t-celler med 100 U/ml hIL-2 över natten eller under minst 4 timmar vid 37 ° c i en fuktad inkubator med 5% Co2 innan den används för grenställ-funktionalisering.
  4. Dendritiska celler beredning
    1. Bered Piranha-lösning, en blandning av 30% H2O2 (30%) och 70% H2so4 (conc) (v/v). Häll långsamt 3 mL H2O2 i 7 ml h24 under ständig omrörning och kylning.
      FÖRSIKTIGHET: Piranha lösning är mycket frätande, och det kan bränna och förstöra kroppens vävnader. Därför är det säkrare att använda Piranha lösningen under en huva och bära lämplig säkerhetsutrustning, eftersom blandningen kommer att plaska runt bägaren. Neutralisera lösningen med NaOH till pH 7 efter användning.
    2. Sänk ned glas täckglaset med en diameter på 24 mm i Piranha-lösningen i 30 minuter och skölj sedan noggrant efteråt med det sterila ultrarent vattnet.
    3. Doppa ett par spetsiga pincetter i 75% etanol i 30 min för kall desinfektion.
    4. Introducera de rengjorda glas täckarna i en 6-brunn kultur tallrik av pincetten.
    5. Luta en 6 cm plast kultur skålen där DC 2.4-celler var pre-odlade med 4 mL medium B och aspirera alla medel. Tillsätt 2 mL PBS i odlings skålen för att skölja DC 2.4-cellerna och kassera PBS. Upprepa detta sköljsteg två gånger till.
    6. Tillsätt 1 mL 0,25% trypsin EDTA till kultur skålen för 2 min. Tillsätt 1 mL medium B till denna maträtt för att avsluta enzymet rötnings reaktion. Överför den smälta cellsuspensionen till en 15 mL tub.
    7. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min och Omsuspendera DC 2.4-celler med en densitet av 2 x 105 celler/ml i medium B.
    8. Seed DC 2.4-celler på glas täckarna beredda i steg 1.4.4 och inkubera cellerna över natten i en fuktad kammare vid 37 ° c med 5% CO2.
      Anmärkning: för att mäta samverkande krafter mellan två enskilda celler, en relativt låg koncentration av DC 2.4-celler (dvs < 10% confluency) är nödvändigt att ha ett korrekt mellanrum mellan celler.
  5. AFM grenställ förberedelse
    Obs: Cantispakar som är lämpliga för Single cell Force spektroskopi experiment är de med låg vårkonstanter, typiskt i intervallet 0,01-0,06 N/m. Här är mjuka spetslösa cantispakar att föredra för enstaka celler och enstaka fasta partiklar funktionalisering.
    1. Rengör cantispakarna med Piranha-behandling eller plasma-eller UV-ozon rengöring.
    2. Montera den rengjorda grenställ till AFM skannings huvudet.
    3. Förbered en ren provkammare fylld med rent vatten och kalibrera grenställ i vattenlösning genom att först köra en kraft kurva på glaset substrat för att få känsligheten (lutningen på den linjära passformen över den motbjudande delen av den annalkande kurvan) och sedan inspelning av ett termiskt brus spektrum för att extrahera fjädern konstant enligt AFM bruksanvisning.
    4. Ta bort AFM-skanningshuvudet från lösningen, tvätta den monterade grenställ med några droppar ren etanol, och hålla grenställ torr på skannings huvudet.
  6. Fästa enstaka T-celler till grenställ
    1. Värm levande cell miljö kapsling med 5% CO2 vid 37 ° c.
    2. Montera glaset täckglas med DC 2.4-celler som odlas på den från steg 1.4.8 till en provkammare församling, tillsätt 600 μL av medium B till kammaren omedelbart, och sedan sätta församlingen på AFM provet skede.
    3. Tillsätt hIL-2-inkuberade CD4 + T-celler (antingen konventionella eller regulatoriska T-celler) i provkammaren.
      Anmärkning: den totala provvolymen får inte överstiga 1 mL.
