Dalak hücre biyoloji ve nakli bağışıklık eğitimi için vascularized heterotopik dalak transplantasyonunun fare modeli

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, dalak hücrelerin kaderi ve uzun ömürlü çalışmasında güçlü bir araç olarak hizmet veren, farklı dalak mekanizmaları olan vaskülarized heterotopik dalak transplantasyonunun bir fare modelinin cerrahi adımlarını ayrıntılarıyla araştırabilir. hastalık progresyonunda hücre nüfusa ve nakli bağışıklık.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dalak, bağışıklık ve hematopoetik sistemlerin homeostazı 'te kritik bir rol oynayan benzersiz bir lenfoid organıdır. Ne olursa olsun çökelme nedenleri splenektomi geçirmiş hastalar ezici bir sonrası splenektomi enfeksiyon geliştirmek ve derin venöz tromboz ve malignite riskleri artan deneyim eğilimli. Son zamanlarda, epidemiyolojik çalışmalar splenektomi kardiyovasküler hastalıkların oluşumu ile ilişkili olabileceğini belirtti, dalak fizyolojik fonksiyonları henüz tam olarak tanınmadı düşündürmektedir. Burada, sadece farklı biyolojik süreçlerde splenik immün hücre alt setlerinin fonksiyon ve davranışsal aktivitesini incelemek için kullanılabilecek değil, aynı zamanda test etmek için güçlü bir araç olabilir vaskülarize heterotopik dalak nakli, bir fare modeli tanıtmak bazı hastalıklarda dalak nakli terapötik potansiyeli. Bu modelin Ana cerrahi adımlar donör dalak hasat içerir, alıcı yerli dalak kaldırılması, ve dalak greft revaskülarizasyon. Konjenik fare suşları (örn., CD 45.1/CD 45.2 arka planlar ile fareler) kullanarak, syngeneic transplantasyondan sonra, hem donör türetilen splenik lenfositler ve miyeloid hücreler, ameliyat sonrası gün olarak erken olarak greft dışına göç ederek böylece benzersiz bir Chimera üreten alıcı hücrelerinin birden fazla tür akını.  Nispeten zorlu tekniklere rağmen, bu prosedür >% 90 başarı oranı ile yapılabilir. Bu model, sürekli devlet sırasında ve dalak nakli takiben bir hastalık ayarında, böylece dalak türevi bağışıklık hücrelerinin farklı rolünü keşfetmek için büyük bir fırsat sunan, kaderin, uzun ömürlü ve splenanositlerin fonksiyonunu izleme sağlar farklı hastalık süreçleri.

Introduction

Dalak vücutta en büyük ikincil lenfoid organ ve bağışıklık ve hematopoetik sistemlerde kritik öneme sahiptir. Fonksiyonları öncelikle iki morfolojik ayrı bölmeler, kırmızı hamuru ve beyaz hamuru1tarafından gerçekleştirilir. Kırmızı selüloz, venöz sinüslerin ve retiküler liflerden, retiküler hücrelerden ve ilişkili makrofajlardan oluşan splenik kabloların üç boyutlu meshişidir. Bu eşsiz yapı, kırmızı hamuru, yabancı maddeleri ve eski veya hasarlı eritrositleri kaldıran etkili bir kan filtresi olarak hareket etmesini sağlar. Beyaz hamuru foliküller, marjinal bölge ve periarteriolar lenfoid Kılıf (PALS) içerir ve antijen bindirme ve işleme, lenfosit homing, dönüşüm, proliferasyon ve olgunlaşma için önemli bir sitedir2. Yine de, dalak genellikle bir vazgeçilebilir organ olarak kabul edilmiştir, çünkü diğer lenfatik organlar, lenf nodları gibi, ayrıca bazı işlevlerini yürütmek ve dalak kaybı genelde ölüme yol açmaz. Splenektomi bu nedenle splenik yaralanma veya benign hematolojik hastalıklar olan hastalar için terapötik bir yöntem olarak yaygın olarak yapılmıştır3. Ancak splenektomi olan hastalarda uzun süreli komplikasyonlar görülmektedir. Bakteriyel enfeksiyonlar splenektomi en iyi tanınan komplikasyonlarıdır4,5. Son zamanlarda, ezici sonrası splenektomi sepsis yüksek mortalite ile ilişkili splenektomi yoğun bir komplikasyon olarak tanınmıştır6. Dahası, son epidemiyolojik çalışmalar splenektomi kardiyovasküler hastalıkların oluşumu ile ilişkili olabileceğini gösteriyor, dalak daha fazla fizyolojik fonksiyonların incelenecek kalır düşündürmektedir,7,8.

