血管化异位脾移植小鼠模型在脾细胞生物学和移植免疫研究中的应用

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Summary

该协议详细介绍了血管化异位脾移植小鼠模型的手术步骤, 这是一种技术上具有挑战性的模型, 可作为研究脾脏细胞命运和寿命的有力工具, 而脾脏是不同脾脏的机制细胞群在疾病进展, 和移植免疫。

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

脾脏是一个独特的淋巴器官, 在免疫和造血系统的稳态中发挥着至关重要的作用。已接受脾切除术的患者, 无论沉淀原因如何, 都容易出现压倒性的脾切除术后感染, 并经历深静脉血栓形成和恶性肿瘤的风险增加。最近, 流行病学研究表明, 脾切除术可能与心血管疾病的发生有关, 这表明脾脏的生理功能尚未得到充分认识。本文介绍了一种小鼠血管化异位脾移植模型, 该模型不仅可用于研究脾脏免疫细胞亚群在不同生物过程中的功能和行为活动, 而且可以作为检测的有力工具脾脏移植治疗某些疾病的潜力。该模型的主要手术步骤包括供体脾收获、供者原生脾脏切除和脾移植血运重建。使用同源小鼠菌株 (例如, 具有 cd45. 半 CD45.2 背景的小鼠), 我们观察到, 在同种异体移植后, 捐献者衍生的脾淋巴细胞和骨髓细胞早在术后第1天就从移植物中移出, 并与多种类型的接收细胞的涌入, 从而产生一个独特的嵌合体。 尽管技术相对具有挑战性, 但这一过程可以用 & gt;90 的成功率来完成。该模型允许跟踪脾细胞在稳定状态下和脾脏移植后的疾病设置中的命运、寿命和功能, 从而提供了一个很好的机会来发现脾脏衍生免疫细胞的独特作用。不同的疾病过程。

Introduction

脾脏是人体最大的继发性淋巴器官, 在免疫和造血系统中至关重要。它的功能主要是由两个形态上不同的隔间, 红色纸浆和白色纸浆1。红色牙髓是由网状纤维、网状细胞和相关巨噬细胞组成的静脉窦和脾脊髓的三维网状结构。这种独特的结构使红色的果肉作为一个有效的血液过滤器, 去除异物和旧的或损坏的红细胞。白色牙髓包括卵泡、边缘区和动脉周围淋巴鞘 (ALS), 是抗原捕获和处理、淋巴细胞归巢、转化、增殖和成熟2的重要部位。然而, 脾脏通常被认为是一个可有可无的器官, 因为其他淋巴器官, 如淋巴结, 也可以执行其一些功能, 脾脏的丧失通常不会导致死亡。因此, 脾切除术已被广泛用作脾损伤或良性血液疾病患者的一种治疗方法3。然而, 脾切除术的患者面临着一些长期的并发症。细菌感染是脾切除术4,5 的最佳公认并发症。最近, 压倒性的脾切除术后脓毒症已被认为是脾切除术的一个密集的并发症与高死亡率6。此外, 最近的流行病学研究表明, 脾切除术可能与心血管疾病的发生有关, 这表明脾脏的进一步生理功能仍有待探索 7,8

脾脏自体移植和同种异体脾移植在临床上都得到了应用。目前, 脾脏自体移植通过植入部分的脾脏组织在大动量产生的袋被认为是唯一的可能性, 以保持脾功能后外伤性脾切除 9,10.然而, 这种手术的疗效是值得商榷的, 手术后并发症, 如脾组织无菌坏死和小肠梗阻, 由于术后粘连可能发生11。同种异体脾移植参与脏器移植12。多脏器移植的临床证据表明, 同种异体脾移植可能在小肠同种异体排斥反应中起保护作用, 而不会引起移植物抗宿主病 (GVHD)12。然而, 关于同种异体脾移植作为多脏器移植成分的有益效果的文献仍然有限, 其潜在机制仍有待界定。2006年, Yair Reisner 等人报告说, 将没有 T 细胞的猪胚胎脾脏组织移植到小鼠身上可以治愈血友病 A, 这是一种没有引起 GVHD13的遗传性疾病, 支持脾脏移植具有治疗作用。某些疾病。因此, 有必要进一步研究脾脏移植的治疗潜力。