    4. Vänta tills den tillagda CD4 + T-celler är helt avvecklas på botten av täckslip.
      Anmärkning: luftbubblor kommer att orsaka stora störningar i experimentet, därför är det tillrådligt att undvika eventuella luftbubblor i steg 1.6.2 och 1.6.3.
    5. Tillsätt en droppe av 2 μl biokompatibelt lim på änden av den monterade grenställ med en pipett som visas i figur 1 och placera sedan skannings huvudet på prov stadiet snabbt, så att grenställ belagd med det biokompatibla limmet sänks ned i Lösning.
      Varning: Vidrör inte glas blocket eller grenställ med pipettspetsen. Eftersom det biokompatibla lim som används här är benägna att oxidation i luft, bör detta steg göras så snabbt som möjligt.
    6. Lokalisera en hälsosam T-cell under spetsen av grenställ grovt under mikroskopet genom att flytta provet scenen och sedan fint justera placeringen genom att flytta skannings huvudet.
      Anmärkning: en hälsosam CD4 + T-cell har vanligtvis en relativt stor storlek, släta kanter, och optiskt transmissiv i Bright-fältet Imaging.
    7. Lägre grenställ manuellt med kliva-storleksanpassar start från 50 μm därefter till 10, 5, 2 och 0,5 μm gradvist, genom att kontrollera stepper motorerna. Håll i positionen för steg motorerna och justera avläsnings huvudets placering för bättre uppriktning mellan uthutnings spetsen och cellen, när grenställ gör en fast kontakt med Target T-cellen som indikeras av en liten förskjutning av laserstrålen position i foto detektorn som motsvarar ett typiskt kraft område på 0,5-1,5 nN.
      ANMÄRKNINGAR: det här steget kan också göras genom att köra en enda kraftmätning där set-Point (kraften appliceras på cellen) och kontakttid kan vara väl definierade i programvaran. Men på grund av den icke-adhesiva karaktären av T-celler, ger den manuella metoden mer flexibilitet i att kontrollera sikte, positionering och kontakttid än den automatiska närmar sig och det fungerar tillförlitligt för T-cell adhesion. Framtida experimentalister bör prova både manuell och automatisk närmar sig att ta reda på som fungerar bättre för sina system av intresse.
    8. Dra tillbaka grenställ efter 30 s av kontakt.
      Obs: om cellen rör sig med cantilever, är den bifogade filen framgångsrik. Om inte, upprepa steg 1.6.6 men på en annan T-cell. Det biokompatibla limmet oxideras lätt. Steg 1.6.5-1.6.7 ska slutföras inom 5 minuter. Dessutom, om samma grenställ misslyckas tre gånger för T-cell kvarstad, en ny grenställ bör användas, och kvarstad förfarande bör börja från steg 1.5.2 igen.

Figure 1
Figur 1: schematisk representation av att lägga till en liten droppe biokompatibelt lim på den monterade cantilever. Uthådet monteras via en kläm fjäder på glas Blocks hållaren som monteras på AFM-skanningshuvudet (ej ritat här). När skannings huvudet står på en planad yta, är grenställ vertikalt orienterad som visas i ritningen. Ca 2 μl biokompatibelt lim kan läggas till spetsen på grenställ med en mikro-pipett. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Kraft spektroskopi av enpar T cell/dendritiska cell interaktion
    Anmärkning: att sond cell/cell interaktioner, en AFM med en Z-Range större än den konventionella 10-15 μm krävs för att helt separera de två cellerna. AFM används här har en Z-Range på 100 μm, vilket är tillräckligt för att separera T-cellen från dendritiska cellen efter cell/cell kontakt.
    1. Placera den bifogade T-cellen ovanför en separat DC 2.4-cell genom att flytta prov steget och/eller skannings huvudet (se figur 2).
    2. Ställ in korrekta parametrar och kör kraft spektroskopi.
      Obs: följande nyckelinställningar används vanligtvis: SetPoint 0,5 nN, drag längd 50 μm, Z-rörelse konstant hastighet, Förläng hastighet 5 μm/s, kontakttid 10 s, fördröjnings läge konstant kraft. För varje T-DC-par samlas 20 upprepningar av kraft kurvor och minst 14 kraft kurvor används för vidare analys.
