Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

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Summary

Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, un modelo técnicamente desafiante que puede servir como una herramienta poderosa en el estudio del destino y la longevidad de las células del bazo, los mecanismos de distinto bazo las poblaciones celulares en progresión de la enfermedad e inmunidad al trasplante.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

El bazo es un órgano linfoide único que desempeña un papel crítico en la la homeostasis de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Los pacientes que se han sometido a una esplenectomía, independientemente de las causas desencadenantes, son propensos a desarrollar una infección de post-esplenectomía abrumadora y experimentan un mayor riesgo de trombosis venosa profunda y neoplasias malignas. Recientemente, los estudios epidemiológicos indicaron que la esplenectomía podría estar asociada a la aparición de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que las funciones fisiológicas del bazo aún no se han reconocido plenamente. Aquí, presentamos un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, que no sólo se puede utilizar para estudiar la función y la actividad conductual de los subconjuntos de células inmunitarias esplénica en diferentes procesos biológicos, sino que también puede ser una herramienta poderosa para probar el potencial terapéutico del trasplante de bazo en ciertas enfermedades. Los principales pasos quirúrgicos de este modelo incluyen la cosecha del bazo del donante, la extirpación del bazo nativo receptor y la revascularización del injerto del bazo. Utilizando cepas de ratón Congénicos (p. ej., ratones con fondos de CD 45.1/CD 45.2), observamos que después del trasplante singénico, los linfocitos esplénicos derivados de donantes y las células mieloide migraron del injerto tan pronto como el día 1 postoperatorio, concomitantemente con la afluencia de múltiples tipos de células destinatarias, generando así una quimera única.  A pesar de las técnicas relativamente desafiantes, este procedimiento se puede realizar con > 90% tasa de éxito. Este modelo permite rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos durante el estado estacionario y en un entorno de enfermedad después de un trasplante de bazo, ofreciendo así una gran oportunidad para descubrir el papel distintivo de las células inmunes derivadas del bazo en diferentes procesos de la enfermedad.

Introduction

El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo y es crítico en los sistemas inmunológico y hematopoyético. Sus funciones se llevan a cabo principalmente por dos compartimentos morfológicamente distintos, la pulpa roja y la pulpa blanca1. La pulpa roja es una malla tridimensional de senos venosos y cuerdas esplénica que consisten en fibras reticulares, células reticulares y macrófagos asociados. Esta estructura única permite que la pulpa roja actúe como un filtro sanguíneo eficaz que elimina los materiales extraños y los eritrocitos viejos o dañados. La pulpa blanca incluye folículos, zona marginal y vainas linfoides periarteriolares (PALS) y es un sitio importante para la captura y procesamiento de antígeno, el homing de linfocitos, la transformación, la proliferación y la maduración2. Sin embargo, el bazo se ha considerado comúnmente como un órgano prescindible porque otros órganos linfáticos, como los ganglios linfáticos, también pueden llevar a cabo algunas de sus funciones y la pérdida del bazo no suele conducir a la muerte. Por lo tanto, la esplenectomía se ha realizado ampliamente como un método terapéutico para pacientes con lesión esplénica o enfermedades hematológicas benignas3. Sin embargo, los pacientes con esplenectomía enfrentan una serie de complicaciones a largo plazo. Las infecciones bacterianas son las complicaciones mejor reconocidas de la esplenectomía4,5. Recientemente, la abrumadora sepsis post-esplenectomía ha sido reconocida como una complicación intensiva de la esplenectomía asociada a una alta mortalidad6. Por otra parte, estudios epidemiológicos recientes indican que la esplenectomía puede estar asociada a la ocurrencia de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que aún quedan por explorar las funciones fisiológicas del bazo7,8.

