Ein Mausmodell der Vaskularisierten Heterotopischen Spleen-Transplantation für das Studium der Zauberzellen und der Transplantation von Transplantationen in der Lagen

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Schritte eines Mausmodells der vaskularisierten heterotopischen Milztransplantation, ein technisch anspruchsvolles Modell, das als mächtiges Werkzeug bei der Untersuchung des Schicksals und der Langlebigkeit von Milzzellen dienen kann, die Mechanismen der unterschiedlichen Milz Zellpopulationen in Krankheitsverlauf und Transplantationsimmunität.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

Die Milz ist ein einzigartiges Lymphorgan, das bei der Homöostase des Immunsystems und des hämatopoetischen Systems eine entscheidende Rolle spielt. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, unabhängig von den Ursachen, die sich daraus ergeben, neigen dazu, eine überwältigende Infektion nach der Splenektomie zu entwickeln und ein erhöhtes Risiko einer tiefen venösen Thrombose und bösartigen Erkrankungen zu erleben. In jüngster Zeit haben epidemiologische Studien darauf hingewiesen, dass die Splenektomie mit dem Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht werden könnte, was darauf hindeutet, dass die physiologischen Funktionen der Milz noch nicht vollständig erkannt wurden. Hier führen wir ein Mausmodell der vaskularisierten heterotopischen Milztransplantation ein, das nicht nur zur Untersuchung der Funktion und Verhaltensaktivität von prächtigen Immunzellen-Untergruppen in verschiedenen biologischen Prozessen genutzt werden kann, sondern auch ein leistungsfähiges Werkzeug zum Testen sein kann. Das therapeutische Potenzial der Milztransplantation bei bestimmten Krankheiten. Die wichtigsten chirurgischen Schritte dieses Modells sind die Spenderspitzenernte, die Entfernung der Empfängerspendenz und die Revaskularisierung der Milz. Mit kongenen Mausstämmen (z.B. Mäuse mit CD45.Pyhale-CD5.2-Hintergründen) beobachteten wir, dass nach syngeneischer Transplantation sowohl von Gebern abgeleitete Splene-Lymphozyten als auch Myeloidzellen bereits nach dem operativen Tag 1 aus dem Transplantation abwanderten, was mit dem Der Zustrom mehrerer Arten von Empfängerzellen, wodurch eine einzigartige Chimäre entsteht.  Trotz relativ anspruchsvoller Techniken kann dieses Verfahren mit einer Erfolgsquote von gt;90% durchgeführt werden. Dieses Modell ermöglicht es, das Schicksal, die Langlebigkeit und die Funktion von Splenozyten während des gleichmäßigen Zustandes und in einer Krankheitssituation nach einer Milztransplantation zu verfolgen und bietet somit eine großartige Gelegenheit, die besondere Rolle der von Leben abgeleiteten Immunzellen in der Verschiedene Krankheitsprozesse.

Introduction

Die Milz ist das größte sekundäre Lymphorgan im Körper und ist im Immunsystem und in der hämatopoetischen Systemen entscheidend. Seine Funktionen werden in erster Linie von zwei morphologisch ausgeprägten Fächern, dem roten Fruchtfleisch und dem weißen Fruchtfleisch1, ausgeführt. Das rote Fruchtfleisch ist ein dreidimensionales Geflecht aus venösen Nasennebenhöhlen und splenischen Schnüren, die aus Netzfasern, Netzzellen und zugehörigen Makrophagen bestehen. Diese einzigartige Struktur ermöglicht es dem roten Fruchtfleisch, als effektiver Blutfilter zu wirken, der fremde Materialien und alte oder beschädigte Erythrozyten entfernt. Das weiße Fruchtfleisch umfasst Follikel, Randzone und die periarteriolaren Lymphhüllen (PALS) und ist ein wichtiger Ort für Antigen-Fang und-verarbeitung, Lymphozyten-Homing, Transformation, Proliferation und Reifung2. Dennoch wurde die Milz allgemein als entbehrliches Organ angesehen, da auch andere lymphatische Organe, wie Lymphknoten, einige ihrer Funktionen erfüllen können und der Milzverlust in der Regel nicht zum Tod führt. Die Splenektomie wurde daher als therapeutische Methode für Patienten mit prächtiger Verletzung oder gutartigen hämatologischen Erkrankungen3 durchgeführt. Patienten mit einer Splenektomie sehen sich jedoch einer Reihe von Langzeitkomplikationen gegenüber. Bakterielle Infektionen sind die am besten erkannten Komplikationen der Splenektomie4,5. In jüngster Zeit wurde die überwältigende postsplenektomische Sepsis als intensive Komplikation der Splenektomie mit einer hohen Sterblichkeit assoziiert erkannt 6. Darüber hinaus deuten jüngste epidemiologische Studien darauf hin, dass die Splenektomie mit dem Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht werden kann,was darauf hindeutet, dass weitere physiologische Funktionen der Milz noch 7,8erforscht werden müssen.