    3. Montera en ny rengjord cantilever, kalibrera den i rent vatten som i steg 1.5.3 och gå tillbaka till samma T-DC cells-prov för att upprepa steg 1,6 och 1,7 för ett annat T-DC-par. Sond minst 5 par för varje tillstånd.

Figure 2
Figur 2: experimentell konfiguration av kraft-avsökning mellan en enda T-cell och DC. ASchematisk ritning av den experimentella konfiguration i vilken en T-cell som är fäst vid grenställ förs till en likström som odlas på underlaget för kraft avsökning. (B) ljus fälts bild av en T-cells-funktionaliserad grenställ och en DC. Skalstapel, 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. cantilever funktionalisering med enda polystyren pärlor

  1. Enstaka pärlor beredning
    1. Späd lager suspensionen av 6 μm polystyren pärlor i 100% etanol.
      Obs: koncentrationen av utspädd pärlor lösning bör vara tillräckligt låg så att när de läggs till en glastäckglas yta, enskilda pärlor är väl åtskilda utan betydande klustring efter lösningsmedels avdunstning.
    2. Rengör glas täckaren med 24 mm diameter med etanol och avlägsna eventuellt stoft med N2 -luftflöde.
    3. Montera den rengjorda glaset täckglas till en provkammare församling och sätta församlingen på mikroskopet.
    4. Sätt en droppe utspädda pärlor lösning till vänster sida men nära mitten av täckglas (se figur 3) och kontrollera avståndet mellan pärlorna efter lösningsmedel avdunstning i ljust fält under Mikroskop med en 20x mål. Fortsätt till nästa steg om enskilda pärlor är väl separerade.
    5. Doppa en micropipett spets eller en tandpetare i en väl blandad epoxilim och sedan överföra en liten mängd av sådant lim till tre separata platser med successiva mjuka inslag på höger sida men nära mitten av täckglassen.
      Obs: de tre limfläckarna ska vara vertikalt justerade (se figur 3). Den sista punkten med minsta mängd lim kommer att användas senare.

Figure 3
Figur 3: schematisk representation av arbetsflödet för singel-pärlor funktionalisering på cantilever. Väl separerade micron-stora pärlor är beredda på vänster sida av underlaget och en liten mängd epoxilim överförs på höger sida av underlaget genom 3 på varandra följande milda inslag, vilket resulterar i 3 lim fläckar. Endast den sista punkten med minsta mängd lim (indikeras av en cirkel) används för att belägga själva änden av cantilever. Närma sig grenställ i lim från vänster och sedan flytta grenställ bakåt när den är nedsänkt i limmet för att begränsa limmet i slutet av grenställ. Ta mål pärla under grenställ och anpassa dem ordentligt innan du gör en fast kontakt (typiskt 2-5 nN) för pärlvidhäftning. När pärlan framgångsrikt funktionaliseras på grenställ, kan en ny grenställ monteras för att starta en ny funktionalisering cykel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. AFM grenställ förberedelse
    1. Montera en rengjord spets-mindre grenställ till AFM skannings huvudet.
    2. Kalibrera denna grenställ i luften med en ren yta för att få fjädern konstant.
  2. Fästa enstaka pärlor på grenställ
    1. Placera grenställ spetsen över den vänstra gränsen för den sista epoxilimpunkten som visas i figur 3.
    2. Ta cantispaken nära limmet långsamt genom att sänka steg motorerna med små stegstorlekar.
    3. Dra loss cantispaken snabbt från limmet i sidled genom att flytta AFM skannings huvudet bakåt (till vänster) manuellt när spetsen är nedsänkt i limmet.
      Obs: se till att endast en liten mängd av limmet fastnar i slutet av spetsen. Om det finns överdrivet lim på spetsen, är det möjligt att minska mängden lim genom att röra följt av att skjuta spetsen på en tom yta.