Klinikte hem dalak ototransplantasyon hem de dalak allotransplantasyon kullanılmıştır. Şu anda, splenik doku bölümlerini büyük omentum 'da oluşturulan torbalar içine yerleştirerek dalak ototransplantasyon, travmatik splenektomi sonrası splenik fonksiyon korunması için tek olasılık olarak kabul edilir9,10. Bununla birlikte, bu ameliyatın etkinliği, Dalik dokuda aseptik nekroz ve postoperatif yapışmalar nedeniyle küçük barsak tıkanıklığı gibi cerrahi sonrası komplikasyonlar ortaya çıkabilir11. Dalak allotransplantasyonu çok viseral transplantasyon12' de yer almaktadır. Multivisceral transplantasyondan gelen klinik kanıtlar, dalak allonakli 'nin, Greft-versus-Host hastalığına (GVHD)12' ye neden olmadan küçük barsak allogreft reddi içinde koruyucu rol oynayabileceği anlamına gelmiştir. Ancak dalak allotransplantasyonunun çok viseral transplantasyonun bir bileşeni olarak yararlı etkisi ile ilgili literatür hala sınırlıdır ve temel mekanizmalar tanımlanmaya devam eder. 2006 yılında, Yair Reisner ve ark., GVHD13neden olmadan bir genetik hastalık hemofili a tedavi edebilir fareler hiçbir T hücreleri olan nakil domuz embriyonik dalak doku bildirdi, bu dalak transplantasyonu destekleyen terapötik söz tutar Bazı hastalıklar. Bu nedenle, dalak nakli terapötik potansiyeli hakkında daha fazla soruşturma için bir ihtiyaç vardır.

Dalak transplantasyonunun hayvan modelleri, hastalık ilerlemesinde dalak türevi immün hücrelerin tanınmaz fonksiyonunu keşfetmek ve dalak transplantasyonunun potansiyel terapötik etkisini test etmek için değerlidir. Deneysel tüm dalak nakil modelleri, Cohen14tarafından gözden geçirildiği gibi 1900 ' lerin başlarında belgelenmiştir. 1969 yılında, Coburn Richard J. ve Lee et al. fareler15,16dalak transplantasyon tekniği detaylı. Daha Geçenlerde, Swirski FK ve ark. dalak nakli17bir fare modeli nitelendirdi. Sıçan modelleriyle karşılaştırıldığında, dalak transplantasyonunun fare modelleri, çeşitli doğal avantajları nedeniyle daha çekicidir. Örneğin, bir fare modeli kullanarak, biz sıçan modelleri için kullanılamıyor reaktifler geniş bir çeşitlilik erişebilirsiniz. Ayrıca, konjenik fareler kullanarak (örneğin, CD 45.1/CD 45.2 arka plan ile fareler), bir syngeneic dalak nakli mümkün kaderi izlemek için yapar, uzun ömürlü, ve splenanosit fonksiyonu18. Swirski FK ve ark.17' nin çalışmalarına dayanarak, farelerde Bu basitleştirilmiş ve gelişmiş dalak nakli protokolünü kurduk. Aşağıda açıklanan protokol hem güvenilirlik hem de fizibilite standartlaştırılmış bir şekilde birleştirir ve dalak biyoloji ve nakil bağışıklık çalışması için bir araç olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada tüm prosedürler ve hayvan kullanımı Northwestern Üniversitesi Iç hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından onaylanmış protokollere göre yapılmıştır. Bu çalışmada, 8 ila 10 hafta eski erkek CD 45.2 ve CD 45.1 fareler (hem BALB/c arka planda, Jackson laboratuvarından) dalak bağış ve alıcılar olarak kullanılan, sırasıyla syngeneic dalak transplantasyon modelleri oluşturmak için. Tüm hayvanlar Northwestern Üniversitesi hayvan tesislerinde steril ortamda yer aldı. Göz yağlayıcısı, kuruluğu önlemek için anestezinin sonrası tüm farelere uygulandı.