En la clínica se han utilizado tanto autotrasplante de bazo como alotrasplante de bazo. Actualmente, el autotrasplante de bazo mediante la implantación de secciones de tejido esplámico en bolsas creadas en el epiplón mayor se considera como la única posibilidad para preservar la función esplénica después de la esplenectomía traumática9,10. Sin embargo, la eficacia de esta cirugía es discutible como complicaciones post-cirugía como necrosis aséptica del tejido esplémico y la obstrucción del intestino delgado debido a adherencias postoperatorias podrían ocurrir11. La alotrasplante de bazo está implicada en el trasplante multivisceral12. La evidencia clínica del trasplante multivisceral sugiere que el alotrasplante de bazo puede desempeñar un papel protector en el rechazo de los aloinjertos intestinales pequeños sin causar enfermedad de injerto contra huésped (EICH)12. Sin embargo, la literatura sobre el efecto beneficioso del alotrasplante de bazo como componente del trasplante multivisceral sigue siendo limitada y los mecanismos subyacentes permanecen por definir. En 2006, Yair Reisner y otros informaron que el trasplante de tejido de bazo embrionario de cerdo que no tiene células T a los ratones podría curar la hemofilia a, una enfermedad genética sin causar la EICH13, apoyando que el transplante de bazo tiene una promesa terapéutica en ciertas enfermedades. Por lo tanto, es necesario seguir investigando sobre el potencial terapéutico del trasplante de bazo.

Los modelos animales de trasplante de bazo son valiosos para explorar la función no apreciada de las células inmunes derivadas del bazo en la progresión de la enfermedad, así como para probar el posible efecto terapéutico del trasplante de bazo. Se han documentado modelos experimentales de trasplantes de bazo enteros desde principios de 1900, según lo revisado por Cohen14. En 1969, Coburn Richard J. y Lee et al. detalló la técnica del trasplante de bazo en ratas15,16. Más recientemente, SWIRSKI FK y otros describieron un modelo de ratón de trasplante de bazo17. En comparación con los modelos de ratas, los modelos de ratones de trasplante de bazo son más atractivos debido a sus diversas ventajas inherentes. Por ejemplo, al utilizar un modelo de ratón, podemos acceder a una amplia variedad de reactivos no disponibles para los modelos de ratas. Por otra parte, mediante el uso de ratones Congénicos (por ejemplo, ratones con CD 45.1/CD 45.2 fondo), un trasplante singénico de bazo hace posible rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos18. Basado en el trabajo de SWIRSKI FK et al.17, también establecimos este protocolo simplificado y mejorado de trasplante de bazo en ratones. El protocolo descrito a continuación combina la confiabilidad y la viabilidad de una manera estandarizada y se puede utilizar como una herramienta para estudiar la biología del bazo y la inmunidad al trasplante.

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Protocol

Todos los procedimientos y el uso de animales en este estudio se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité interno de cuidado y uso de animales de la Universidad del noroeste (IACUC). En este estudio, de 8 a 10 semanas de edad, CD 45.2 y CD 45.1 ratones (tanto en el fondo BALB/c, del laboratorio Jackson) se utilizaron como donantes de bazo y receptores, respectivamente, para crear modelos de trasplante de bazo singénico. Todos los animales fueron alojados en el ambiente estéril en las instalaciones de animales de la Universidad de Northwestern. El lubricante ocular se aplicó a todos los ratones después de la anestesia para prevenir la sequedad.

1. preparación quirúrgica, anestesiación, y régimen de analgesia

  1. Coloque un paño desechable estéril (45,7 cm x 66 cm) en la plataforma quirúrgica. Agarrar suavemente el ratón, inyectar ketamina (50 mg/kg) y xylazina (10 mg/kg) intraperitonealmente (i. p) para la anestesia, e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia.
  2. Asegure la profundidad de la anestesia con un pellizco, afeite el cabello en toda la zona del abdomen con una cuchilla y coloque el ratón sobre la plataforma quirúrgica estéril bajo el microscopio de operación a una magnificación de 6-10X.