    4. Flytta grenställ spetsen ovanpå en väl isolerad enda pärla.
    5. Närma sig grenställ till enkel pärla långsamt och göra en fast kontakt med pärlan (som indikeras av förskjutningen av laserstrålen position i fotodetektor som motsvarar ett typiskt kraft område på 2-5 nN) för ca 10 s under vilken en finjustering av t IP positionering sidled kommer att hjälpa bättre lokalisera pärla i slutet av spetsen. Dra tillbaka spetsen i slutet av kontakten.
      Anmärkning: försvinnandet av själva pärlan från det ursprungliga fokalplanet indikerar en lyckad anhängare händelse.
    6. Demount den pärla-modifierade grenställ försiktigt och förvara den i en grenställ rutan över natten för full stelning av limmet.
  3. Fluorescensavbildning av cellulär respons från makrofager till en enda pärla levererad av AFM.
    Obs: fluorescens Imaging utfördes på en hemlagad objektiv-typ totalt inre reflektion fluorescens Mikroskop baserat på ett kommersiellt Mikroskop stativ. Detta avbildningssystem är utrustat med 4 laserkällor (405 nm, 488 nm, 561 nm, 647 nm), en splitter visare för tvåfärgad detektering, och en elektron multiplicerande laddning kopplad enhet (EMCCD) för wide-fält Imaging.
    1. Odla rå 264.7 celler på en glastäckslip vid 37 ° c i en 5% CO2 fuktad kammare.
    2. Transfect moesin-egfp och plcδ-pH-mcherry till rå 264.7 celler med hjälp av en transfection Kit (se tabell över material) enligt tillverkarens protokoll till överföras visualisera moesin och fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) molekyler Respektive.
      Obs: Moesin har en ITAM motiv som kan aktivera SYK, en viktig aktör i fagocytos. PIP2 är känt för att rekrytera Moesin till cellmembranet.
    3. Sätt glaset täckglas med celler på en provkammare församling och montera församlingen på AFM provet skede.
    4. Montera pärlmodifierad grenställ till AFM skannings huvudet.
    5. Kör en kraft kurva i ett tomt område och kalibrera kraften med känsligheten från denna kurva och vårkonstanten mätt i steg 2.2.2.
    6. Hitta en väl isolerad cell med ordentlig fluorescens-intensiteter i både gröna (Moesin-EGFP) och röda (PLCδ-PH-mCherry) kanaler med 488/561 nm excitations.
    7. Leverera den nakna 6 μm polystyren pärla med AFM till cellytan med 1 nN konstant kraft och 500 s kontakttid.
    8. Spela in fluorescens bildserie av cellen i kontakt med pärlan för analys (typiskt 10 bilder/s).
      Anmärkning: för att minska photoblekning av fluorofomedel, en relativt låg excitation makt bör användas för att söka i cellerna av intresse. Dessutom kan en intermittent excitation system användas för att förlänga fluorescenstiden spår om dynamiken i cell svar är på en långsam tidsskala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4a visar typiska kraft-avstånd kurvor från bindning interaktion mellan Single-T cell och Single-DC i en metod-dra tillbaka cykeln. Den ljusröda kurvan är förlängnings kurvan och den mörkröda är den återgående kurvan. Sedan tilläggs kurvan används vanligt för indrag eller styvhet-analys, här endast angå retraktion buktar för cell adhesion. Minimivärdet (den gröna cirkeln) i kurvan ger ett mått på maximal vidhäftningskraft. Området under kurvan (skuggat område) representerar det arbete (energi) som krävs för att separera T-cellen från DC. Innan en fullständig separation, skarpa och stegvis bristning händelser observeras ofta. Detta tolkas som membran tjuder dras ut från cellens yta på grund av den starka bindningen vid cell/cell-gränssnittet och sedan bryta diskret under kontinuerlig dra. Antalet, höjden, och längden av stegen kan användas för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos cellmembranet21. För T cell-DC interaktioner, vi är intresserade av bindande styrka, alltså endast den maximala adhesionskraft analyseras för varje kurva. Figur 4b jämför vidhäftnings krafterna mellan konventionell t-cell (tconv)/DC och reglerande t-cell (Treg)/DC. Tconv känner igen peptidantigener som presenteras av antigen-presenterande celler som DC, medan Treg är suppressor T-celler som stänger av Tconv-medierad immunitet mot slutet av en immunreaktion. Klart, Treg visar mycket starkare bindning med DC än Tconv gör (se figur 4c). Detta är relaterat till differentiella omsättnings hastigheter för LFA-1 på T-cellytan mellan Treg och Tconv2. Den exakta mekanismen som reglerar detta är dock fortfarande under utredningen. Den starka bindningen av Treg till DC är förenlig med långa bindningstider mellan Treg och DC observerade in vivo22. Ännu viktigare, om en DC prebinder till en Treg, kan denna DC inte engagera en annan Tconv kraftfullt (data som inte visas), vilket leder till minskad T-cell grundning eller immun förtryck2. Således ger kraftmätningar på T-cell/DC-par ny insikt i den suppressiva mekanismen för Treg.