1. cerrahi hazırlık, Anestezizasyon ve Analgesia rejimi

  1. Cerrahi platformda steril tek kullanımlık bir örtü (45,7 cm x 66 cm) yerleştirin. Yavaşça fareyi kapmak, ketamin enjekte (50 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) intraperitoneal (i. p) anestezi için, ve enjekte 0,05 mg/kg buprenorfik analjezi için subkutan.
  2. Toe-tutam ile anestezi derinliği sağlamak, bir jilet ile tüm karın bölgesinde saç tıraş ve 6-10X büyütme işletim mikroskop altında Steril Cerrahi platforma fare yerleştirin.

2. donör dalak hasat

  1. Karın bir alkol hazırlık Pad ile sterilize, cerrahi bant ile ekstremite güvenli ve makas ile ksifoid süreci pubis bir 3-4 cm orta hat dikey cilt kesi yapmak.
  2. Karın duvarını, kağıt klipslerden yapılmış steril retraktörler ile geri çekin. Bağırsakları karın (cerrahın sol) tarafında, dalağı açığa çıkarmak için steril bir pamuklu çubukla sağ tarafa taşıyın. Bir steril düşük sıcaklık koter ile dalak bağlı kısa gastrik ven cauterize (Şekil 1a). Nemli tutmak için dalak üzerinde 37 °C serum tuz ile ıslatılmış steril bir gazlı bez parçası yerleştirin (Şekil 1B).
  3. Portal ven dalları (üstün pankreaticoduodenal ven ve sağ gastrik ven) bağlanması ile pankreas dokusundan (Şekil 1C) portalı ven ayrı ve seferber; splenik ven distal portal ven etrafında bir sütür koyun (Şekil 1D).
  4. Splenik arter ile aort ve çölyak gövde ortaya çıkarmak için sağ tarafına dalak çevirin (Şekil 1E). Hepatik arter ve gastrik arter bağlanarak aort-Çölyak-splenik arter dissect ve seferber; aort etrafında çölyak arter (Şekil 1F-G) proksimal bir sütür yerleştirin.
  5. 100 uluslararası birimler (ıU) heparin inferior vena cava (ıVC) içine enjekte tüm vücudu heparinize ve heparin etkileri sağlamak için 3 dakika bekleyin. Aort, çölyak arter için proksimal, portal ven Transect ve daha sonra 10 ml heparinize soğuk (4 °c) tuzlu (10 ml/20 s) abdominal aort Çölyak gövdesine distal (Şekil 1h) kullanarak tüm vücudu serpmek.
  6. Dalak greft en bloğu ile ilişkili aort-Çölyak-splenik segment ve portal ven ile birlikte splenik ven bir segment ve pankreatik doku küçük bir kısmı ile toplayın. Nakil işleminden önce 5 mL 4 °C ' lik tuz içinde greftini koruyun. Servikal dislocation fare ötenize.