Sowohl Milbenautotransplantation als auch Milzallotransplantation wurden in der Klinik eingesetzt. Derzeit wird die Milz Autotransplantation durch die Implantation von Teilen des prächtigen Gewebes in Beutel,dieim größeren Omanumerzeugtwerden, als die einzige Möglichkeit, die prächtige Funktion nach der traumatischen Splenektomie 9,10zuerhalten. Die Wirksamkeit dieser Operation ist jedoch umstritten, da nach der Operation Komplikationen wie aseptische Nekrose des Splenengewebes und kleine Darm-Obstruktion durch postoperative Haftung auftreten könnten11. Die Milletransplantation ist an der multiviszeralen Transplantation12beteiligt. Klinische Erkenntnisse aus der multiviszeralen Transplantation deuten darauf hin, dass die Milbenallotransplantation eine schützende Rolle bei der Abstoßung von Kleindarm spielen kann, ohne dass eine Graft-versus-Wirst-Erkrankung (GVHD) 12 verursacht wird. Dennoch ist die Literatur über die positive Wirkung der Milzlegierung als Bestandteil der multiviszeralen Transplantation noch begrenzt und die zugrunde liegenden Mechanismen müssen noch definiert werden. Im Jahr 2006 berichtete Yair Reisner et al., dass die Transplantation von embryonalem Milbengewebe Schwein, das keine T-Zellen an Mäuse hat, die Hemophilie A heilen könnte, eine genetische Erkrankung, ohne GVHD13zu verursachen, und die Unterstützung der Milztransplantation, die therapeutische Versprechen in Bestimmte Krankheiten. Daher seien weitere Untersuchungen zum therapeutischen Potenzial der Milztransplantation notwendig.

Tierische Modelle der Milztransplantation sind wertvoll, um die nicht geschätzte Funktion der von Milz abgeleiteten Immunzellen im Krankheitsverlauf zu erforschen und die mögliche therapeutische Wirkung der Milztransplantation zu testen. Experimentelle Vollmilgentransplantationsmodelle sind seit Anfang des 20. Jahrhunderts dokumentiert, wie Cohen14. 1969 beschrieben Coburn Richard J. und Lee et al. die Technik der Milztransplantation in Ratten15,16. In jüngerer Zeit beschrieb Swirski FK et al. ein Mausmodell der Milz Transplantation 17. Im Vergleich zu Rattenmodellen sind Mausmodelle der Milztransplantation aufgrund mehrerer Vorteile attraktiver. Zum Beispiel, indem wir ein Mausmodell verwenden, können wir auf eine große Vielfalt von Reagenzien zugreifen, die nicht verfügbar sind, um die von Rattenmodellen. Darüber hinaus ermöglicht eine syngenförmige Milztransplantation durch den Einsatz von kongenen Mäusen (z.B. Mäuse mit CD45.MP3-Hintergrund), das Schicksal, die Langlebigkeit und die Funktion von Splenozyten 18 zu verfolgen. Auf der Grundlage der Arbeit von Swirski FK et al. 17 haben wir dieses vereinfachte und erweiterte Protokoll der Milztransplantation bei Mäusen weiter etabliert. Das unten beschriebene Protokoll vereint sowohl Zuverlässigkeit als auch Machbarkeit in standardisierter Weise und kann als Werkzeug zur Untersuchung von Milzbiologie und Transplantationsimmunität genutzt werden.