Figure 4
Figur 4: Treg-celler visar stark vidhäftning till DCS. (A) typiska kraft kurvor mellan en tconv-cell och en DC 2.4. Den ljusröda kurvan är förlängnings kurvan och den mörkröda kurvan är den återgående kurvan. Det minsta värdet av den mörkröda kurvan som indikeras av den gröna cirkeln är den maximala vidhäftningskraften. Det skuggade området representerar den energi som krävs för fullständig separation mellan de två cellerna. B) kraft avläsningar för T-celler av indikerade typer som interagerar med DC 2.4-celler. Varje T-DC-par har minst 14 kraft avläsningar och 5 oberoende DC-T-cellpar var sonderade för varje celltyp. Grå symboler är för Tconv-celler (5); Mörkblå, Treg-celler (5). Alla datapunkter samlades in samma dag. C. medel krafter av T-celler av indikerade typer som interagerar med DC 2.4-celler. Felstaplarna är SEM. * * *, P < 0,001 (Students t-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 visar hur den Fluorescent märkta FAGOCYTOS RAW 264.7 cell reagerar på en enda naken 6 μm polystyren pärla levereras av AFM4. Försökssystemet visas i figur 5a. PIP2 är märkt av PLCδ-PH-mCherry (röd) och Moesin är märkt av EGFP (grön) (se Figur 5b). Även om de är båda berikas på pärla/cell-gränssnittet, ansamling av Moesin i stor utsträckning spåras intensiteten förändringar av PIP2 som indikeras av kymograph tomter som visar intensitet profilerna som funktion av tid längs den angivna vita linjen i Figur 5c. Tillsammans med det faktum att Moesin kan binda till PIP2 via sin FERM domän23, resultatet här tyder på att vid engagerande pärla, membran PIP2 sorteras först vid kontakt platsen, som sedan inducerar membran rekrytering av moesin vars ITAM domän sedan aktiverar SYK-PI3K vägar, vilket resulterar i en fagocytos händelse. Således, en ny fagocytos väg som involverar PIP2-Moesin-SYK-axeln har identifierats och viktigast av allt, det beror inte på några receptorer på cellmembranet.