3. alıcı splenektomi ve dalak greft Implantasyonu

  1. Cerrahi platforma bir ısıtma yastığı yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C ' ye ayarlayın. Steril bir cerrahi platform oluşturmak için ısıtma yastığı üstüne steril bir örtü (45,7 cm x 66 cm) yerleştirin. Cerrahi hazırlama ve anestezizasyon için 2,1 ve 2,2 adımları yineleyin. 3-4 cm orta hat kesi yapın ve adım 2,1 ve adım 2,2 ' de açıklandığı gibi karın duvarını geri çekin.
  2. Alıcı dalağını açığa çıkarmak için, bağırsaklarını dikkatli bir şekilde Mouse 'un sağ tarafına steril bir pamuklu çubukla taşıyın. Splenik ven ve arter ligate ve dalağı çıkarın.
  3. Dikkatle fare sol tarafına bağırsak hareket ve ıslak gazlı bez ile bağırsak kapağı (steril 37 °C tuz ile ıslatılmış). İnfrarenal aort ve IVC 'nin lomber dallarını ortadan sökme ve indirgeme uzman; Iki 4 mm mikrovasküler kelepçeleri kullanarak infrarenal aort ve ıVC Çapraz kelepçe.
  4. İnfrarenal aort (tam kalınlıkta) ile bir 11-0 naylon sütür yerleştirin ve mikromakas ile tek bir kesim ile eliptik aotomi oluşturmak için geri çekilmelidir (uzunluk donör aort çapı maç olmalıdır, Şekil 2a). Bir eliptik venotomi oluşturmak için 30 G iğne kullanarak ıVC delin ve mikromakas kullanarak donör portalı ven-eşleşen uzunlukta açılması uzatmak (Şekil 2a).
  5. İntraluminal kan veya kan pıhtısı (aort ve IVC) ile 500 μL heparinize tuz (10 adet/ml) ile temizleyin.
  6. Dalak greftini alıcının fare karnının sağ kanadına yerleştirin; Donörün aort manşet ve donör portal ven dikkatle tanımlayın. Damarların bükülmez olduğundan emin olduktan sonra, dalak greftini soğuk (4 °C) tuz ile ıslatılmış gazlı bez ile kapla.
  7. Donör aort manşeti, alıcının aortotominin proksimal ve distal zirvine iki konaklama sütür (11-0 naylon dikiş, aşağıda aynı) (Şekil 2B, C) ile bağlayın. 2-3, donör aort manşet ve alıcının aortaotomi (ön duvar) (Şekil 2D) arasında sürekli 11-0 naylon dikiş ısırıkları ile anastomoz yapın. Dalak greftini alıcının sol tarafına çevirin; donör aort manşet ve alıcının aotomi (arka duvar) arasında anastomoz yapmak (Şekil 2E).
  8. Alıcının portal ven, ıVC içinde sürekli sütürler 4 ila 5 ısırıkları kullanarak, alıcının ıVC posterior duvara bağlamak için bir anastomoz gerçekleştirin ve sonra ıVC dışında sütür kapatın (Şekil 2F, G).
  9. Gemi kelepçelerini serbest bırakın ve dalak rengi kurtarılana kadar kanamayı tamponad etmek için steril pamuklu çubukla kullanın (Şekil 2H).
  10. Sürekli bir desen 5-0 sentetik emici vicryl sütür ile karın kapatın. Kesilmiş bir desen bir 5-0 naylon sütür ile cilt tabakası kapatın.
    Not: Alternatif olarak 4.7-4.8 adımları için donör portal ven ve alıcının ıVC arasında anastomoz yapın (adım 4,8); daha sonra donör aort manşet ve alıcının aotunun posterior duvarı arasında bir anastomoz yapmak, aort içinde 2 ila 3 sürekli sütürler kullanarak ve aort dışında sütür kapatın.

4. hayvan kurtarma

  1. Karın kapattıktan sonra 4 ayrı yer (0,25 mL/konum) aracılığıyla subkutan 1 mL sıcak tuz enjekte et.
  2. Hareket sonrası ilk birkaç saat için sıcaklık kontrollü bir kuluçta (30 °C) fare tutun, yeterli bilinç geri kazanıncaya kadar fareyi izlemek ve sonra normal yiyecek ve su ile yeni bir temiz kafes, bir Isıtma Pad (30 ° c) ile fareyi aktarmak ) kafesin altında. Fare ameliyatı sonrası ayrı bir kafeste tutun.