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Protocol

Alle Verfahren und die Verwendung von Tieren wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Ausschuss für Tierpflege und-nutzung der Northwestern Universität (IACUC) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden 8 bis 10 Wochen alte männliche CD45.2 und CD45.1-Mäuse (beide auf BALB/Hintergrund, aus dem Jackson-Labor) als Milzspender und-empfänger verwendet, um syngenice Milztransplantationsmodelle zu erstellen. Alle Tiere wurden in der sterilen Umgebung in den Tieranlagen der Northwestern University untergebracht. Das Augenschmiermittel wurde auf alle Mäuse nach der Betäubung aufgetragen, um Trockenheit zu verhindern.

1. Chirurgische Zubereitung, Anästhesie und Analgesie Regimen

  1. Legen Sie einen sterilen Einwegdrape (45,7 cm x 66 cm) auf die OP-Plattform. Günstig greifen Sie die Maus, injizieren Sie Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p) für die Anästhesie, und injizieren 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan für die Analgesie.
  2. Stellen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenspinke, rasieren Sie das Haar im gesamten Bauchbereich mit einem Rasiermesser und platzieren Sie die Maus auf der sterilen chirurgischen Plattform unter dem Operationsmikroskop bei 6-10x Vergrößerung.

2. Donor Spleen Harvest

  1. Sterilisieren Sie den Bauch mit einem Alkohol-Prep-Pad, sichern Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband, und machen Sie einen 3-4 cm mittleren Mittelzeige-vertikalen Hautschnitt von den Pubis zum Xiphoid-Prozess mit einer Schere.
  2. Die Bauchwand mit sterilen Retraktoren aus Papierklammern zurückziehen. Bewegen Sie den Darm auf die rechte Flanke des Bauches (Chirurge links) Seite mit einem sterilen Baumwollschwab, um die Milz zu entlarven. Die kurze Magenvene, die an der Milz befestigt ist, mit einer sterilen Niedertemperaturkammtion(Abbildung 1A) vorsichtig. Ein Stück sterile Gaze mit 37 ° C Salz über die Milz eingeweicht, damit sie feucht bleibt (Abbildung 1B).
  3. Die Portalvene vom Bauchspeicheldrüsengewebe trennen und mobilisieren (Abbildung 1C), indem die Portalvene (überlegene Bauchspeicheldrüsen-und rechte Magenvene) ligiert wird; Platzium eine Naht um die Portalvene distal von der prächtigen Vene (Abbildung 1D).
  4. Drehen Sie die Milz nach rechts, um den Aorta und den Zöliakie-Stamm mit der prächtigen Arterie(Abbildung 1E) zu entlarven. Die asortisch-zeliakult-prächtige Arterie zu zerkleinern und zu mobilisieren, indem die Leber-und Magenarterie ligiert wird; Eine Naht um die Aorta in der Nähe der Zöliakie-Arterie (Abbildung 1F-G) legen.
  5. Injektieren Sie 100 internationale Einheiten (IU), die in die untere vena cava (IVC) hepariniert werden, um den ganzen Körper zu heparinieren und 3 Minuten zu warten, um sicherzustellen, dass die Heparin-Wirkung wirkt. Ligieren Sie die Aorta in der Nähe der Zöliakie, transect die Portalvene, und dann parfümieren Sie den ganzen Körper mit 10 mL heparinierter Kälte (4 ° C) Salz (10 mL/20 s) von der abdominalen Aorta distal bis Zöliakie (Abbildung 1H).
  6. Sammeln Sie die Milz graft en bloc mit dem zugehörigen Aortic-Zöliak-Sechn-Segment und die Portalvene zusammen mit einem Segment von prächtige Vene und einem kleinen Teil der Bauchspeicheldrüsengewebe. Vor der Transplantation in 5 mL von 4 ° C Salz aufbewahren. Sterbegedanke der Maus durch zervikale Dislokation.