2. cosecha del bazo del donante

  1. Esterilizar el abdomen con una almohadilla de preparación de alcohol, asegurar las extremidades con cinta quirúrgica, y hacer una incisión de la piel vertical de 3-4 cm de línea media desde el pubis al proceso Apéndice xifoides con tijeras.
  2. Retracción de la pared abdominal con retractores estériles hechos de clips de papel. Mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen (izquierda del cirujano) con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo. Cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo con un cauterio estéril de baja temperatura (figura 1A). Coloque un pedazo de gasa estéril empapada con una solución salina de 37 ° c sobre el bazo para mantenerla húmeda (figura 1B).
  3. Separar y movilizar la vena porta del tejido pancreático (figura 1C) ligando las ramas de la vena porta (vena pancreática superior y vena gástrica derecha); colocar una sutura alrededor de la vena porta distal de la vena esplénica (Figura 1D).
  4. Voltear el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y el tronco celiaco con la arteria esplénica (Figura 1E). Diseccionar y movilizar arteria aórtica-celiaca-esplénica ligando la arteria hepática y la arteria gástrica; colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la Arteria celíaca (Figura 1F-G).
  5. Inyectar 100 unidades internacionales (UI) de heparina en la vena cava inferior (IVC) para heparinizar todo el cuerpo y esperar 3 min para asegurar que la heparina tenga efectos. Ligate la aorta proximal a la arteria celiaca, transecciona la vena porta, y luego perfuca todo el cuerpo usando 10 mL de solución salina heparinizada (4 ° c) (10 mL/20 s) desde la aorta abdominal distal hasta el tronco celiaco (figura 1H).
  6. Recoger el injerto de bazo en bloque con el segmento aórtico-celiaco-esplénica asociado y la vena porta junto con un segmento de vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. Conservar el injerto en 5 mL de solución salina a 4 ° c antes del trasplante. Eutanasia al ratón por dislocación cervical.

3. implantación de la esplenectomía del receptor y del injerto del bazo

  1. Coloque una almohadilla térmica en la plataforma quirúrgica y ajuste la temperatura a 37 ° c. Coloque un paño estéril (45,7 cm x 66 cm) en la parte superior de la almohadilla térmica para crear una plataforma quirúrgica estéril. Repita los pasos 2,1 y 2,2 para la preparación quirúrgica y la anestesia. Haga una incisión de la línea media de 3-4 cm y retracto la pared abdominal como se describe en el paso 2,1 y el paso 2,2.
  2. Mueva con cuidado el intestino al lado derecho del ratón con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo del receptor. Ligate la vena esplénica y la arteria y retira el bazo.
  3. Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del ratón y cubra los intestinos con gasa húmeda (empapado con solución salina estéril de 37 ° c). Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarrenal y la IVC; abrazadera cruzada de la aorta infrarrenal y de la IVC mediante el uso de dos abrazaderas microvasculares de 4 mm.
  4. Colocar una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarrenal (un espesor completo) y retraer para crear una aortotomía elíptica por un solo corte con microtijeras (la longitud debe coincidir con el diámetro de la aorta donante, figura 2A). Perforar la IVC usando una aguja de 30 G para crear una venotomía elíptica y extender la abertura a la longitud de la vena del portal del donante usando microtijeras (figura 2A).
  5. Eliminar la sangre intraluminal o el coágulo sanguíneo (en la aorta y la IVC) con 500 μL de solución salina heparinizada (10 unidades/mL).
  6. Coloque el injerto de bazo en el flanco derecho del abdomen del receptor del ratón; Identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta del donante. Después de asegurarse de que los recipientes no están retorcidos, cubra el injerto de bazo con gasa empapada con suero salino frío (4 ° c).
  7. Conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortatomía del receptor con dos suturas de estancia (11-0 sutura de nylon, igual que la siguiente) (figura 2B, C). Haga una anastomosis con 2-3 picaduras de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la aortatomía del receptor (pared anterior) (Figura 2D). Gire el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor; hacer la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la aortotomía del receptor (pared posterior) (Figura 2E).
  8. Realizar una anastomosis para conectar la vena porta del donante a la pared posterior de la IVC del receptor, utilizando de 4 a 5 picaduras de suturas continuas en el interior de la IVC y luego cerrar la sutura en el exterior de la IVC (figura 2F, G).
  9. Suelte las abrazaderas del recipiente y use un hisopo de algodón estéril para tapar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo (figura 2H).
  10. Cerrar el abdomen con una sutura de vicryl sintética absorable 5-0 en un patrón continuo. Cierre la capa de piel con una sutura de nylon 5-0 en un patrón interrumpido.
    Nota: Para los pasos 4.7-4.8, alternativamente, haga una anastomosis entre la vena porta del donante y la IVC del receptor primero (paso 4,8); luego hacer una anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía del receptor, usando de 2 a 3 suturas continuas en el interior de la aorta y cerrar la sutura en la parte exterior de la aorta.