5. cerrahi sonrası ağrı yönetimi

  1. Enjekte 0,05 mg/kg buprenorfik subkutan 24 h ve 48 h sonrası cerrahi analjezi rejimi korumak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare dalak nakli tüm prosedür deneyimli mikrocerrahlar tarafından 90 dk içinde tamamlanabilir. Laboratuvarımız farelerde 100 üzerinde dalak nakli gerçekleştirdi. Başarı oranı her iki alıcı fare ve dalak greft sonrası ameliyat günü (POD) 1 veya POD 7 (bizim çalışma uç noktası) hayatta kalma tarafından tanımlanan% 90 üzerinde. Dalak greftinin hayatta kalması, splenanositlerin makroskopik görünümü ve akış sitometri analizi ile doğrulandı. Deneyimimize dayanarak, akış sitometri Analizi (canlı/ölü hücre viability analizleri) dalak Greftler nekrotik olsaydı dalak hücrelerin çoğunluğu ölü olurdu olarak, bir dalaklık fertasyonu hayatta olup olmadığını belirlemek için çok duyarlıdır. Bu prosedürün teknik zorlukları, ortak komplikasyonlar ve sorun giderme işlemleri Tablo 1' de özetlenmiştir.

Post-transplantasyon sonrası greft morfolojisini test etmek için, POD 1 ve POD 7 ' de BALB/c farelerinin dalak izografisinde haemotoxylin ve Eosin (H & E) boyama yapıldı. Temsili resimler Şekil 3' te gösterilir. Dalak isograflar mimarisi, ilk postoperatif hafta boyunca bozulmamış kalmıştır. Kırmızı selüloz, beyaz Selüloz ve marjinal bölge hala açıktı ve ayırt edildiler. Dalak nakli sonrasında hücre geçişini araştırmak için POD 1 ve POD 7 ' de dalak isograflarında, lenf nodları, kan ve kemik iliği lökositlerinin fenotiplerini incelemek üzere akış sitometri gerçekleştirildi. Şekil 4A'da görüldüğü gıbı, Pod 1 ' de, dalak hücrelerin 51 ± 7% (ortalama ± SD) donör türetilmiştir ve 46 ±% 3 alıcı türetilmiştir. POD 7 ' de, donör türevi lökositler toplam dalak hücrelerinin 32 ±% 10 ' unu aldı ve alıcı kaynaklı hücreler 56 ±% 13 ' e kadar idi. Ayrıca, dalak lökositlerin lenf düğümlerine, kana ve kemik iliğine 1 gün erken olarak göç ettiğini ve 7. gün (Şekil 4b) korunduğunu ve splenocayt kaçakçılığı araştırmaları için değerli benzersiz bir Chimera üretdiğini gözlemledik.

Tablo 1: Sorun giderme yöntemleri.