3. Rekzeppient Splenektomie und Spleen Graft Implantation

  1. Legen Sie ein Heizpolster auf die OP-Plattform und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C ein. Legen Sie einen sterilen Drahter (45,7 cm x 66 cm) auf das Heizungspolster, um eine sterile OP-Plattform zu schaffen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 für die chirurgische Vorbereitung und Betäubung. Machen Sie einen 3-4 cm mittleren Schnitt und ziehen Sie die Bauchwand zurück, wie in Schritt 2.1 und Schritt 2.2 beschrieben.
  2. Begetucht den Darm mit einem sterilen Wattestäbchen auf die rechte Seite der Maus, um die Milz des Empfängers zu entlarven. Die prächtigen Ader und die Arterie abspülen und die Milz entfernen.
  3. Den Darm vorsichtig auf die linke Seite der Maus bewegen und den Darm mit feuchter Gaze bedecken (mit sterilen 37 ° C Salz getränkt). Die Lendenwirbelsäule der Infrarandaorta und des IVC zerlegen und einordnen; Die Infrarenaorta und das IVC mit zwei 4-mm-Mikrovaskulationsklemmen verkrießen.
  4. Legen Sie eine 11-0 Nylon-Nylonnaht durch die Infrarenaorta (eine volle Dicke) und ziehen Sie sich zurück, um eine elliptische Aortotomie durch einen einzigen Schnitt mit Mikroscheren zu erstellen (die Länge sollte dem Durchmesser der Spenderaorta entsprechen, Abbildung 2A). Durchstechen Sie das IVC mit einer 30-G-Nadel, um eine elliptische Venotomie zu erstellen und die Öffnung zum Spenderportal mit Hilfe der Mikroschere mit einer Venenlänge zu verlängern.
  5. Reinigen Sie das intraluminale Blut oder Blutgerinnsel (in der Aorta und IVC) mit 500 μL heelisierter Saline (10 Units/ml).
  6. Legen Sie die Milz Graft in die rechte Flanke des Empfängers Maus Bauch; Die Aortenmanschette des Spenders und die Portalvene des Spenders sorgfältig identifizieren. Nachdem Sie darauf geachtet haben, dass die Gefäße nicht verdreht sind, bedecken Sie die Milz mit einer mit kalten (4 ° C) getränkten Sorte.
  7. Verbinden Sie die Aortenmanschette des Spenders mit der proximalen und distalen Spitze der Aortaotomie des Empfängers mit zwei Aufenthaltsnähten (11-0 Nylonnähte, wie unten) (Abbildung 2B, C). Machen Sie eine Anastomose mit 2-3 Bissen von ununterbrochenen 11-0 Nylonnahten zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortaotomie des Empfängers(Vorderwand) (Abbildung 2D). Drehen Sie die Milz auf die linke Seite des Empfängers umdrehen; Machen Sie die Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortotomie des Empfängers (hintere Wand) (Abbildung 2E).
  8. Führen Sie eine Anastomose durch, um die Portalvene des Spenders mit der hinteren Wand des IVC des Empfängers zu verbinden, wobei 4 bis 5 Bisse durchgängige Nähte auf der Innenseite des IVC verwendet werden und dann die Naht auf der Außenseite des IVC geschlossen wird (Abbildung 2F, G).
  9. Lassen Sie die Gefäßklemmen und verwenden Sie sterile Baumwollschweine zu Tamponade Blutungen, bis die Milzfarbe wiederhergestellt ist (Abbildung 2H).
  10. Schließen Sie den Bauch mit einer 5-0 synthetisch absorbierbaren Vicryl-Naht in einem durchgehenden Muster. Schließen Sie die Hautschicht mit einer 5-0 Nylonnaht in einem unterbrochenen Muster.
    NOTE: Für die Schritte 4.7-4.8, alternativ, eine Anastomose zwischen der Portalvene des Spenders und dem IVC des Empfängers zuerst (Schritt 4.8); Machen Sie dann eine Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der hinteren Wand der Aortotomie des Empfängers, mit 2 bis 3 kontinuierlichen Nähten im Inneren der Aorta und schließen Sie die Naht an der Außenseite der Aorta.

4. Tiererholung

  1. Nach dem Schließen des Bauches 1 ml warme Saline subkutan über 4 verschiedene Stellen (0,25 mL/Lage) einspritzen.
  2. Halten Sie die Maus in einem temperaturgesteuerten Inkubator (30 ° C) für die ersten Stunden nach der Operation, überwachen Sie die Maus, bis sie genügend Bewusstsein zurückgewonnen hat, und dann übertragen Sie die Maus in einen neuen sauberen Käfig mit regelmäßigem Essen und Wasser, mit einem Heizkissen (30 ° C ) unter dem Käfig. Halten Sie die Maus nach der Operation in einem separaten Käfig.