4. recuperación de animales

  1. Inyectar 1 mL de solución salina tibia por vía subcutánea a través de 4 lugares separados (0,25 mL/ubicación) después de cerrar el abdomen.
  2. Mantenga el ratón en una incubadora de temperatura controlada (30 ° c) durante las primeras horas posteriores a la operación, supervise el ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente y, a continuación, transfiera el ratón a una nueva jaula limpia con alimentos y agua regulares, con una almohadilla térmica (30 ° c ) debajo de la jaula. Mantenga el ratón después de la cirugía en una jaula separada.

5. manejo del dolor post-quirúrgico

  1. Inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina subcutáneamente 24 h y 48 h después de la cirugía para mantener el régimen de analgesia.

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Representative Results

Todo el procedimiento de trasplante de bazo de ratón se puede completar dentro de 90 min por microcirujanos experimentados. Nuestro laboratorio ha realizado más de 100 trasplantes de bazo en ratones. La tasa de éxito es más de 90%, como se define por la supervivencia del ratón receptor y el injerto de bazo para el día postoperatorio (POD) 1 o POD 7 (nuestro punto final del estudio). La supervivencia del injerto del bazo fue confirmada por la apariencia macroscópica y el análisis de citometría de flujo de los esplocitos. Basándonos en nuestra experiencia, el análisis de citometría de flujo (ensayos de viabilidad de células vivas/muertas) es muy sensible para determinar si un injerto de bazo es sobrevivido, ya que la mayoría de las células del bazo estarían muertas si los injertos del bazo fueran necróticos. Los desafíos técnicos de este procedimiento, las complicaciones comunes y su solución de problemas se resumen en la tabla 1.

Para probar la morfología del injerto después del trasplante, la tinción de Haemotoxylin y Eosin (H & E) se realizó en isoinjertos de bazo de ratones BALB/c en POD 1 y POD 7. Las imágenes representativas se muestran en la figura 3. La arquitectura de los isoinjertos de bazo permaneció intacta durante la primera semana postoperatoria. La pulpa roja, la pulpa blanca y la zona marginal seguían siendo claras y distinguibles. Para investigar la migración celular después del trasplante de bazo, la citometría de flujo se realizó en el POD 1 y el POD 7 para examinar los fenotipos de leucocitos en los isoinjertos de bazo, los ganglios linfáticos, la sangre y la médula ósea. Como se muestra en la figura 4a, en el POD 1, 51 ± 7% (media ± SD, igual que abajo) de las células del bazo fueron derivadas de donantes y 46 ± 3% fueron derivados del receptor. En el POD 7, los leucocitos derivados de donantes representaron 32 ± 10% del total de células del bazo, y las células derivadas del receptor fueron de hasta 56 ± 13%. También observamos que los leucocitos de bazo migraron a los ganglios linfáticos, la sangre y la médula ósea tan pronto en el día 1 y se mantuvieron en el día 7 (Figura 4B), generando una quimera única valiosa para la investigación sobre el tráfico de esplocicitos.

Tabla 1: Métodos de solución de problemas.

Figure 1
Figura 1: cosecha del bazo del donante. (A) cauterizar la vena gástrica corta adherido al bazo. (B) Coloque un pedazo pequeño de gasa húmeda caliente estéril sobre el bazo para mantenerlo húmedo. (C) diseccionar y aislar la vena porta detrás del páncreas. (D) ligar las ramas laterales de la vena porta y colocar una sutura alrededor de la vena porta distal a la vena esplénica. Las líneas discontinuas representan la ubicación del enfermo posterior para la anastomosis con la IVC receptora. (E) voltear el bazo hacia el lado derecho del abdomen (izquierda del cirujano) para exponer la aorta y el tronco celiaco con sus ramas, incluyendo la arteria esplénica. (F) diseccionar y movilizar la arteria aórtica-celiaca-esplénica ligando las otras dos ramas. (G) Coloque una sutura alrededor de la aorta proximal a la Arteria celíaca. Las líneas discontinuas representan la transección de la ubicación más tarde utilizada para la anastomosis con la aorta abdominal receptora. (H) después de la ligadura de la aorta y la transección de la vena porta, perfume el injerto de bazo con 10 ml de solución salina heparinizada a través de la aorta. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: implantación del injerto de bazo. (A) tras el aislamiento y la sujeción cruzada de la aorta y la IVC, hacer una aortotomía longitudinal y venotomía en la aorta y la IVC, respectivamente. (B-D) Coloque el injerto de bazo en el lado derecho del abdomen (lado izquierdo del cirujano). Haga la anastomosis de extremo a lado entre el manguito aórtico del donante y la pared anterior de la aortotomía del receptor, usando 2-3 picaduras de sutura continua. (E) gire el injerto de bazo hacia el flanco izquierdo del receptor; repetir el procedimiento anterior entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía del receptor y cerrar la sutura en la parte exterior de la aorta. (F-G) Hacer una anastomosis de extremo a lado entre la vena porta donante y la pared posterior de la IVC del receptor, utilizando de 4 a 5 picaduras de sutura de nylon continua 11-0 en el interior de la IVC y luego cerrar la sutura en el exterior de la IVC. (H) después de completar la anastomosis, suelte las abrazaderas del recipiente y coloque algunos brotes de algodón para ayudar a detener el sangrado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: histología representativa de los isoinjertos de bazo en el día 1 y el día 7 después de la operación. Las transplantaciones de bazo singénico se realizaron utilizando ratones BALB/c. Los isoinjertos de bazo se cosecharon el día 1 y el día 7 después del trasplante y se fijan en un 10% de formalina para 48 h. la tinción de H & E se realizó utilizando la sección de tejido incrustado de parafina. La histología representativa muestra que los isoinjertos de bazo permanecen intactos a 1 semana después del trasplante. Barra de escala = 250 μm. POD, día postoperatorio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La quimera creada por un trasplante singénico de bazo. Se realizaron tres transplantaciones de bazo singénico utilizando BALB/c CD 45.2 ratones como donantes y BALB/c CD 45.1 ratones como receptores. Los injertos de bazo, la sangre, el ganglio linfático (LN) y la médula ósea (BM) en ratones receptores se cosecharon el día 1 y el día 7 después del trasplante. Se realizaron análisis de aislamiento y citometría de flujo de una célula para analizar el fenotipo de las células. (A) parcelas representativas de puntos (compuerta de singlets vivos) que muestren los porcentajes de donante o receptor: leucocitos derivados en las muestras indicadas. (B) porcentajes (media ± SEM) de las poblaciones indicadas en las células derivadas de los donantes en las muestras indicadas al día 1 y día 7. POD = día postoperatorio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: parcelas representativas (n = 3) que muestran los porcentajes de los linfocitos derivados del donante versus los derivados del receptor en el bazo trasplantado, el ganglio linfático, la sangre y la médula ósea. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: parcelas representativas (n = 3) que muestran los porcentajes de los monocitos derivados del donante versus CD11b + Ly6C + derivados del receptor en el bazo trasplantado, el ganglio linfático, la sangre y la médula ósea. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Una evidencia convincente sugiere que los monocitos derivados del bazo desempeñan un papel importante en los procesos inflamatorios estériles como la aterosclerosis19, el cerebro isquémico agudo20 o la lesión pulmonar18, así como la lesión I/R miocárdica y Remodelación21,22,23. Estos informes destacan el papel de subreconocimiento del bazo en muchas enfermedades crónicas, de las cuales la enfermedad cardiovascular es una importante (especialmente dado que es el asesino número uno a nivel mundial). El modelo de ratón del trasplante de bazo ofrece una gran oportunidad para descubrir el papel de las células inmunes derivadas del bazo en diversas enfermedades, así como la forma en que están cebadas en el bazo. Por ejemplo, mediante el uso de los modelos de ratón de trasplante de bazo, SWIRSKI et al. descubrió que en respuesta a una lesión miocárdica isquémica, los monocitos derivados del bazo aumentan su motilidad, migran fuera del bazo, se adhieren al tejido lesionado y contribuyen a la curación de heridas17. Además, este modelo es útil para abordar las longevidades de las células inmunitarias maduras en el bazo y los mecanismos subyacentes y para explorar potencialidades terapéuticas del trasplante de bazo.

Deben tenerse en cuenta varios aspectos para mejorar el éxito de este protocolo. En primer lugar, es fundamental elegir los animales experimentales apropiados durante el proceso de diseño, ya que el peso del ratón, la cepa y la condición de salud podrían afectar la dificultad de los pasos quirúrgicos y los resultados experimentales. Nuestro laboratorio recomienda el uso de ratones de 8 a 12 semanas de edad con más de 25 g de peso para disminuir la mortalidad que podría ser causada por el sangrado. En segundo lugar, durante el procedimiento de la cosecha del bazo, demasiada manipulación de los vasos del bazo podría conducir fácilmente a la cría o vasoespasmo y potencialmente resultar en micro trombosis en el injerto de bazo. Familiarizarse con la anatomía del abdomen del ratón antes de la cirugía sería útil para acelerar el proceso de aprendizaje. En tercer lugar, durante la cirugía receptora, el injerto de bazo siempre debe mantenerse húmedo y fresco. Una protección adecuada de los injertos de bazo podría reducir la lesión por isquemia/reperfusión (I/R) del trasplante y prevenir el fracaso del injerto después del trasplante. Además, teniendo en cuenta que los vasos donantes para la anastomosis son relativamente largos, colocar los injertos de bazo correctamente antes de que la anastomosis sea fundamental para evitar la torsión de los vasos. Además, los diámetros de la aortotomía y venotomia receptora de la IVC deben ser siempre comparables a los de la aorta del donante y la vena porta para asegurar el flujo sanguíneo adecuado y prevenir la trombosis.

El tiempo medio de almacenamiento de los injertos de bazo en solución salina de 4 ° c es de alrededor de 10 min. El tiempo total isquémico debe limitarse a menos de 50 min para asegurar la falla mínima del trasplante. Recomendamos el uso de la solución de almacenamiento en frío de la Universidad de Wisconsin (UW) para preservar el injerto de bazo, si más de 1 h de frío, se necesita tiempo isquémico en los estudios. Cabe señalar que una pequeña porción del páncreas íntimamente unida con el bazo, y tratar de eliminar el todo de los injertos de bazo fácilmente conduciría a complicaciones de injerto o vascular y notablemente aumentar el tiempo de operación. Observamos que el tejido pancreático adherido al injerto del bazo se sometiera a atrofia en el POD 7, aunque algunos seguían siendo viables con los injertos de bazo. Si se retira o no el tejido pancreático asociado con injertos de bazo depende de los propósitos de la investigación.

La disponibilidad de ratones Congénicos ha hecho posible rastrear el origen de las células del bazo, donante versus receptor después del trasplante. En este estudio, se utilizaron BALB/c CD 45.2 y BALB/c CD 45.1 ratones Congénicos como donantes de bazo y receptores para crear un modelo de trasplante de bazo singénico. El trasplante de órganos o tejidos entre estas cepas de ratones Congénicos ha sido ampliamente utilizado para rastrear el origen y el desarrollo del sistema inmunológico. A pesar del reciente informe sobre una mutación puntual asociada al CD 45.1 que influye en la respuesta de la célula NK24, no se notificó rechazo de trasplante entre estas combinaciones de cepas. Observamos una afluencia sustancial de células receptora en injertos de bazo que ocurrieron tan pronto como en el POD 1. Es probable que las células de los receptores respondieron a la lesión de I/R del trasplante, ya que la mayoría de las células destinatarias eran granulocitos. Nuestros resultados mostraron que un porcentaje relativamente alto de linfocitos esplémicos seguía siendo de origen donante. Más interesante, estos linfocitos migraron a (repoblado) en otros compartimentos linfoides (ganglio linfático, médula ósea, y la circulación). Estos hallazgos nos sirven para especular que los linfocitos que se originaron a partir de los bazos son muy importantes en la inmunidad adaptativa. Sin embargo, se requieren más investigaciones para delinar las funciones distintivas de los linfocitos esplénica en la inmunidad adaptativa versus innata (figura 4, figura complementaria 1 y figura complementaria 2).

La principal limitación de este protocolo es que requiere una extensa formación microquirúrgica para las personas con experiencia microquirúrgica limitada para dominar esta técnica. Basándonos en nuestra experiencia de aprendizaje en los modelos de trasplante de órganos sólidos globales (p. ej., trasplante de corazón de ratón, pulmón o riñón), puede tomar 6-10 meses para una persona recién entrenada (sin ninguna técnica experimental microquirúrgica) para dominar hábilmente este Técnica. Comparado con los modelos de ratones de corazón, o trasplante de riñón, este modelo podría ser más desafiante ya que implica pasos adicionales de disección de tejido para aislar el injerto de bazo durante los procedimientos del donante. Por otra parte, el diámetro de la vena porta donante (alrededor de 0,6 mm) es más pequeño que el IVC, lo que hace que sea más difícil para la anastomosis. Otra limitación es que no está claro si el bazo injertado sería invadido masivamente por las células del receptor en la fase posterior del trasplante (por ejemplo, POD 60). Sin embargo, este modelo también es muy atractivo por sus varias ventajas inherentes. En primer lugar, los ratones y los humanos comparten una gama sustancial de genomas similares, permitiendo así una representación relativamente precisa de una aplicación realista. Por otra parte, comparando con el modelo de ratón de autotrasplante de bazo no vascularizado utilizando las secciones de tejido esplénica, este modelo de trasplante de bazo vascularizado es menos probable que desarrolle complicaciones tales como necrosis aséptica del tejido esplénica y obstrucción intestinal pequeña debido a adherencias postoperatorias.

El modelo de ratón del trasplante de bazo ha sido reportado previamente por SWIRSKI FK et al. Sin embargo, no se describió la información detallada.  Nuestro estudio proporciona un protocolo integral paso a paso de trasplante de bazo de ratón para que los investigadores interesados sigan y para Mater esta técnica. Además, este protocolo elimina varios pasos innecesarios descritos en el informe de SWIRSKI FK et al (p. ej., la ligadura del conducto biliar) e introduce la sutura 11-0 para la anastomosis, que ayudaría a acortar el tiempo quirúrgico y prevenir el sangrado.

En conclusión, este modelo podría ser una herramienta poderosa para explorar los mecanismos de la población celular esplénica en respuestas a patógenos, lesiones, inflamación, o rechazo de trasplante y es valioso para la prueba del potencial terapéutico del bazo Trasplante. Con la formación y la práctica adecuadas, este procedimiento se puede realizar con > 90% de éxito.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el centro integral de trasplantes de Northwestern University y el programa de núcleos de investigación de Medicina Feinberg para apoyo de recursos y financiamiento. Concretamente, la citometría de flujo y los servicios de histología fueron proporcionados por el centro de citometría de flujo de la Universidad Northwestern y el laboratorio de histología y fenotipos de ratones, respectivamente, ambos apoyados por el NCI P30-CA060553 otorgado al Robert H Centro de cáncer integral de Lurie. Agradecemos al Sr. Nate Esparza la revisión de este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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