Figure 1
Şekil 1: donör dalak hasat. (A) dalak bağlı kısa gastrik ven cauterize. (B) nemli tutmak için dalak üzerinde steril sıcak ıslak gazlı bez küçük bir parça yerleştirin. (C) pankreas arkasındaki portal ven ayrıştırmak ve izole. (D) portal ven yan dalları ligate ve bir sütür yuvarlak portal ven splenik ven distal. Kesikli çizgiler anastomoz için daha sonra alıcı ıVC ile geçiş konumunu temsil eder. (E) splenik arter dahil olmak üzere dalları ile aort ve çölyak gövde ortaya çıkarmak için karın (cerrah sol) sağ tarafına üzerinde dalak çevirin. (F) diğer iki dala bağlanarak aort-Çölyak-splenik arter dissect ve seferber. (G) çölyak arter için aort proksimal etrafında bir sütür yerleştirin. Kesikli çizgiler, anastomoz için kullanılan daha sonra alıcı abdominal aort ile geçiş konumunu temsil eder. (H) aort bağlandıktan ve portal ven attıktan sonra, aort aracılığıyla 10 ml heparinize tuzlu ile dalak greftini mükemmelleştirmek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: dalak greft implantasyonu. (A) aort ve IVC yalıtım ve çapraz bağlama sonra, aort ve IVC, sırasıyla uzunlamasına aotomi ve venotomi olun. (B-D) Dalak greftini karın sağ tarafına yerleştirin (cerrahın sol tarafı). Donör aort manşet ve alıcının aotominin ön duvarı arasında uçtan uca anastomoz olun, 2-3 sürekli sütür ısırıkları kullanarak. (E) dalak greftini alıcının sol kanadına çevirin; donör aort manşet ve alıcı aotominin posterior duvar arasında önceki prosedürü tekrarlayın ve aort dışında sütür kapatın. (F-G) Donör portal ven ve alıcının ıVC posterior duvar arasında uçtan uca anastomoz olun, ıFC içinde sürekli 11-0 naylon sütür 4 ila 5 ısırıkları kullanarak ve daha sonra ıVC dışında sütür kapatın. (H) anastomozu tamamladıktan sonra, damar kelepçelerini bırakın ve kanama durdurulmasına yardımcı olmak için bazı pamuk tomurcukları yerleştirin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: dalak izografinin 1 ve 7 gün sonrası operasyonda temsili histolojisi. Syngeneic dalak nakli BALB/c fareler kullanılarak yapılmıştır. Dalak isograflar 1 ve gün 7 sonrası ekimi sırasında hasat edildi ve 48 h. H & E boyama için% 10 formalin içinde parafin-gömülü doku bölümü kullanılarak yapılmıştır. Temsili histolojisi, dalak izografinin 1 hafta sonrası transplantasyon esnasında bozulmamış olduğunu gösteriyor. Ölçek çubuğu = 250 μm. POD, ameliyat sonrası gün. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Syngeneic dalak nakli tarafından oluşturulan Chimera. Üç syngeneic dalak nakilleri alıcı olarak Balb/c CD 45.2 fareler olarak bağış ve Balb/c CD 45.1 fareler kullanılarak yapılmıştır. Alıcı farelerde dalak Greftler, kan, lenf nodu (LN) ve kemik iliği (BM) 1 ve gün 7 sonrası transplantasyon sırasında hasat edildi. Hücrelerin fenotipini analiz etmek için tek hücreli yalıtım ve akış cytometri analizi yapıldı. (A) temsilci nokta çizimleri (canlı singlets gelen) donör veya alıcı yüzdeleri gösteren-türev lökosit belirtilen örneklerde. (B) belirtilen örneklerin donör türevi hücrelerinde 1 ve gün 7 gün içinde belirtildiği nüfus (ortalama ± SEM) yüzdeleri. POD = ameliyat sonrası gün. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: temsilci araziler (n = 3), nakledilen dalak, lenf nodu, kan ve kemik iliğinde alıcı türetilmiş ve alıcıdan türetilen lenfosit yüzdeleri gösteriliyor. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 2: temsilci araziler (n = 3), nakledilen dalak, lenf nodu, kan ve kemik iliğinde alıcı türetilmiş CD11b + Ly6C + monositlerin yüzdelerini gösterir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çekici kanıtlar, dalak türevi monositlerin ateroskleroz19, akut iskemik beyin20 veya akciğer hasarı18gibi steril inflamatuar süreçlerde önemli bir rol oynarlar, hem de miyokard I/R yaralanma ve remodeling21,22,23. Bu raporlar, kalp-damar hastalığının önemli bir (özellikle de bir numaralı katil küresel olduğu verilen) bir çok kronik hastalıklarda dalağın altında tanıma rolünü vurgulamaktadır. Dalak transplantasyonunun fare modeli, dalak türevi bağışıklık hücrelerinin çeşitli hastalıklarda ve dalakta nasıl astarlandığı rolünü keşfetmek için büyük bir fırsat sunmaktadır. Örneğin, dalak transplantasyonu fare modellerini kullanarak, Swirski ve ark. iskemik miyokard yaralanmasına yanıt olarak, dalak türevi monosit motilitesi artırmak, dalak dışarı göç, yaralı doku uymak ve katkıda bulundu yara iyileşmesi17. Ayrıca bu model, dalak ve altta yatan mekanizmalarda olgun bağışıklık hücrelerinin uzun ömürlü olması ve dalak nakli terapötik potansiyelleri keşfetmek için yararlıdır.

Bu protokolün başarısını iyileştirmek için çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. İlk olarak, fare ağırlığı, gerinim ve sağlık durumunun cerrahi adımların ve deneysel sonuçların zorluğunu etkileyebileceği için tasarım sürecinde uygun deneysel hayvanları seçmek önemlidir. Laboratuvarımız, kanama nedeniyle olabilir mortalite azaltmak için 25 gr ağırlığı ile 8 ila 12 haftalık fareler kullanmanızı önerir. İkincisi, dalak hasat prosedürü sırasında, dalak damarlarının çok fazla manipülasyon kolayca üreme veya vazospam yol açabilir ve potansiyel dalak greftte mikro tromboz neden olabilir. Ameliyattan önce fare karın anatomisi aşina Başlarken öğrenme sürecini hızlandırmak için yararlı olacaktır. Üçüncü olarak, alıcı cerrahisi sırasında, dalak greft her zaman nemli ve serin muhafaza edilmelidir. Dalak greftinin uygun koruma nakli iskemi/reperfüzyon (I/R) yaralanmasını azaltabilir ve transplantasyondan sonra greft yetmezliği önlenecektir. Buna ek olarak, anastomoz için donör damarlarının nispeten uzun olduğunu göz önünde bulundurarak, atak greftleri anastomoz öncesinde düzgün bir şekilde konumlandırmak, damarların bükülmesini önlemek için önemlidir. Dahası, alıcı aortotomi ve ıVC venotomi çapları her zaman uygun kan akışını sağlamak ve tromboz önlemek için donör aort ve portal ven bu karşılaştırılabilir olmalıdır.

4 °C ' lik tuz içinde dalak greftleri ortalama depolama süresi yaklaşık 10 dakika. Toplam iskemik zaman asgari nakli başarısızlık sağlamak için 50 dk daha az sınırlı olmalıdır. Dalak greftini korumak için Wisconsin Üniversitesi (UW) soğuk depolama çözümünü kullanmanızı tavsiye ederiz, çalışmalar sırasında 1 saat soğuk, iskemik zaman gereklidir. Bu pankreas küçük bir kısmı yakından dalak ile iliştirmek, ve girişimi dalak Greftler kolayca greft veya vasküler komplikasyonlara yol açacak tüm kaldırmak ve belirgin çalışma süresini artırmak unutulmamalıdır. Biz, dalak greftine bağlı pankreas dokusunun POD 7 ' de atrofi geçireceğini gözlemledik, ancak bazıları dalak greft ile birlikte kalmışlardır. Dalak greftlerle bağlanmış pankreas dokusunu çıkarmak ister değil araştırma amaçlarına bağlıdır.

Konjenik farelerin mevcudiyeti, dalak hücrelerinin kökenini, transplantasyondan sonra alıcıya karşı alıcıyı izlemek mümkün hale gelmiştir. Bu çalışmada, dalak bağış ve alıcılar olarak BALB/c CD 45.2 ve BALB/c CD 45.1 konjenik fareler kullanılan bir syngeneic dalak transplantasyon modeli oluşturmak için. Organ veya doku nakli bu konjenik fare suşları arasında yaygın kökeni ve bağışıklık sisteminin gelişimini izlemek için kullanılmıştır. Son rapora rağmen bir nokta mutasyonu ile ilgili CD 45.1 Bu etkiler NK hücre tepkisi24, hiçbir nakil reddi bu gerinim kombinasyonları arasında bildirilmiştir. POD 1 ' de en kısa sürede oluşan dalak greftleri içine alıcı hücrelerin önemli bir akını gözlemledik. Alıcı hücrelerin çoğunluğu granülositler olduğu için, alıcı hücrelerinin nakil ı/R yaralanmasına yanıt vermesi muhtemeldir. Bizim sonuçlar splenik lenfositlerin nispeten yüksek bir yüzdesi donör kökeni kaldığını gösterdi. Daha ilginçtir, bu lenfositler göç (yeniden) diğer lenfoid bölmeleri (lenf düğümü, kemik iliği, ve dolaşım). Bu bulgular bize dalağı kaynaklanan lenfositlerin adaptif bağışıklık çok önemli olduğunu spekülasyon sorar. Ancak, splenik lenfositlerin farklı rollerini Uyarlamalı ve doğuştan dokunulmazlık (Şekil 4, Tamamlayıcı Şekil 1 ve Tamamlayıcı Şekil 2) ile karşılaştırmaları için daha fazla soruşturma gereklidir.

Bu protokolün büyük sınırlaması, bu tekniğin ustalaşması için sınırlı mikrocerrahi deneyime sahip bireyler için geniş mikrocerrahi eğitim gerektirmesi. Genel fare katı organ nakli modellerinde (örneğin, fare kalbi, akciğer veya böbrek nakli) öğrenme deneyimimize dayanarak, yeni eğitimli bir kişi için 6-10 ay sürebilir (herhangi bir deneysel mikrocerrahi tekniği olmadan) ustaca bu ana Tekniği. Kalp veya böbrek nakli fare modelleri ile karşılaştırıldığında, bu model daha fazla doku diseksiyon adımları donör prosedürleri sırasında dalak greft yalıtmak için içerir çünkü daha zor olabilir. Dahası, donör portal ven çapı (yaklaşık 0,6 mm) ıVC daha küçüktür, bu anastomoz için daha zor hale getirir. Başka bir sınırlama ise, erif dalak, daha sonra nakil aşamasında (örn., POD 60) alıcı hücrelerinden kitlesel olarak işgal edilecektir. Ancak, bu model de çok çeşitli içsel avantajları için çekici. Öncelikle, fareler ve insanlar benzer genomlar önemli bir dizi paylaşmak, böylece gerçekçi bir uygulamanın nispeten doğru bir temsili için izin. Dahası, splenik doku bölümlerini kullanarak vaskülarize olmayan dalak ototransplantasyon fare modeline kıyasla, bu vaskülarize dalak ekimi modeli splenik doku aseptik nekroz gibi komplikasyonlar geliştirmek için daha az muhtemeldir ve Postoperatif yapışmaları nedeniyle küçük bağırsak tıkanıklığı.

Dalak transplantasyonunun fare modeli daha önce Swirski FK ve ark tarafından bildirilmiştir. Ancak, ayrıntılı bilgiler açıklanmadı.  Çalışmamızda, ilgilenen araştırmacılar için takip etmek ve bu tekniği Mater için fare dalak nakli kapsamlı bir adım adım protokol sağlar. Dahası, bu protokol Swirski FK ve ark. (örneğin safra kanalı ligasyonu) tarafından raporda açıklanan çeşitli gereksiz adımları ortadan kaldırır ve anastomoz için 11-0 sütür tanıttı, bu cerrahi zaman kısaltmak ve kanama önlemek yardımcı olacaktır.

Sonuç olarak, bu model patojenler, yaralanma, inflamasyon veya nakil reddi yanıtlarında splenik hücre popülasyonunun mekanizmalarını keşfetmek için güçlü bir araç olabilir ve dalağın terapötik potansiyelini test etmek için değerlidir Ekimi. Uygun eğitim ve uygulama ile, bu prosedür >% 90 başarı ile yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Northwestern Üniversitesi kapsamlı nakil merkezi ve kaynak ve finansman desteği için Feinberg Tıp araştırma çekirdekleri programı teşekkür ederiz. Özellikle, akış Cytometri ve histoloji Hizmetleri Northwestern Üniversitesi akış sitometri çekirdek tesis ve fare histolojisi ve phenotyping Laboratuvarı tarafından, sırasıyla, her ikisi de NCı P30 tarafından desteklenmektedir-CA060553 Robert H verilir Lurie kapsamlı Kanser Merkezi. Bu taslağı düzeltmek için Bay Nate Esparza 'ya teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics