비장 세포 생물학 및 이식 면역을 연구 하기 위한 혈관 화 된 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델

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Summary

이 프로토콜은 비장 세포의 운명과 장 수를 연구 하는 강력한 도구 역할을 하는 기술적으로 도전적인 모델 인 바소 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델의 수술 단계를 자세히 설명 하 고, 별개의 비장의 메커니즘 세포 집단은 질병 진행 및 이식 면역에 있다.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

비장은 면역 및 조 혈 시스템의 항상성에 중요 한 역할을 하는 독특한 림프 기관. 원인에 관계 없이 비장 절제술을 받은 환자는 압도적 인 사후 비장 절제술 감염을 개발 하 고 깊은 정 맥 혈전 증과 악성 종양의 증가 위험을 경험 하는 경향이 있다. 최근, 역학 연구는 비장 절제술은 심혈 관 질환의 발생과 관련 될 수 있음을 표시, 비장의 생리 적 기능이 아직 완전히 인식 되지 않은 것을 시사. 여기서, 우리는 혈관 화 된 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델을 소개 하 고,이는 상이한 생물학적 과정에서 비장 면역 세포 서브 세트의 기능 및 행동 활동을 연구 하기 위해 활용 될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 시험 하는 강력한 도구가 될 수 있다 특정 질병에서 비장 이식의 치료 잠재력. 이 모형의 주요 외과 단계는 기증자 비장 수확, 수령인 기본 비장의 제거, 및 비장 접목 혈관 신생을 포함 합니다. 콘 제 닉 마우스 균 주를 사용 하 여 (예를 들면, 마우스 CD 및 CD를 가진 생쥐), 우리는 신 유전학 이식 후에, 기증자 유래 비장 림프 구와 골수성 세포가 이식 수술의 날 초기에 접목에서 이전 된 것을 관찰 했습니다. 여러 유형의 받는 사람 세포의 유입, 따라서 독특한 키메라를 생성.  비교적 어려운 기술에도 불구 하 고,이 절차는 > 90% 성공률으로 수행 할 수 있습니다. 이 모델은 비장 유래 면역 세포에 대 한 별개의 역할을 발견 할 수 있는 좋은 기회를 제공 하 여 정상 상태 및 비장의 이식에 따라 질병 설정 시의 운명, 장 수 및 기능을 추적 허용 다른 질병 과정.

Introduction

비장 본문에 가장 큰 보조 림프 장기 이며 면역 및 조 혈 시스템에 중요 하다. 그 기능은 주로 두 가지 형태학 적으로 별개의 구획, 적색 펄프 및 백색 펄프1에 의해 수행 된다. 적색 펄프는 망상 섬유, 망상 세포 및 관련 대 식 세포로 구성 된 정 맥 공동 및 비장 코드의 입체 메시 작업입니다. 이 독특한 구조는 붉은 펄프가 외국 물질과 오래 되거나 손상 된 적혈구를 제거 하는 효과적인 혈액 필터 역할을 할 수 있습니다. 백색 펄프는 모 낭을 포함 하 고, 한계 구역 및 periarteriolar 림프의 보호관 (PAL) 및 항 원 포착 및 처리, 림프 구 유도, 변환, 증식 및 성숙에 대 한 중요 한 사이트입니다2. 그럼에도 불구 하 고 비장은 림프절과 같은 다른 림프 기관이 기능을 수행 할 수 있으며 비장의 손실이 일반적으로 사망으로 이어지는 것이 아니기 때문에 일반적으로 분배 가능한 기관으로 간주 되었습니다. 비장 절제술 따라서 널리 비장 부상 또는 양성 혈액 질환 환자에 대 한 치료 방법으로 수행 된3. 그러나, 비장 절제술을 가진 환자는 많은 장기 합병증을 직면 합니다. 세균 감염은 비장 절제술의 최고 인식 합병증 이다4,5. 최근, 압도적인 후 비장 절제술 패 혈 증은 높은 사망률과 관련 된 비장 절제술의 집중적 인 합병증으로 인식6. 더욱이, 최근의 역학 연구는 비장 절제술이 심혈 관 질환의 발생과 관련 될 수 있음을 나타내며, 비장의 추가 생리 기능을 탐구 하는 것을 제안7,8.

비장 자동 이식 및 비장 allotransplantation 모두 클리닉에서 활용 되었습니다. 현재, 비장에 의해 자동 이식 큰 전조에 만든 파우치에 비장 조직의 섹션을 이식 하 여 외상 비장 절제술 후 비장 기능을 보존 하기 위한 유일한 가능성으로 간주 됩니다9,10. 그러나이 수술의 효능은 수술 후 합병증으로 인해 비장 조직의 무 균 괴 사와 수술 후 유착으로 인 한 작은 창 자 폐색이 발생할 수 있습니다 (11). 비장 allotransplantation 다중 내장 이식12에 관여 합니다. 다중 내장 이식 으로부터의 임상 증거는 비장 allotransplantation 이식 편대 숙주 질환 (GVHD)을 유발 하지 않고 작은 창 자 이식 거부에서 보호 역할을 할 수 있음을 시사한다. 그러나 다중 내장 이식의 구성 요소로 서 비장 allotransplantation의 유익한 효과에 관한 문학은 여전히 제한적 이며 근본적인 기전이 정의 될 수 있다. 2006에서, Yair Reisner et은 마우스에 T 세포가 없는 배아 비장 조직을 이식 하 여 혈우병을 치료할 수 있다고 보고 하였으며, 유전자 질환 인 GVHD (13)를 유발 하지 않고, 비장 이식이 치료 약속을 보유 하 고 있음을 지지 한다 특정 질병. 따라서, 비장 이식의 치료 가능성에 대 한 추가 조사에 대 한 필요성이 있다.

비장 이식의 동물 모델은 비장 이식의 잠재적 인 치료 효과를 테스트 할 뿐만 아니라 질병 진행에서 비장 유래 면역 세포의 비 평가 기능을 탐구 하는 것이 중요 합니다. 실험적인 전체 비장 이식 모델은 코헨14에 의해 검토로 1900 년대 초 이후 문서화 되었습니다. 1969, coburn 리처드 j.와이 외. 쥐에 비장 이식의 기술15,16. 더 최근, 소용돌이 스키 FK 외. 비장 이식17의 마우스 모델을 설명 했다. 쥐 모델에 비해, 비장 이식의 마우스 모델은 여러 가지 고유 한 장점으로 인해 더 매력적 이다. 예를 들어, 마우스 모델을 활용 하 여 쥐 모델에서 사용할 수 없는 광대 한 다양 한 시 약 들에 접근할 수도 있습니다. 또한, 콘 제 닉 마우스 (예를 들어, CD를 사용 하는 마우스, 예컨대)를 이용 하 여 비장이 식은, 비장 (18)의 운명, 장 수 및 기능을 추적 하는 것을 가능 하 게 한다. 소용돌이 스키 FK 외에 의해 작업을 기반으로17, 우리는 또한 쥐에 비장 이식의이 간단 하 고 향상 된 프로토콜을 설립. 아래에 설명 된 프로토콜은 신뢰성과 타당성을 표준화 된 방식으로 결합 하 고 비장 생물학 및 이식 면역을 연구 하는 도구로 활용할 수 있습니다.

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Protocol

이 연구에서 모든 절차와 동물 사용은 노스웨스턴 대학 내부 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행 되었습니다. 본 연구에서, 8 ~ 10 주 남성 CD 72.8 및 CD 45.1 마우스 (둘 다의 BALB/c 배경, 잭슨 실험실에서)는 각각 비장 기증자 및 수혜자로 사용 되었으며, 신 제네 비장 이식 모델을 생성 하였다. 모든 동물은 노스웨스턴 대학의 동물 시설에서 무 균 환경에 보관 되었다. 안구 윤활제는 건조를 방지 하기 위해 마 취 후 모든 마우스에 적용 되었다.

1. 외과 준비, 마 취 및 진통 요법

  1. 외과 용 플랫폼에 멸 균 일회용 드 레이프 (45.7 x 66)를 놓습니다. 마우스를 살짝 잡고 케 타 민 (50 밀리 그램)과 자일 라 진 (10mg/kg) 복 강 내을 마 취 하 고 진통에 대 한 0.05 mg/kg 부 프레 노르 핀을 주사 합니다.
  2. 발가락 핀치에의 한 마 취의 깊이를 확인 하 고, 면도기로 전체 복 부 영역에서 머리를 면도 하 고 6-10 배 확대에서 작동 현미경 아래 멸 균 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다.

2. 기증자 비장 수확

  1. 알코올 준비 패드로 복 부를 소독 하 고, 수술 테이프로 사지를 고정 하 고,가 위를 사용 하 여 장티푸스 프로세스에 3-4 cm 중간 수직 피부 절 개를 만듭니다.
  2. 종이 클립으로 만든 멸 균 견인 기를 사용 하 여 복 벽을 후퇴 시킵니다. 비장을 노출 하는 살 균 면봉으로 복 부 (외과 의사의 왼쪽) 측의 오른쪽 측면에 내장을 이동 합니다. 비장에 부착 된 짧은 위 맥을 멸 균 저온 소 작으로 소 작을 (도 1a). 비장에 37 ° c 생리 식 염 수를 적신 살 균 거 즈 조각을 넣고 촉촉한 상태로 유지 합니다 (그림 1b).
  3. 문맥을 분리 하 여 췌 장 조직 (도 1c) 으로부터 정 맥을 리 팅 하 여 문맥 분기 (우수한 pancreaticoduodenal 정 맥 및 우측 위 정 맥); 비장 정 맥에서 말단을 문맥 주위에 봉합 사를 놓습니다 (그림 1d).
  4. 비장 동맥 (그림 1e)와 대동맥 및 체 강 트렁크를 노출 하는 오른쪽에 비장의 플립. 간 동맥 및 위 동맥을 결 찰 하 여 대동맥-체 강-비장 동맥을 분해 하 고 동원 하십시오; 대동맥 근 위부 주위에 봉합 사를 부 강 동맥 (그림 1f-G)에 놓습니다.
  5. 100 국제 단위 (IU) 헤 파 린을 열 등 한 대 정 맥 (IVC)에 주사 하 여 몸 전체를 heparinize 후 헤 파 린이 효과를 확인 하기 위해 3 분간 기다리십시오. 대동맥을 체 강 동맥으로 하 고, 문맥을 변환 하 고, 복 부 대동맥에서 혈장 콜드 (4°c) 생리 식 염 수 (10ml/20s)를 사용 하 여 몸 전체를 전신에 사용 합니다 (그림 1h).
  6. 비장 정 맥의 세그먼트와 췌 장 조직의 작은 부분과 함께 관련 된 대동맥-체 강-비장 세그먼트 및 문맥 정 맥과 함께 구획 이식 편 블록을 수집 합니다. 이식 전에 4°c의 염 분 5 mL에 접목을 보존 한다. 경 추 탈 구에 의해 마우스를 안락사.

3. 수령인 비장 절제술 및 비장 접목 이식

  1. 수술 플랫폼에 발열 패드를 놓고 온도를 37 ° c로 조절 합니다. 멸 균 수술 플랫폼을 만들 수 있는가 열 패드의 상단에 살 무는 드 레이프 (45.7 x 66)를 놓습니다. 수술 준비 및 마 취를 위해 2.1 및 2.2 단계를 반복 하십시오. 2.1 단계 및 2.2 단계에서 설명한 바와 같이 3-4 cm 중간 선 절 개를 하 고 복 벽을 후퇴 시킵니다.
  2. 조심 스럽게 수용자의 비장을 노출 하는 살 균 면봉으로 마우스의 오른쪽에 장을 이동 합니다. 비장 정 맥과 동맥을 ligate 하 고 비장의 제거.
  3. 조심 스럽게 마우스의 왼쪽 측면에 내장을 이동 하 고 젖은 거 즈 (살 균 37 ° c 염 수로 적신)와 함께 내장을 커버. 인프라 대동맥 및 IVC의 요 추 분기를 분해 하 고 리 게이트; 두 개의 4mm 미세 혈관 클램프를 사용 하 여 인프라 대동맥과 IVC를 교차 클램프 합니다.
  4. 11-0 나일론 봉합 사는 인프라 대동맥 (전체 두께)을 통과 하 고, 마이크로가 위를 사용 하 여 단일 절단으로 타원형 대동맥 절제술을 만듭니다 (길이는 기증자의 지름과 일치 해야 합니다. 그림 2a). IVC를 사용 하 여 30g 바늘을 관통 하 여 타원형의 venotomy를 만들고 마이크로가 위를 사용 하 여 정 맥 일치 길이를 기증자 포털로 확장 합니다 (그림 2a).
  5. 혈장 염 (10 단위/m l)의 500 μ l를 사용 하 여 내 알루 민산 혈액 또는 혈전 (대동맥 및 IVC)을 지웁니다.
  6. 비장 이식 부를 받는 쥐의 오른쪽 측면에 배치; 기증자의 대동맥 커 프와 기증자의 문맥을 주의 깊게 확인 하십시오. 혈관이 꼬여 있지 않은지 확인 한 후, 비장을 차가운 (4°c) 염 수로 적신 거 즈로 덮으 십시오.
  7. 기증자의 대동맥 커 프를 수령인의 대동맥 절제술의 근 위 및 말단 꼭대기에 연결 하십시오 (아래와 같은 2 개의 스테이 봉합 사 (11-0 나일론 봉합 사). 기증자의 대동맥 커 프와 수용자의 아오 도교 절제술 (그림 2d) 사이에 연속 11-0 나일론 봉합 2-3 물기를 사용 하 여 문 합을 합니다. 비장 이식 편을 받는 사람의 왼쪽으로 돌립니다. 기증자의 대동맥 커 프와 받는 사람의 대동맥 절제술 (그림 2e) 사이의 문 합을 확인 하십시오.
  8. IVC의 내부에 4 ~ 5 물린 연속 봉합 사를 사용 하 여 기증자의 포털 정 맥을 수령인의 IVC의 후부 벽에 연결 하는 문 합을 수행 하 고 IVC 외부의 봉합 사를 닫으십시오 (그림 2fG).
  9. 용기 클램프를 해제 하 고 비장 색상을 복구 할 때까지 출혈을 탬 핑 하기 위해 멸 균 면봉을 사용 하십시오 (그림 2h).
  10. 연속 패턴의 5-0 합성 흡수 성 비 릴 봉합으로 복 부를 닫으십시오. 중단 된 패턴의 5-0 나일론 봉합 사로 피부 층을 닫으십시오.
    참고: 4.7-4.8 단계에서 기증자의 문맥 및 수령인의 IVC 사이에 문 합을 먼저 하십시오 (단계 4.8); 그런 다음 대동맥의 내부에 2 ~ 3 개의 연속 봉합을 사용 하 고 대동맥의 외부에 봉합 사를 닫아 기증자의 대동맥 커 프와 수령인의 대동맥 절제술의 후방 벽 사이에 문 합을 만드십시오.

4. 동물 회복

  1. 복 부를 닫은 후 4 개의 별도 위치 (0.25 mL/위치)를 통해 1 mL의 따뜻한 식 염 액을 피하에 주입 하십시오.
  2. 처음 몇 시간 동안 온도 조절 인큐베이터 (30°c)에 마우스를 보관 하 고, 충분 한 의식이 회복 될 때까지 마우스를 모니터 한 다음, 일반 식품과 물을 사용 하 여 새 깨끗 한 케이지에 마우스를 옮겨가 열 패드 (30°c )이 케이지 아래에 있습니다. 마우스 수술 후 별도의 케이지에 보관 하십시오.

5. 수술 후 통증 관리

  1. 진통 처방을 유지 하기 위해 0.05 mg/kg 부 프레 노르 핀 피하 24 h 및 48 h 후 수술을 주입 하십시오.

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Representative Results

마우스 비장 이식의 전체 절차는 경험 있는 마이크로 외과 의사에 의해 90 분 이내에 완료 할 수 있습니다. 우리 실험실은 쥐에서 100 비장 이식 이상을 수행 했습니다. 성공률은 90% 이상입니다, 모두의 생존에 의해 정의 된 마우스와 비장 후 수술 일 (포드) 1 또는 포드 7 (우리의 연구 종점)에 접목. 비장 이식의 생존은 비장 세포의 거시적 외관 및 유 세포 분석기 분석에 의해 확인 되었다. 우리의 경험을 바탕으로, 비장 이식 편이 괴 사 된 경우 비장 세포의 대부분이 죽은 것 처럼 유 세포 분석 (살아있는/죽은 세포 생존 분석)은 비장 이식의 생존 여부를 결정 하는 데 매우 민감합니다. 이 절차의 기술적 과제, 일반적인 합병증 및 문제 해결은 표 1에 요약 되어 있습니다.

이식 편 형태학을 시험 하기 위해이 식을 후, 하 모 톡 실린 및에 오신 (H & E) 염색은 포드 1 및 포드 7에서 BALB/c 마우스의 비장이 소부 이식에서 수행 하였다. 대표 사진은 그림 3에 나와 있습니다. 비장이 소 이식의 구조는 첫 번째 수술 후 주 동안 그대로 유지. 적색 펄프, 백색 펄프 및 한계 구역은 여전히 명확 하 고 구별이 없었다. 비장 이식 후 세포 이동을 조사 하기 위해 포드 1과 포드 7에서 유 세포 분석을 수행 하 여 비장이 소 이식, 림프절, 혈액 및 골 수에서 백혈구의 표현 형을 검사 했습니다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 포드 1에서, 51의 ± 7% (이 하와 동일한 평균 ± SD)를 공여 체 유래 및 46 ± 3%의 수용자 유래 하였다. 포드 7에서, 기증자 유래 백혈구는 총 비장 세포의 32 ± 10%를 차지 하 고, 수용자 유래 세포는 56 ± 13%까지 하였다. 우리는 또한 비장 백혈구가 1 일째에 림프 노드, 혈액 및 골 수로 이주 하 고 7 일째 (도 4b)에서 유지 되는 것을 관찰 하 여 비장 밀매 연구에 유용한 독특한 키메라를 생성 하였다.

표 1: 문제 해결 방법.

Figure 1
그림 1: 기부자 비장 수확. (A) 비장에 부착 된 짧은 위 맥을 소 작을. (B) 살 균 된 따뜻한 젖은 거 즈를 비장 위에 놓고 촉촉한 상태로 유지 합니다. (C) 췌 장 뒤에 문맥을 분해 하 고 분리 합니다. (D) 문맥에서 측 분 지를 리 게이트 하 고 봉합 사를 배치 하 여 원 위부를 비장 정 맥으로 둥글게 한다. 파선은 수신자 IVC와의 문 합을 위해 나중에 transecting 위치를 나타냅니다. (E) 비장 동맥을 포함 하 여 그 가지와 대동맥과 체 강 트렁크를 노출 하는 복 부 (외과 의사의 왼쪽)의 오른쪽에 걸쳐 비장의 플립. (F) 다른 두 가지를 결 리 하 여 대동맥-체 강 비장 동맥을 분해 하 고 동원 합니다. (G) 대동맥 주위에 봉합 사를 위치 시켜 체 강 동맥에 근 위부를 배치 합니다. 점선은 나중에 수용자 복 부 대동맥으로 문 합에 사용 되는 위치를 나타냅니다. (H) 대동맥을 결 찰 한 후에 문맥을 정 맥 한 후, 대동맥을 통해 혈장 염 수가 10ml의 비장이 식을 사용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 비장 이식 이식. (A) 대동맥과 ivc를 분리 하 고 교차 클램핑 한 후, 대동맥과 ivc에서 종 방향 대동맥 절제술과 venotomy를 각각 확인 하십시오. (D&B) 비장이 식을 복 부의 오른쪽에 놓습니다 (외과 의사의 왼쪽). 지속적인 봉합의 2-3 물기를 사용 하 여 기증자 대동맥 팔목과 수령인의 대동맥 절제술의 전방 벽 사이의 끝-측면 문 합을 확인 합니다. (E) 비장 이식 편을 수령인의 좌측 측면으로 돌립니다. 기증자 대동맥 팔목과 수용자의 대동맥 절제술의 후부 벽 사이에 이전 절차를 반복 하 고 대동맥의 외부에 봉합 사를 닫습니다. (에프-G) 기증자 포털 정 맥과 받는 사람의 IVC의 후부 벽 사이에 종단간 문 합을 하 고 IVC의 내부에 4 ~ 5 물린 연속 11-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여 IVC의 외부에 봉합을 닫습니다. (H) 문 합을 완료 한 후 용기 클램프를 해제 하 고 면봉을 놓아 출혈을 멈추게 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
도표 3:1 일째 및 7 일째에 비장이 소 이식의 대표적인 조직학 후 수술. Syn유전학 비장 이식은 BALB/c 마우스를 사용 하 여 수행 하였다. 비장이 소 이식 제를 1 일째 및 7 일째에 수확 한 후 이식 후 10% 포 르 말린 48 h. H & E 염색을 위해 파라핀이 포함 된 조직 절편을 이용 하 여 실시 하였다. 대표적인 조직학은 비장이 소 이식 1 주일 후 이식에 그대로 유지 하는 것을 보여준다. 스케일 바 = 250 μ m. 포드, 수술 후 하루. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4:유전학 비장 이식에 의해 만들어진 키메라. 3 개의 신 유전학 비장 이식 부를 수혜자로 서 BALB/c CD 72.7 마우스를 이용 하 여 기증자 및 BALB/c CD 72.6 마우스를 사용 하 여 수행 하였다. 수용자 마우스의 비장 이식, 피, 림프절 및 골 골 재 (BM)를 1 일째 및 7 일차 이식 후에 수확 하였다. 세포의 표현 형을 분석 하기 위해 단일 세포 분리 및 유 세포 분석 분석이 수행 되었다. (A) 표시 된 샘플에서 기증자 또는 받는 사람-유래 백혈구의 비율을 보여주는 대표적인 도트 플롯 (살아있는 싱 게에서 게이팅). (B) 상기 표시 된 샘플에서 공여 체 유래 세포에 표시 된 모집단의 백분율 (평균 ± SEM)을 1 일과 7 일째에 나타내 었 습니다. 포드 = 수술 후 일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조도 1: 대표적인 플롯 (n=3)은 이식 된 비장, 림프절, 혈액 및 골 골에서 공여 체 유래 림프 구와의 백분율을 나타낸 것 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 그림 2: 대표적인 플롯 (n=3)은 이식 된 비장, 림프절, 혈액 및 골 골에서 공여 체 유래 CD11b + Ly6C + 단 핵 세포의 백분율을 나타낸 것 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

강력한 증거가 나왔다 비장 유래 단 핵 구는 동맥 경화 증 등의 멸 균 염증 과정에서 중요 한 역할을 한다19, 급성 허 혈 성 뇌 (20 ) 또는 폐 부상18뿐만 아니라 심근 I/R 부상 및 리 모델링21,22,23. 이 보고서는 심혈 관 질환이 중요 한 (특히 그것은 세계적으로 번호를 하나의 살인자입니다 주어진) 많은 만성 질환에서 비장의 아래 인식 역할을 강조 표시 합니다. 비장 이식의 마우스 모델 다양 한 질병에 비장 파생 된 면역 세포 뿐만 아니라 그들은 비장에 프라이 밍 하는 방법의 역할을 발견할 수 있는 좋은 기회를 제공 합니다. 예를 들어, 비장 이식의 마우스 모델을 사용 하 여, 소용돌이는 허 혈 성 심근 손상에 응 하 여, 비장 유래 단 핵 구는 그들의 운동 성을 증가 하 고, 비장에서, 손상 한 조직에 고착 하 고,에 기여 하는 것을 발견 했습니다 상처 치유17. 더욱이,이 모델은 비장 및 기본 메커니즘에 성숙한 면역 세포의 longevities를 해결 하 고 비장 이식의 치료 잠재력을 탐구 하는 데 유용.

이 프로토콜의 성공 여부를 개선 하기 위해 몇 가지 측면을 고려해 야 합니다. 첫째, 마우스 무게, 변형 및 건강 상태가 수술 단계 및 실험 결과의 어려움에 영향을 줄 수 있기 때문에 설계 과정에서 적절 한 실험 동물을 선택 하는 것이 중요 합니다. 저희 연구소는 출혈로 인 한 사망률을 줄이기 위해 25 g 이상의 체중을 가진 8 ~ 12 주 된 쥐를 사용 하는 것이 좋습니다. 둘째, 비장 수확 과정에서 비장 혈관을 너무 많이 조작 하면 사육 또는 혈관 경련이 쉽게 발생 하 고 잠재적으로 비장 이식에 있는 마이크로 혈전 증이 발생할 수 있습니다. 수술 전에 마우스 복 부의 해부학에 익숙해 얻는 것은 학습 과정을 가속화 하는 데 도움이 될 것입니다. 셋째, 수용자 수술을 하는 동안 비장 접목은 항상 습기와 시원 함을 유지 해야 합니다. 비장 이식의 적절 한 보호는 이식 후 허 혈/재 관류 (I/R) 부상을 감소 시키고 이식 후 이식 실패를 예방할 수 있다. 또한, 문 합을 위한 기증자 혈관이 상대적으로 긴 것을 고려 하 여, 비장이 이식 되기 전에 적절히 위치 하는 것은 혈관의 비틀림을 방지 하는 것이 중요 하다. 또한, IVC의 수용자 대동맥 절제술 및 venotomy의 직경은 적절 한 혈 류를 보장 하 고 혈전 증을 방지 하기 위해 항상 기증자와 문맥 정 맥의 것과 비교할 수 있어야 합니다.

비장 이식의 평균 저장 시간은 4°c 식 염 수가 약 10 분 정도 이다. 총 허 혈 시간은 최소 이식 실패를 보장 하기 위해 50 분 미만으로 제한 되어야 한다. 우리는 위스콘신 대학 (UW) 차가운 저장 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다 비장 접목을 보존 하기 위해, 이상 경우 1 h 감기, 허 혈 시간 연구에 필요한. 췌 장의 작은 부분이 비장과 밀접 하 게 부착 되 고 비장 이식 편 으로부터 전체를 제거 하려는 시도는 쉽게 이식 또는 혈관 합병증을 유발 하 고 작동 시간을 현저 하 게 증가 시킨다는 점에 유의 해야 합니다. 우리는 비장 접목에 부착 된 췌 장 조직이 비장 이식 편으로 남아 있는 POD 7에서 위축 될 것 이라고 관찰 했습니다. 비장 이식에 부착 된 췌 장 조직을 제거 여부는 연구 목적에 따라 달라 집니다.

콘 제 닉 마우스의 가용성은 이식 후 비장 세포, 기증자 대 수용자의 기원을 추적 하는 것을 가능 하 게 만들었다. 본 연구에서, 우리는 비장 기증자 및 수혜자로 서 BALB/c CD 72.7 및 BALB/c CD 45.1 congenic 마우스를 사용 하 여 신 유전학 비장 이식 모델을 제작 하였다. 이러한 내성 마우스 균 주 사이의 기관 또는 조직 이식이 널리 기원 및 면역 시스템의 개발을 추적 하는 데 사용 되어왔다. 최근 NK 세포 반응에 영향을 미치는 CD 45.1과 관련 된 점 돌연변이에 관한최근의 보고에도 불구 하 고, 이들 균 주 조합 간에 이식 거부 반응이 보고 되지 않았다. 우리는 포드 1에서 즉시 발생 하는 비장 이식에 받는 세포의 실질적인 유입을 관찰 했습니다. 그것은 받는 사람 세포가 이식 I/R 부상에 반응 하는 가능성이 대부분의 받는 세포는과 립 적혈구 이었다. 우리의 결과는 비장 림프 구의 상대적으로 높은 비율은 기증자 근원의 남아 있다는 것을 보여주었습니다. 더 흥미롭게,이 림프 구는 그밖 림프 구획 (림프절, 골 수 및 순환)에 있는 (다시 채워집니다)로 이주 했습니다. 이러한 사실 인정은 spleens에서 유래 된 림프 구가 적응 면역에서 매우 중요 하다는 것을 추측 하는 것을 우리에 게 묻습니다. 그러나, 적응 대 타고 난 면제에 있는 비장 림프 구의 명백한 역할을 묘사 하기 위하여 더 많은 조사가 필요 합니다 (그림 4, 보충 그림 1 보충 그림 2).

이 프로토콜의 주요 제한은이 기술을 습득 하기 위해 제한 된 미세 수술 경험이 있는 개인을 위한 광범위 한 미세 수술 교육이 필요 하다는 것입니다. 전체 마우스 고체 장기 이식 모델 (예: 마우스 심장, 폐 또는 신장 이식)에서 우리의 학습 경험을 바탕으로, 그것은 능숙 하 게 마스터 하는 새로 훈련 된 사람 (어떤 실험적인 미세 수술 기술 없이)를 위해 6-10 달이 걸릴 수 있습니다 기술. 심장의 마우스 모델에 비해, 또는 신장 이식,이 모델은 기증자 절차 동안 비장 접목을 분리 하는 추가 조직 해 부 단계를 포함 하기 때문에 더 어려울 수 있습니다. 또한 기증자 문맥 (약 0.6 mm)의 지름은 IVC 보다 작기 때문에 문 합이 더 어려워집니다. 또 다른 제한은 접목 된 비장이 나중 이식 단계 (예: 포드 60)에서 수용자 세포에 의해 대규모로 침략 될 경우에는 명확 하지 않다는 것입니다. 그러나,이 모델은 또한 몇 가지 내재 된 장점에 대 한 매우 매력적 이다. 첫째로, 쥐와 인간은 유사한 게놈의 상당한 범위를 공유 하 고, 따라서 실제적인 신청의 상대적으로 정확한 표현을 허용 합니다. 더욱이, 비장 조직의 절편을 사용 하는 비 혈관 화 된 비장 자동 이식의 마우스 모델과 비교 하 여,이 혈관 화 된 비장 이식 모델은 비장 조직의 무 균 괴 사와 같은 합병증을 개발 하기에는 덜 수술 후 유착으로 인 한 작은 창 자 방해.

비장 이식의 마우스 모델에 의해 이전에 보고 된 소용돌이 스키 FK 외. 그러나, 상세한 내용은 설명 하지 않았다.  우리의 연구는이 기술을 따르도록 관심 연구원에 대 한 마우스 비장 이식의 포괄적 인 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 프로토콜에 의해 보고서에 설명 된 몇 가지 불필요 한 단계를 제거 소용돌이 스키 FK 외. (예: 담 관 결 찰) 및 11-0 봉합 사를 소개 합니다,이는 수술 시간을 단축 하 고 출혈을 방지 하는 데 도움이 될 것입니다.

결론적으로이 모델은 병원 체, 부상, 염증 또는 이식 거부에 대 한 반응으로 비장 세포 인구의 메커니즘을 탐구 하는 강력한 도구가 될 수 있으며 비장의 치료 잠재력을 테스트 하는 데 유용 합니다. 이식. 적절 한 훈련과 실습을 통해이 절차를 > 90% 성공으로 수행할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 노스웨스턴 대학 종합 이식 센터와 자원 및 자금 지원을 위한 의학 연구 코어 프로그램의 Feinberg 학교 감사 합니다. 구체적으로, 유 세포 분석 및 조직학 서비스는 노스웨스턴 대학교 유 세포 분석 핵심 시설과 마우스 조직학 및 표현 형 실험실에 의해 제공 되었으며, 각각은 로버트 H에 게 수 여 되는 NCI P30-CA060553에 의해 지지 되 고 있다. 루 리 종합 암 센터. 이 원고를 교정 해 주셔서 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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