Figure 5
Figur 5: Moesin signalering är nedströms PIP2 sortering driven av den solida strukturen. (A) schematisk representation av fluorescensavbildning av granulum/cell kontakt med en pärla levererad av AFM. BpH-PLCδ-mcherry och Moesin-egfp var meduttryckta i rå 264.7 celler. En polystyren pärla användes för att kontakta cellytan. Bilder togs vid ett 6 s intervall för 500 s. Scale bar, 5 μm. C. lokalisering av PIP2 och Moesin på platsen för kontakt (indikeras med "*") undersöktes med kymographs genereras från den angivna linjen. Denna siffra har modifierats från4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM-baserade Single-cell Force spektroskopi har utvecklats till att vara ett kraftfullt verktyg för att hantera de biofysiska egenskaperna hos levande celler. För dessa tillämpningar, grenställ måste funktionaliseras korrekt för att avsöka specifika interaktioner eller egenskaper på cellerna av intresse. Här, metoderna för koppling enda T-cell och enda micron-storlek pärla till spetsen-mindre grenställ beskrivs respektive. För att fästa en enda T-cell till cantilever, valdes ett biokompatibelt lim som celllim. Det är en speciellt framtagen proteinlösning som utvinns ur marin mussla. Dess adhesivitet härstammar från polyfenolrester vars hydroxylgrupp kan bilda vätebindning med rester som exponeras på cellytan på ett ospecifikt sätt. Denna bindnings metod stör vanligtvis inte cell funktionerna i den bundna cellen. För korrekt vidhäftning är även villkoren för de celler som skall fästas viktiga. Vid nyrenad mus CD4 + T-celler, de måste först behandlas med mänskliga Il-2 över natten innan de kan användas för grenställ funktionalisering. Annars kommer de att genomgå celldöd ganska snabbt. Om cellerna inte är i goda förhållanden, även om de kan fästas på grenställ, kommer de troligen lossnar från grenställ efter bara flera cykler av kraft avsökning på grund av svagare vidhäftning styrka, vilket leder till en hög felfrekvens av kraftmätningar. Nackdelen med denna biokompatibla lim är att det är benägna att oxidation, därför kopplingen förfarandet måste slutföras så fort som möjligt, vilket kan vara utmanande ibland för operatörerna. För att reducera oxidationen av det biokompatibla limmet rekommenderas det starkt att man förbereder 30 μL alikvoter i kryogena injektionsflaskor fyllda med N2 -gas från stamlösningen i en N2 -luftmiljö och lagrar dem i flytande n2 för bästa prestanda . Viktigast av allt, detta biokompatibelt lim visar sig vara inert mot T-celler till skillnad från andra proteinbaserade lim såsom Fibronektin och lektiner som kan orsaka oavsiktlig receptor klustring i cantilever/cell kontaktzon och därigenom aktivera T-celler24 ,25,26. Således, effekterna av lim på cellerna av intresse måste experimentellt kontrolleras innan de kan användas för celladhesion. Detta gäller även andra cantilever-funktionaliseringssystem som förlitar sig på specifika molekylära erkännanden, såsom antigen/antikropp, biotin/streptavidin och Concanavalin A/carbohydrated-receptorer, för att koppla enstaka celler till cantilever.

För att söka i T-cells/DC-interaktioner valdes de optimerade parametrarna som anges i protokollet (steg 1.7.2) för Force-spektroskopi. Bland dem är värdet för set-Point och kontakttid de två nyckelparametrarna. I allmänhet börjar optimeringen av Set-Point med små värden (0,1-0,2 nN). För cell-/cellinteraktion leder ett högt inställt värde (> 2 nN) till stor deformering av celler och ett stort kontakt område. Detta resulterar normalt i en stor vidhäftningskraft avläsning. Dock kommer den sonderade kraft från både specifika och ospecifika interaktioner vid cell/cell-gränssnittet på grund av den komplicerade karaktären av cellytor, som i viss utsträckning, skalor med kontaktytan. Därför, ju större värde för set-punkt, desto större bidrag av icke-specifika interaktioner. Den senare är vad som bör minimeras i alla kraftmätningar. Dessutom, för att lära sig om icke-specifika interaktioner, kontrollkraft mätningar såsom att använda specifika antikroppar eller knockout (eller knockdown) celler för att blockera specifika interaktioner av intresse måste övervägas för att få basal kraft avläsning vid givna set-point värden . Detta kommer att bidra till att identifiera de specifika interaktionerna i test mätningarna. När det gäller kontakttid, beror det på den tidsskala vid vilken sonderade molekylära eller cellulära händelser äger rum. Därför är förhandskännedom om händelserna av intresse viktigt. I fall av T cell/inaktiverade DC interaktioner, adhesion molekyl LFA-1 på T-cell och ICAM-1 på DC bildar ett bindnings par. Denna intermolekylär bindning sker ganska snabbt när de två motsvarigheterna är i position, men det tar tid för molekylerna att diffusion till rätt ställen på cellmembranet där motsvarigheten molekyler är redo för bindning, en diffusions begränsad process. Därför sätter vi 10 s av kontakttid för att tillåta flera LFA-1/ICAM-1 bindnings par att bildas enligt skjuvning flöde experiment av bongrand Group27,28. Även om en längre tid kan ställas in, vid en viss punkt, längre tid inte hjälper när limbildning är mättad vid gränssnittet. Dessutom kan långa kontakttider resultera i nedströms cellulära svar som inte kan vara av intresse. Å andra sidan, om vissa cellulära händelser är av intresse, såsom fagocytos händelse som beskrivs i den andra ansökan där pärlan var delvis uppslukas av makrofage, lång kontakttid är absolut nödvändigt.