5. Postchirurgisches Schmerzmanagement

  1. Injektieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan 24 h und 48 h nach der Operation, um Schmerzmittel zu erhalten.

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Representative Results

Die gesamte Prozedur der Maus-Milse-Transplantation kann innerhalb von 90 Minuten von erfahrenen Mikrochirurgen abgeschlossen werden. Unser Labor hat mehr als 100 Milztransplantationen in Mäusen durchgeführt. Die Erfolgsrate liegt bei über 90%, wie sie durch das Überleben der Rezipient-Maus und der Milzveredelung bis zum postoperativen Tag (POD) 1 oder POD 7 (unser Studiendendpunkt) definiert wird. Das Überleben der Milzveredelung wurde durch die makroskopische Erläustellungs-und Strömungszytometrie-Analyse der Splenozyten bestätigt. Auf der Grundlage unserer Erfahrung ist die Strömungszytometrie-Analyse (LIVE/DEAD Cell Viability Assays) sehr empfindlich, um festzustellen, ob ein Milsen-Graft überlebt wird, da der Großteil der Milzzellen tot wäre, wenn die Milzstifte nekrotisch wären. Die technischen Herausforderungen dieses Verfahrens, die häufigen Komplikationen und deren Fehlerbehebung sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Um die Transplantation nach der Transplantation zu testen, wurde die Färbung von Haemotoxylin und Eosin (H & E) in den Farben BALB//c bei POD 1 und POD 7 durchgeführt. Die repräsentativen Bilder sind in Abbildung3 zu sehen. Die Architektur der Milz isografts blieb in der ersten postoperativen Woche intakt. Das rote Fruchtfleisch, weißes Fruchtfleisch und die Randzone waren noch klar und unterscheidbar. Um die Zellmigration nach der Milsentransplantation zu untersuchen, wurde die Strömungszytometrie bei POD 1 und POD 7 durchgeführt, um die Phenotypen von Leukozyten in den Milz Isografts, Lymphknoten, Blut und Knochenmark zu untersuchen. Wie in Abbildung 4Agezeigt, wurden bei POD 1,51 ± 7% (Mittelwert ± SD, wie unten) der Milzzellen von Spendern abgeleitet und 46 ± 3% von Empfänger abgeleitet. Bei POD 7 entfielen 32 ± 10% der gesamten Milzzellen auf die von Gebern abgeleiteten Leukozyten, bei den Empfängerzellen waren es bis zu 56 ± 13%. Wir beobachteten auch, dass Milzleukozyten bereits am ersten Tag in die Lymphknoten, das Blut und das Knochenmark einwanderten und an Tag 7 (Abbildung 4B) beibehalten wurden, wodurch eine einzigartige Chimäre entstand, die für die Splenozytenhandelsforschung wertvoll ist.

Tabelle 1: Fehlerbehebungsmethoden.

Figure 1
Abbildung 1: Spenderleen-Ernte. (A) Die kurze Magenvene, die an der Milz befestigt ist, kaubern. (B) Ein kleines Stück steril warmes nasses Gaze über die Milz legen, um es feucht zu halten. (C) die Portalvene hinter der Bauchspeicheldrüse isolieren und isolieren. D) Ligate die Seitenzweige der Portalvene und legen Sie eine Naht um die Portalvene distal, um die prächtigen Vene. Die gestrichelten Leitungen stellen den Standort dar, der sich später für die Anastomose mit dem Empfänger IVC überschreitet. (E) Die Milz auf die rechte Seite des Bauches (Chirurgen links) umdrehen, um die Aorta und den Zöliakie-Stamm mit seinen Zweigen einschließlich der prächtigen Arterie zu entlarven. F) die aortische-zelliziaf-präsige Arterie durch die Ligierung der beiden anderen Zweige trennen und mobilisieren. (G) Eine Naht um die Aorta in der Nähe der Zöliakie-Arterie platzieren. Die gestrichelten Linien stellen den Ort dar, der sich später für die Anastomose mit der Empfängerabdominalaorta umstellt. (H) Nachdem die Aorta ligiert und die Portalvene durchquert wurde, parieren Sie die Milzveredelung mit 10 ml heparinierter Saline durch die Aorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Legen-Graft-Implantation. A) Nach der Isolierung und dem Kreuzkammern der Aorta und des IVC, machen Sie eine Längsaortotomie und Venotomie in der Aorta bzw. IVC. (B-D) Legen Sie die Milz Graft auf der rechten Seite des Bauches (Chirurgen links). Machen Sie die Ende-zu-seitige Anastomose zwischen der Spenderarette und der vorderen Wand der Aortotomie des Empfängers, mit 2-3 Bissen fortgesetzter Naht. (E) Drehen Sie die Milz auf die linke Flanke des Empfängers; Wiederholen Sie das bisherige Verfahren zwischen der Spenderarchette und der hinteren Wand der Aortotomie des Empfängers und schließen Sie die Naht an der Außenseite der Aorta. (F-G) Machen Sie eine Ende-zu-seitige Anastomose zwischen der Spenderportale und der hinteren Wand des IVC des Empfängers, mit 4 bis 5 Bissen durchgehender 11-0 Nylonnaht im Inneren des IVC und schließen Sie dann die Naht an der Außenseite des IVC. H) Nach Abschluss der Anastomose die Gefäßklemmen freigeben und einige Baumwollknospen legen, um die Blutung zu stoppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Histologie der Milz ist die Abbildung am ersten Tag und Tag 7 nach der Operation. Syngeneic spleen Transplantationen wurden mit BALB/mäusen durchgeführt. Die LEen-Is-Formen wurden am Tag 1 und Tag 7 nach der Transplantation geerntet und in 10% Formalin für 48 Stunden fixiert. H & E Färbung wurde mit Paraffin-eingebettetem Gewebe durchgeführt. Die repräsentative Histologie zeigt, dass die Milz ist Abserfiken bei 1 Woche nach der Transplantation intakt bleiben. Skalierbalken = 250 μm. POD, postoperativer Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4: Die Chimäre, die durch syngeneische Milztransplantationentstanden ist. Drei syngenförmige Milschen-Transplantationen wurden mit BALB/CD45.2 Mäuse als Spender und BALB/CD45.1 Mäuse als Empfänger durchgeführt. Die Milztransplantationen, Blut, Lymphknoten (LN) und Knochenmark (BM) bei Empfängermäusen wurden am Tag 1 und Tag 7 nach der Transplantation geerntet. Zur Analyse des Phenotyps der Zellen wurden eine Einzelzellen-Isolierung und eine Fließzytometrie-Analyse durchgeführt. A) repräsentative Punktplots (Gating aus Live-Singlets), die die Prozentsätze von Spender oder Empfängern — abgeleiteten Leukozyten in den angegebenen Proben anzeigen. (B) Prozente (Mittelwert ± SEM) der angegebenen Populationen in den angegebenen Proben an Tag 1 und Tag 7. POD = postoperativer Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Grundstücke (n = 3), die die Prozentsätze von Spenderabgeleitet gegenüber den vom Empfänger abgeleiteten Lymphozyten in der transplantierten Milz, Lymphknoten, Blut und Knochenmark anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Grundstücke (n = 3), die die Prozentsätze von Spendern im Vergleich zu den von Empfängern abgeleiteten CD11b+Ly6C+monocytes in der transplantierten Milz, Lymphknoten, Blut und Knochenmark anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Begabende Hinweise deuten darauf hin, dass lärm abgeleitete Monozyten eine wichtige Rolle bei sterilen Entzündungsprozessenwie Atherosklerose 19, akuter ischämischer Hirn-20 oder Lungenverletzung18sowie Myokardverletzungen bei I/R spielen und Umbau21,22,23. In diesen Berichten wird die Rolle der Milz bei vielen chronischen Krankheiten hervorgehoben, von denen Herz-Kreislauf-Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen (vor allem, wenn sie weltweit die tödliche tödliche tödliche Rolle spielt). Das Mausmodell der Milztransplantation bietet eine großartige Gelegenheit, die Rolle von Milzkörpern bei verschiedenen Krankheiten zu entdecken und zu entdecken, wie sie in der Milz grundiert werden. Durch die Verwendung der Mausmodelle der Milztransplantation hat Swirski et al. festgestellt, dass als Reaktion auf ischämische Myokardverletzungen die von Milz abgeleiteten Monozyten ihre Beweglichkeit erhöhen, aus der Milz wandern, sich an verletztes Gewebe halten und zur Wundheilung17. Darüber hinaus ist dieses Modell nützlich, um die Langlebigkeit der reifen Immunzellen in den Milz und den zugrunde liegenden Mechanismen zu adressieren und therapeutische Potenziale der Milztransplantation zu erforschen.

Mehrere Aspekte sollten berücksichtigt werden, um den Erfolg dieses Protokolls zu verbessern. Zunächst ist es wichtig, während des Entwurfsprozesses die richtigen Versuchstiere auszuwählen, da das Mausgewicht, die Belastung und der Gesundheitszustand die Schwierigkeit der chirurgischen Schritte und der experimentellen Ergebnisse beeinflussen könnten. Unser Labor empfiehlt, 8 bis 12 Wochen alte Mäuse mit einem Gewicht von über 25 g zu verwenden, um die Sterblichkeit zu verringern, die durch Blutungen verursacht werden könnte. Zweitens kann während des Milzerntemisches eine zu große Manipulation der Milzgefäße leicht zu einer Zucht oder zu Vasospasmus führen und möglicherweise zu Mikrothrombose im Milzverstärker führen. Die Anatomie des Mausbaus vor der Operation kennenzulernen, wäre hilfreich, um den Lernprozess zu beschleunigen. Drittens sollte während der Empfängerchirurgie die Milzveredelung immer feucht und kühl gehalten werden. Ein geeigneter Schutz von Milbenstiften könnte die Transplantationsverletzung (I/R) verringern und einen Graft-Ausfall nach der Transplantation verhindern. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Spendergefäße bei der Anastomose relativ lang sind, die Milzverpflanung vor der Anastomose richtig zu positionieren, um eine Verdrehung der Gefäße zu verhindern. Darüber hinaus sollten die Durchmesser der Empfängeraortotomie und Venotomie von IVC immer mit denen der Spenderaorta und Portalvene vergleichbar sein, um den richtigen Blutfluss zu gewährleisten und Thrombosen zu verhindern.

Die durchschnittliche Lagerzeit der Milzverpflanzung in 4 ° C Salz beträgt ca. 10 min. Die gesamte ischämische Zeit sollte auf weniger als 50 min begrenzt werden, um einen minimalen Transplantationsausfall zu gewährleisten. Wir empfehlen, die Kühllagen-Lösung der University of Wisconsin (UW) zu verwenden, um die Milzveredelung zu erhalten, wenn in Studien über 1 h Kälte, ischämische Zeit benötigt wird. Es ist zu beachten, dass ein kleiner Teil der Bauchspeicheldrüse eng mit der Milz befestigt ist, und der Versuch, das Ganze aus den Milzverpflanzungen zu entfernen, würde leicht zu Graft-oder Gefäßkomplikationen führen und die Betriebszeit deutlich erhöhen. Wir beobachteten, dass das Bauchspeicheldrüsengewebe, das an der Milzverpflanzung befestigt ist, bei POD 7 einer Atrophie unterzogen werden würde, obwohl einige bei den Milzverpflanzen lebensfähig blieben. Ob das Bauchspeicheldrüsengewebe mit Milzverpflanzen entfernt werden soll, hängt von den Forschungszwecken ab.

Die Verfügbarkeit von kongenen Mäusen hat es ermöglicht, die Herkunft der Milzzellen, Spender versus Empfänger nach der Transplantation zu verfolgen. In dieser Studie haben wir BALB/c CD45.2 und BALB/c CD45.1 kongene Mäuse als Spleen-Spender und Empfänger verwendet, um ein syngeneisches Milschvermehren-Transplantationsmodell zu erstellen. Organ-oder Gewebetransplantation zwischen diesen kongenen Mausstämmen wurde häufig verwendet, um die Entstehung und die Entwicklung des Immunsystems zu verfolgen. Trotz des jüngsten Berichts über eine Punktmutation im Zusammenhang mit CD45.1, die die NK-Zellantwort 24 beeinflusst, wurde keine Transplantationsabstoßungzwischendiesen Dehnkombinationen gemeldet. Wir beobachteten einen erheblichen Zustrom von Empfängerzellen in Milzverpflanzen, der bereits bei POD 1 auftrat. Es ist wahrscheinlich, dass die Empfängerzellen auf die Transplantation I/R-Verletzung reagierten, da die Mehrheit der Empfängerzellen Granulozyten waren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass ein relativ hoher Anteil an splenischen Lymphozyten von Spenderangaben übrig blieb. Interessanter ist, dass diese Lymphozyten in anderen Lymphfächern (Lymphknoten, Knochenmark und Kreislauf) nach (neu besiedelt) wanderten. Diese Befunde lassen uns spekulieren, dass Lymphozyten, die aus Milz stammen, für die adaptive Immunität sehr wichtig sind. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die unterschiedlichen Rollen von prächtigen Lymphozyten in adaptiver und angeborener Immunität zu beschreiben (Abbildung4, Ergänzungsabbildung 1 und Ergänzungsabbildung2).

Die größte Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es eine umfangreiche mikrochirurgische Ausbildung für Personen mit eingeschränkter mikrochirurgischer Erfahrung erfordert, um diese Technik zu beherrschen. Basierend auf unserer Lernerfahrung in der gesamten Maus feste Organtransplantationsmodelle (z. B. Mausherz, Lunge oder Nierentransplantation), kann es 6-10 Monate dauern, bis eine neu ausgebildete Person (ohne experimentelle mikrochirurgische Technik) dies gekonnt beherrscht. technik. Im Vergleich zu Mausmodellen von Herz-oder Nierentransplantation könnte dieses Modell schwieriger sein, da es zusätzliche Gewebeabschnittsschritte beinhaltet, um die Milzveredelung während der Spenderverfahren zu isolieren. Zudem ist der Durchmesser des Spenderportals Vene (etwa 0,6 mm) kleiner als der IVC, was die Anastomose erschwert. Eine weitere Einschränkung ist, dass nicht klar ist, ob die veredelte Milz in der späteren Transplantationsphase massiv von den Zellen des Empfängers eindringen würde (z.B. POD 60). Dieses Modell ist aber auch wegen seiner zahlreichen Vorteile sehr attraktiv. Erstens teilen Mäuse und Menschen eine beträchtliche Bandbreite ähnlicher Genome und ermöglichen so eine relativ genaue Darstellung einer realistischen Anwendung. Darüber hinaus ist im Vergleich zum Mausmodell der nicht-vaskularisierten Milbenautotransplantation mit den Abschnitten des splenischen Gewebes, ist dieses vaskularisierte Milztransplantationsmodell weniger wahrscheinlich, Komplikationen wie aseptische Nekrose des Splenen-Gewebes zu entwickeln und Kleine Darmverstopfung durch postoperative Klebstoffe.

Das Mausmodell der Milztransplantation wurde zuvor von Swirski FK et al. Die ausführlichen Informationen wurden jedoch nicht beschrieben.  Unsere Studie bietet ein umfassendes Schritt-für-Schritt-Protokoll der Maus-Milse-Transplantation für interessierte Forscher, um diese Technik zu verfolgen und zu mattieren. Darüber hinaus werden mit diesem Protokoll mehrere unnötige Schritte beseitigt, die im Bericht von Swirski FK et al. (z.B. die Gallenkantenligation) beschrieben sind, und führt die 11-0-Naht für Anastomose ein, die helfen würde, die Operationszeit zu verkürzen und die Blutung zu verhindern.

Zusammenfassend könnte dieses Modell ein mächtiges Werkzeug sein, um die Mechanismen der splenischen Zellpopulation bei Reaktionen auf Krankheitserreger, Verletzungen, Entzündungen oder Transplantationsabstoßungen zu erforschen und ist wertvoll für den Test des therapeutischen Potenzials der Milz. Transplantation. Mit entsprechender Ausbildung und Übung kann dieser Eingriff mit & gt;90% Erfolg durchgeführt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken dem Comprehensive Transplant Center der Northwestern University und dem Programm der Feinberg School of Medicine Research Cores für die Ressourcen-und Förderförderung. Insbesondere wurden die Flow-Cytometrie und Histologie von der Nordwestuniversität Flow Cytometry Core Facility und Mouse Histology und Phenotyping Laboratory erbracht, die beide von NCI P30-CA060553 unterstützt werden, die an den Robert H verliehen wurden. Lurie Comprehensive Cancer Center. Wir danken Herrn Nate Esparza für die Lektüre dieses Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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