脾脏移植动物模型对于探讨脾脏免疫细胞在疾病进展中的不欣赏功能以及测试脾脏移植的潜在治疗效果具有重要价值。正如科恩14号所评论的那样, 自20世纪初以来, 已经记录了整个实验性的脾脏移植模型。1969年, coburn richard j. 和 lee 等人详细介绍了1516 大鼠的脾脏移植技术。最近, Swirski FK 等人描述了一个小鼠脾脏移植17模型。与大鼠模型相比, 小鼠脾脏移植模型由于其固有的几个优点而更具吸引力。例如, 通过使用鼠标模型, 我们可以访问大鼠模型所无法获得的各种试剂。此外, 通过使用同源小鼠 (例如, 具有 cd45. NCD45.2 背景的小鼠), 同种异体脾脏移植可以跟踪脾细胞18 的命运、寿命和功能。在 Swirski FK 等人的工作基础上,我们进一步建立了这种简化和增强的小鼠脾移植方案。下面描述的协议以标准化的方式将可靠性和可行性结合起来, 可作为研究脾脏生物学和移植免疫的工具。

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Protocol

本研究中的所有程序和动物使用都是根据西北大学内部动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。在这项研究中, 8 至10周龄的男性 CD45.2 和 CD45.1 小鼠 (均为 balb1 背景, 杰克逊实验室) 分别作为脾脏捐献者和接受者, 建立了同种异体脾脏移植模型。所有的动物都被安置在西北大学动物设施的无菌环境中。眼睛润滑剂应用于所有小鼠麻醉后, 以防止干燥。

1. 手术准备、麻醉和镇痛制度

  1. 将无菌一次性悬垂 (45.7 厘米 x66 厘米) 放置在手术平台上。轻轻抓住小鼠, 注射氯胺酮 (50 mg/kg) 和木胺 (10mg变 kg) 腹腔 (i. p) 进行麻醉, 并注射 0.05 mg/kg 丁丙诺非进行镇痛。
  2. 通过脚趾捏, 用剃须刀剃须整个腹部区域的头发, 并将鼠标放在无菌手术平台上的手术平台上, 在6-10x 的放大倍率下, 确保麻醉的深度。

2. 供体脾收获

  1. 用酒精准备垫消毒腹部 , 用手术胶带固定四肢 , 用剪刀做一个 3 - 4 厘米的中线垂直皮肤切口 , 从到小皮过程。
  2. 用纸夹制成的无菌牵引器收回腹壁。将肠子移动到腹部 (外科医生的左侧) 一侧, 用无菌棉签暴露脾脏。用无菌低温烧焦的方法小心附着在脾脏上的短胃静脉 (图 1 a)。将一块用37°c 盐水浸泡的无菌纱布放在脾脏上, 使其保持湿润 (图 1 b)。
  3. 通过结扎门静脉分支 (上胰十二指肠静脉和右胃静脉), 将门静脉从胰腺组织 (图 1c) 中分离和动员;在与脾静脉远端的门静脉周围放置缝合线 (图 1d)。
  4. 将脾脏向右翻转, 将主动脉和腹腔主干与脾动脉暴露 (图 1e)。通过结扎肝动脉和胃动脉来解剖和动员主动脉脾动脉;在腹腔动脉近端的主动脉周围放置一个缝合线 (图 1F-g)。
  5. 将100个国际单位 (IU) 肝素注入下腔静脉 (IVC), 对全身进行肝素化治疗, 并等待 3分钟, 以确保肝素生效。将主动脉近端与腹腔动脉连接, 横切门静脉, 然后使用从腹主动脉远端到腹腔主干的10毫升肝素冷 (10l·20 s) 盐水灌注整个身体 (图 1h)。
  6. 收集脾脏移植与相关的主动脉-腹腔脾段和门静脉, 以及部分脾静脉和胰腺组织的一小部分。移植前将移植物保存在5°c 盐水中的5毫升中。通过颈椎脱位使老鼠安乐死。

3. 接受脾切除术和脾移植

  1. 将加热垫放置在手术平台上, 并将温度调整为37°c。将无菌悬垂 (45.7 厘米 x66 厘米) 放在加热垫的顶部, 创建无菌手术平台。重复步骤2.1 和2.2 进行手术准备和麻醉。如步骤2.1 和步骤2.2 中所述, 做一个3-4 厘米的中线切口并收回腹壁。
  2. 用无菌棉签小心地将肠道移动到老鼠的右侧, 以暴露受者的脾脏。结扎脾静脉和动脉, 切除脾脏。
  3. 小心地将肠道移动到小鼠的左侧, 用湿纱布覆盖肠道 (用无菌37°c 盐水浸泡)。解剖和结扎肾下主动脉和 IVC 的腰椎分支;用两个4毫米微血管夹夹住肾下主动脉和 IVC。
  4. 将11-0 尼龙缝合穿过肾下主动脉 (全厚度), 然后缩回, 通过使用微剪刀的单一切口创建一个椭圆形主动脉体 (长度应与供体主动脉的直径相匹配,图 2 a)。使用 30 G 针刺穿 IVC 以创建椭圆静脉切开术, 并使用微剪刀将开口延伸到供体门静脉匹配长度 (图 2a)。
  5. 用500μl 的肝素化盐水清除腔内血液或血块 (主动脉和 IVC) (10 Units/ml)。
  6. 将脾脏移植放置在受者小鼠腹部的右侧;仔细识别供者的主动脉袖口和供者的门静脉。在确保血管没有扭曲后, 用用冷 (4°C) 盐水浸泡的纱布覆盖脾脏移植物。
  7. 将供者的主动脉袖口连接到受者主动脉切开术的近端和远端, 并有两个保持缝合线 (11-0 尼龙缝合线, 如下图2B, c)。在供者的主动脉袖口和受者的主动脉切开术 (前壁) 之间进行2-3 咬连续11-0 尼龙缝合的吻合 (图 2d)。将脾脏移植物翻转到受者的左侧;在供者主动脉袖口和受者主动脉腔 (后壁) 吻合 (图 2e)。
  8. 进行吻合, 将供者的门静脉连接到受者 IVC 的后壁, 在 IVC 内侧使用4至5段连续缝合, 然后关闭 IVC 外部的缝合线 (图 2F, g)。
  9. 松开血管夹具, 使用无菌棉签来止血, 直到脾脏颜色恢复 (图 2h)。
  10. 关闭腹部与5-0 合成可吸收的维克里尔缝合在一个连续的模式。用5-0 尼龙缝合在中断的图案关闭皮肤层。
    请注意:对于步骤 4.7-4.8, 或者, 在供者的门静脉和接受者的 IVC 第一步 (步骤 4.8) 之间进行吻合 (步骤 4.8);然后在供者的主动脉袖口和受者主动脉切开术后壁之间进行吻合, 在主动脉内侧使用2至3个连续缝合线, 并关闭主动脉外部的缝合线。

4. 动物恢复

  1. 关闭腹部后, 通过4个不同的位置 (0.25 mll 位置), 在皮下注入1毫升的温盐。
  2. 手术后的头几个小时, 将鼠标放在温控孵化器 (30°C) 中, 监控鼠标, 直到它恢复了足够的意识, 然后将鼠标转移到一个新的清洁笼子, 有一个定期的食物和水, 并有一个加热垫 (30°C)) 在笼子下面。将小鼠手术后关在一个单独的笼子里。

5. 手术后疼痛管理

  1. 术后注射 0.05 mg/kg 丁丙诺非24小时和 48小时, 以维持镇痛方案。

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Representative Results

有经验的显微外科医生可以在90分钟内完成小鼠脾脏移植的整个过程。我们的实验室已经在小鼠身上进行了100多次脾脏移植。成功率超过 90%, 定义为受者小鼠和脾脏移植到术后日 (POD) 1 或 POD 7 (我们的研究终点) 的生存率。脾脏移植的存活得到了脾脏细胞宏观外观和流式细胞仪分析的证实。根据我们的经验, 流式细胞仪分析 (liveydead 细胞活力检测) 是非常敏感的, 以确定脾脏移植是否存活, 因为如果脾脏移植是坏死的脾脏细胞将是死的。表 1总结了此过程的技术挑战、常见的复杂情况及其故障排除。

为检测移植后的移植形态, 在 POD 1 和 POD 7 的双小鼠脾脏异接枝中进行了血毒性素和 Eosin (H & E) 染色。有代表性的图片如图 3所示。脾脏异移术的结构在术后第一个星期保持完整。红色的纸浆, 白色的纸浆, 和边缘区仍然是清晰和可区分的。为研究脾脏移植后的细胞迁移, 在 POD 1 和 POD 7 上进行流式细胞仪检查脾脏异移、淋巴结、血液和骨髓中白细胞的表型。如图 4 a所示, 在 pod 1, 51±7% (平均±sd, 与下图相同) 的脾脏细胞是供体衍生的, 46±3% 是沉淀者衍生的。在 POD 7 中, 供体衍生白细胞占脾脏总细胞的 32±10%, 由受体衍生的细胞高达56±13%。我们还观察到脾脏白细胞早在第1天就迁移到淋巴结、血液和骨髓中, 并在第7天 (图 4B) 保持, 产生了一个独特的嵌合体, 对脾细胞贩运研究有价值。

表 1:故障排除方法.

Figure 1
图 1: 供体脾脏收获.(A) 小心附着在脾脏上的短胃静脉。(B) 在脾脏上放置一小块无菌的温暖湿纱布, 使其保持湿润。(C) 解剖和分离胰腺后面的门静脉。(D) 将门静脉的侧支结扎, 并在静脉远端与脾静脉的门静脉周围进行缝合。虚线表示后来与受者 IVC 吻合的位置。(E) 将脾脏翻转到腹部右侧 (外科医生的左侧), 以暴露主动脉和腹腔主干及其分支, 包括脾动脉。(F) 通过结扎另外两个分支来解剖和动员主动脉-腹腔脾动脉。(G) 在腹腔动脉近端的主动脉周围放置缝合线。虚线表示后来用于与接受者腹主动脉吻合的位置。(H) 结扎主动脉并横切门静脉后, 将脾脏移植物与10毫升肝素化盐水通过主动脉进行灌注。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 脾脏移植.(A) 在隔离和交叉夹紧主动脉和 ivc 后, 分别在主动脉和 ivc 中进行纵向主动脉切开术和静脉切开术。(B-D)将脾脏移植放在腹部右侧 (外科医生的左侧)。在供体主动脉袖口和受者主动脉切开术前壁之间进行端到端吻合, 使用2-3 口持续缝合。(E) 将脾脏移植物转向受者的左侧;重复前面的程序之间的供体主动脉袖口和后壁的受者的主动脉切开术, 并关闭主动脉外的缝合线。(F-G)在供体门静脉和受者 IVC 后壁之间进行端到端吻合, 在 IVC 内侧使用4至5段连续的11-0 尼龙缝合, 然后关闭 IVC 外部的缝合。(H) 完成吻合后, 松开血管夹具, 并放置一些棉芽, 以帮助止血。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 术后第1天和第7天脾脏异移的代表性组织学.利用 balb1 小鼠进行了合成脾脏移植。在移植后的第1天和第7天收获脾脏异移物, 并在10% 福尔马林中固定 48小时. h & E 染色是用石蜡包埋组织切片进行的。代表性组织学显示, 脾脏异植体在移植后1周保持完整。刻度杆 = 250 微米。POD, 手术后的一天。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:由同种异体脾脏移植产生的嵌合体。以 balb1 cd45.2只小鼠为供者, balb% Cd45.1只小鼠为受者进行了三种同种异体脾脏移植。在移植后第1天和第7天采集受者的脾脏移植、血液、淋巴结 (LN) 和骨髓 (BM)。采用单细胞分离和流式细胞仪分析的方法对细胞表型进行分析。(A) 代表性点图 (从活单块中门控), 显示捐献者或受者获得的白细胞在所示样本中的百分比。(B) 第1天和第7天所述样本中所示种群中所示种群的百分比 (平均±sem)。POD = 术后一天。请点击这里查看此图的较大版本.

补充图 1: 代表性图 (n = 3), 显示移植脾脏、淋巴结、血液和骨髓中供者衍生淋巴细胞与受体衍生淋巴细胞的百分比.请点击此处下载此文件.

补充图 2: 代表性图 (n = 3), 显示移植脾脏、淋巴结、血液和骨髓中供者衍生 CD11b+Ly6C+monocytes 与受者衍生的百分比.请点击此处下载此文件.

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Discussion

令人信服的证据表明, 脾衍生单核细胞在无菌炎症过程中发挥着重要作用, 如动脉粥样硬化19、急性缺血性脑20或肺损伤18, 以及心肌 isr 损伤和改造21,22,23。这些报告突出表明, 脾脏在许多慢性病中的作用被低估, 其中心血管疾病是重要的 (特别是考虑到它是全球头号杀手)。脾脏移植的小鼠模型提供了一个很好的机会, 可以发现脾脏衍生免疫细胞在各种疾病中的作用, 以及它们是如何在脾脏中引种的。例如, 通过使用脾脏移植的小鼠模型, Swirski 等人发现, 在对缺血心肌损伤的反应中, 脾脏衍生单核细胞增加了它们的活力, 从脾脏迁移出来, 粘附在受伤组织上, 并有助于伤口愈合17。此外, 该模型可用于解决脾脏成熟免疫细胞的长期性及其潜在机制, 并探索脾脏移植的治疗潜力。

为提高本议定书的成功程度, 应考虑到几个方面。首先, 在设计过程中选择合适的实验动物是至关重要的, 因为小鼠的体重、应变和健康状况会影响手术步骤和实验结果的难度。我们的实验室建议使用体重超过25克的8至12周大鼠来降低出血可能造成的死亡率。其次, 在脾脏收获过程中, 过多的脾脏血管操作很容易导致脾脏移植的繁殖或血管痉挛, 并有可能导致脾脏移植的微血栓形成。手术前熟悉小鼠腹部的解剖结构将有助于加快学习过程。第三, 在接受者手术中, 脾脏移植应始终保持湿润和凉爽。适当保护脾脏移植可减少移植缺血再灌注损伤, 防止移植后移植失败。此外, 考虑到吻合的供体血管相对较长, 在吻合术前正确定位脾脏移植对于防止血管扭曲至关重要。此外, 受者主动脉切开术的直径和 IVC 静脉切开术的直径应始终与供体主动脉和门静脉的直径相当, 以确保适当的血液流动和预防血栓形成。

在4°C 盐水中, 脾脏移植的平均储存时间在10分钟左右。总缺血时间应限制在50分钟以下, 以确保最低限度的移植失败。我们建议使用威斯康星大学 (UW) 的冷藏溶液来保存脾脏移植, 如果超过1小时的冷, 缺血时间是需要的研究。需要注意的是, 胰腺的一小部分与脾脏紧密相连, 并试图从脾脏移植中取出整体, 很容易导致移植或血管并发症, 显著增加手术时间。我们观察到, 附属于脾脏移植的胰腺组织在 POD 7 时会发生萎缩, 尽管有些胰腺组织在脾脏移植中仍然有效。是否切除与脾脏移植相连的胰腺组织取决于研究目的。

有能力的同源小鼠有可能跟踪脾脏细胞的起源, 供体与移植后的受者。在这项研究中, 我们使用 Balbscd45.2 和 balb1 Cd45.1 同源小鼠作为脾脏供体和接受者, 以建立一个同种异体脾脏移植模型。这些同种异体小鼠之间的器官或组织移植已被广泛用于跟踪免疫系统的起源和发展。尽管最近的报告涉及与 CD45.1 相关的点突变, 影响 NK 细胞反应24, 但这些菌株组合之间没有移植排斥的报告。我们观察到大量的受体细胞流入脾脏移植, 发生在 POD 1。受体细胞很可能对移植的 i只能 r 损伤做出反应, 因为大多数受体细胞是粒细胞。我们的研究结果表明, 脾脏淋巴细胞中仍有较高比例的供体。更有趣的是, 这些淋巴细胞迁移到 (重新填充) 其他淋巴细胞隔间 (淋巴结, 骨髓, 和循环)。这些发现促使我们推测, 来自脾脏的淋巴细胞在适应性免疫中非常重要。然而, 需要进行更多的研究来描述脾淋巴细胞在适应性和先天免疫中的不同作用 (图 4补充图 1补充图 2)。

该协议的主要局限性在于, 它需要对具有有限显微外科经验的个人进行广泛的显微外科培训, 才能掌握这项技术。根据我们在小鼠固体器官移植模型 (如小鼠心脏、肺或肾移植) 方面的学习经验, 新训练的人 (无需任何实验显微外科技术) 可能需要6-10 的时间才能熟练掌握这一点。技术。与心脏或肾移植的小鼠模型相比, 这种模型可能更具挑战性, 因为它涉及额外的组织解剖步骤, 以隔离在捐献者程序中的脾脏移植。此外, 供体门静脉的直径 (约0.6 毫米) 小于 IVC, 这使得吻合更加困难。另一个限制是, 尚不清楚移植的脾脏在移植后期是否会被受者的细胞大量侵入 (例如 pod 60)。然而, 这种模式也因其几个固有的优势而非常有吸引力。首先, 小鼠和人类共享大量相似的基因组, 从而能够相对准确地表示一个现实的应用。此外, 与使用脾组织切片的非血管化脾脏自体移植小鼠模型相比, 这种血管化脾脏移植模型不太可能出现脾组织无菌性坏死等并发症。术后粘连引起的小肠梗阻。

此前, Swirski FK 等人曾报道过脾脏移植的小鼠模型。但是, 没有说明详细资料。 我们的研究为感兴趣的研究人员提供了一个全面的小鼠脾移植分步方案, 以遵循和实现这一技术。此外, 该协议消除了几个不必要的步骤, 在报告中描述的 swirski FK 等人 (例如, 胆管结扎), 并引入了11-0 缝合吻合术, 这将有助于缩短手术时间和防止出血。

总之, 该模型可以成为探索脾细胞群对病原体、损伤、炎症或移植排斥反应的机制的有力工具, 对脾脏治疗潜力的检测很有价值移植。通过适当的培训和实践, 这个过程可以 gt;90% 的成功来完成。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢西北大学综合移植中心和费恩伯格医学院研究核心项目的资源和资金支持。具体而言, 流式细胞术和组织学服务分别由西北大学流式细胞术核心设施和小鼠组织学和表型实验室提供, 这两个机构都得到了授予罗伯特 h 的 NCI P30-CA060553 的支持。卢里综合癌症中心。我们感谢内特·埃斯帕扎先生校对了这份手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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