För att samla tillräckligt med statistik, 20 upprepningar av kraft kurvor samlades in för varje T-cell/DC par och minst 14 styrkor kurvor användes för maximal vidhäftning kraft analys. Minst 5 par testades i varje testgrupp. För att ta bort exempel historier, endast färska T-cell/DC-par var probed, vilket innebär att de valda T-celler och DCs för sondering hade ingen kontakthistorik med några andra celler. Även om ovanstående förfarande gör de övergripande experimenten tid-och kostnadskrävande, är det kanske det rätta sättet att utföra sådana kraftmätningar på T-cell/DC-par.

Fästa enstaka pärlor till grenställ är relativt lätt jämfört med cell-funktionalisering på grenställ. Eftersom epoxi lim med olika stelnings tider finns på marknaden, är det möjligt att välja en epoxilim med en lång stelningstid, typiskt på ordningen av timmar. Detta gör att flera pärlmodifierade cantispakar att förberedas i ett pärlprov. Alternativt kan en UV-botas lim användas, vilket kan förkorta härdningstiden betydligt, ca 10 min under UV-ljus28. Oavsett vad lim används, är det enda kritiska steget i hela protokollet att fästa en minsta mängd lim till spetsen av cantilever. Överskottet lim kommer inte bara begrava pärla lätt, vilket gör att cellen interagerar med lim i stället för pärlan under mätningen, men också ändra den mekaniska egenskapen av cantilever, vilket gör Force-kalibrering felaktig. Därför är det viktigt att kontrollera kontaktytan mellan grenställ och lim så att endast en liten mängd av limmet är begränsad i slutet av grenställ. Den metod som beskrivs här är också tillämplig på andra micron-stora fasta partiklar, såsom monokatrium urat Crystal15, Alun14, och kolesterol Crystal29.

Bortsett från Force-sondering, AFM kan också leverera en fysisk eller kemisk stimulans till cellerna och efterföljande cellulära händelser kan övervakas överföras i realtid, vilket framgår av den andra ansökan. Detta öppnar en stor möjlighet att ta itu med spatiotimligt mer komplicerade biologiska händelser, såsom bildandet av immunologiska synaps30, som inte kan karakteriseras i realtid av konventionella metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China General program (31370878), State Key program (31630023) och nyskapande Research Group program (81621002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD? Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2, (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214, (2), 327-338 (2017).
  3. Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16, (12), 1252-1261 (2017).
  4. Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
  5. Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
  6. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5, (6), 383-390 (2009).
  7. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21, (8), 461-469 (2011).
  8. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103, (3), 386-394 (2012).
  9. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38, (8), 824-833 (2007).
  10. Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75, (6), 1327-1336 (2010).
  11. Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50, (1), 81-92 (2005).
  12. Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60, (2), 202-213 (2013).
  13. Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286, (18), 15973-15979 (2011).
  14. Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17, (4), 479-487 (2011).
  15. Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29, (5), 807-818 (2008).
  16. Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121, (11), 1785-1791 (2008).
  17. Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (11), 7426-7431 (2002).
  18. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68, (6), 2580-2587 (1995).
  19. Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11, (8), 1237-1253 (2014).
  20. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82, (6), 2970-2981 (2002).
  21. Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89, (6), 4320-4329 (2005).
  22. Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214, (2), 319-326 (2017).
  23. Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184, (3), 451-462 (2009).
  24. Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89, (3), 439-445 (1992).
  25. Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11, (6), 475-483 (1981).
  26. Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165, (2), 132-146 (1983).
  27. Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76, (3), 594-602 (2004).
  28. Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9, (5), 1049-1055 (2014).
  29. Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  30. Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17852-17857 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics