Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

Developmental Biology

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Summary

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

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Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

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Abstract

Nós relatamos que o electroporation de mRNA permite proteínas fluorescentes etiquetar pilhas em embriões de codorniz vivos mais rapidamente e amplamente do que o electroporation do ADN. A eficiência elevada do transfection permite pelo menos 4 mRNAs distintos ser co-transfected com eficiência do ~ 87%. A maioria dos mRNAs em é degradada durante os primeiros 2 h borne-Electroporation, permitindo que os experimentos tempo-sensíveis sejam realizados no embrião tornando-se. Finalmente, nós descrevemos como dinamicamente imagem embriões vivos em com os mRNAs que codificam várias proteínas fluorescentes alvejadas subcellular.

Introduction

O electroporation é um método físico do transfection que use um pulso elétrico para criar pores transientes na membrana de plasma, permitindo que as substâncias como ácidos nucleicos ou produtos químicos passem no cytosol. O electroporation é amplamente utilizado para entregar o ADN nas bactérias, no fermento, nas plantas, e nas pilhas mamíferos1,2,3. É rotineiramente usado para introduzir cargas genéticas em células-alvo e tecidos dentro do embrião aviário em desenvolvimento para estudar o controle genético do desenvolvimento ou rotular populações migratórias de células4,5,6, o 7. Entretanto, várias limitações experimentais também existem com a eletroporação do DNA8. Por exemplo, o electroporation do ADN introduz frequentemente números altamente variáveis de vetores da expressão por a pilha e subseqüentemente o mRNAs e as proteínas que codificam. Essa variabilidade pode levar a uma considerável heterogeneidade celular que complica tanto a análise de imagem quanto a interpretação dos dados9,10. Adicionalmente, as proteínas do Electroporation do ADN começam somente expressar ~ 3 h borne-Electroporation e não alcangam a eficiência máxima no número de pilha e na intensidade da fluorescência até 12 h, provável devido ao tempo exigido para transferir no núcleo e terminar transcrição e tradução in vivo11.

Em contraste, o transfection de mRNA foi usado eficazmente em uma variedade de sistemas modelo, incluindo oócitos de Xenopus laevis pelo microinjection12,13, reprogramando pilhas de haste humanas pelo transfection 14 do Lipofectamine do mRNA , e electroporating pilhas de haste neural recalcitrantes em ratos adultos15. Nós testamos a habilidade do Electroporation do mRNA para etiquetar eficientemente pilhas durante o desenvolvimento embrionário aviário adiantado usando in vitro os mRNAs sintetizados que codificam proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nossos estudos, utilizamos o vetor pCS2 +, um vetor de expressão multiuso que é comumente usado para expressar proteínas em embriões de Xenopus e zebrafish. Os promotores da polimerase do RNA SP6 e T7 no pCS2 + permitem a síntese de mRNA e proteína de qualquer gene clonado quando utilizado em um sistema de transcrição/tradução in vitro.

Aqui, Nós demonstramos que o electroporation de mRNA permite a expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulating da codorniz. Nós projetamos e gerou muitos dos vetores de expressão utilizados nesses estudos. Por exemplo, subclonamos o gene LifeAct-eGFP16 para o pCS2 + vector17 para expressar do promotor CMV e promotor SP6. O gene introduzido encontra-se a jusante do promotor SP6 e a montante da cauda de SV40 Poly (A)18. Nos embriões co-electroporated com mRNA e ADN, os FPs codificados de mRNAs transcritos in vitro foram detectados primeiramente dentro de 20 minutos do Electroporation, visto que os FPs dos vetores da expressão do ADN foram detectados somente após 3 h. codificação múltipla de mRNAs para nuclear, Golgi, e as proteínas da membrana podem ser em em um embrião simultaneamente, tendo por resultado a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas em pilhas individuais. Finalmente, usando uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (Frap), nós mostramos que uma maioria da deterioração em dos mRNAs dentro de 2 h. Assim, a produção inicial rápida da proteína combinada com a tradução nova limitada da proteína faz a Electroporation do mRNA uma técnica valiosa quando o controle temporal da expressão é necessário.

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Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas do Children ' s Hospital los Angeles e da Universidade do Sul da Califórnia institucional cuidados com animais e comitês de uso.

1. geração de vetores de expressão baseada em pCS2

  1. Para clonar pCS2. Lifeact-eGFP, prepare a espinha dorsal do vetor digerindo 2 μg de pCS2. CycB1-GFP (um constructo contendo uma pastilha diferente) com BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão adequado (ver tabela de materiais) diluído a 1x em uma reação total volume de 50 μL para 1 h a 37 ° c (ver Figura 1 para o esquema do procedimento de clonagem).
    1. Dephosphorylate os 3 ' OH extremidades livres da espinha dorsal do vetor da reação da enzima da limitação adicionando a fosfatase alcalina do camarão (1 U). Incubar por 30 min a 37 ° c.
    2. Executar toda a mistura em um 1% agarose gel/1x Tris Acetato de EDTA (TAE) tampão em 90 V para ~ 50 min e depois manchar o gel em uma 0,5 μg/mL solução de brometo de etídio em 1x TAE tampão para 15 min com suave de balanço. Além disso, certifique-se de carregar marcadores de peso molecular em uma pista livre para ajudar a determinar os tamanhos de DNA.
    3. Usando um transilluminator UV seguro do ADN para evitar entalhar DNAs, corte a espinha dorsal do vetor (tamanho de faixa esperado de 4kb) do gel do agarose rapidamente e isole o fragmento do ADN da parte do gel usando um jogo da purificação do gel usando instruções do fabricante.
  2. Simultaneamente com a etapa 1,1, prepare a pastilha digerindo 2 μg de pEGFP-N1-Lifeact com BglII (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão apropriado diluído a 1x em um volume de reação total de 50 μL por 1 h a 37 ° c. Funcione a mistura inteira em um gel do agarose de 1% para isolar a faixa de 800 BP como explicado previamente na etapa 1.1.2-1.1.3.
  3. Depois que o vetor e a inserção são purificados e quantificados no espectrofotômetro, combine 50 ng do vetor e 38 ng da inserção (relação do molar 1:3 do vetor à inserção) no amortecedor da ligase do ADN T4 antes de adicionar a ligase do ADN T4 para catalisar a reação da ligadura. Além disso, configure um controle sem DNA, apenas um controle vetorial e um controle de inserção. Incubar todas as reacções à temperatura ambiente durante 30 min.
    1. Transformar 1 μL de mistura (s) de ligadura em E. coli competente DH10. Além disso, transformar a água apenas controle negativo e 20 PG de pUC19 controle positivo. Espalhe bactérias em placas de agar de caldo Luria (LB) contendo 50 μg/mL de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° c.
    2. Na manhã seguinte, conte as colônias em cada prato.
      Nota: Idealmente, não deve haver colônias nas placas de controle negativo, > 100 colônias nas placas de ligadura vector + INSERT, e menos colônias na placa vetorial.
    3. Escolha pelo menos 8 colônias bacterianas da placa de agar transformadas com a mistura de ligadura vector + INSERT e inoculá-las usando palitos estéreis ou pontas de Pipet em 2 mL de caldo LB líquido contendo 50 μg/mL de ampicilina.
    4. Extraia o DNA de cada um dos clones usando kits de protocolo de plasmídeo comercial.
    5. Execute um resumo de restrição diagnóstica usando 500 ng de DNA de cada clone usando NotI (10 U) e BamHI (10 U) no tampão de digestão apropriado diluído para 1x por 1 h a 37 ° c e execute o DNA digerido em um gel de agarose 1% em 1x TAE buffer. Os tamanhos de banda esperados para clones pCS2. Lifeact-eGFP positivos são 3,9 KB e 978 BP.
    6. Transforme 1 pg-100 ng de DNA do clone positivo em e. coli competente DH10, e prepare 3-4 reações protocolo conforme detalhado em etapas anteriores para obter uma quantidade suficiente de DNA para reação de transcrição in vitro (mínimo de 10 μg).

2. preparação do mRNA por transcrição in vitro

  1. Linearize 10 μg de pCS2. LifeAct-eGFP na extremidade 3 ' da pastilha com NotI (10 U) em um tampão apropriado da digestão diluído a 1x em um volume total da reação de 50 μL em 37 ° c durante a noite.
    Nota: Para evitar a contaminação por RNase e reduzir a degradação do mRNA, use luvas durante o manuseio de amostras de mRNA.
  2. Purificar o DNA usando uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1, v/v).
    1. Adicionar 150 μL de água livre de RNase para fazer o volume total da reacção de digestão igual a 200 μL. Em seguida, adicione 200 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e vórtice a mistura por 20 s.
    2. Centrifugador em um microcentrífuga na velocidade máxima (18.400 x g) para 2 min. Remova com cuidado a fase aquosa superior que contem o ADN linearizada. Repita este passo para remover impurezas adicionais e tenha cuidado para não interromper o precipitado branco que pode se formar entre as fases líquida inferior e superior.
  3. Precipitate o ADN linearizada adicionando 1/10 acetato do sódio do volume 3M (RNase-livre) e 2,5 volumes de 100% etanol. Deixe a mistura a-20 ° c por > 30 min, em seguida, pellet o DNA por centrifugação na velocidade máxima (18.400 x g).
    1. Lave o pellet DNA com 70% etanol, em seguida, secar o pellet por > 5 min.
    2. Dissolva a pelota do ADN em 5 μL de água RNase-livre. Quantificar o DNA por Espectrofotômetro.
      Nota: A concentração esperada de DNA é de ~ 0,5-1 μg/μL com uma relação A260/A280 entre 1,7-2,0.
  4. Use 1 μg do DNA linearizado de pCS2. LifeAct-eGFP para transcrição in vitro (IVT). Siga as instruções do fabricante no kit comercial (ver tabela de materiais) para incluir 10 μL de tampão analógico (concentração final 0,8 mM) e NTPs (concentração final de 1 mM para ATP, CTP e TTP; 0,2 mM para GTP), 2 μL de tampão de reacção 10x (concentração final 1x), 2 μL de RNA polymerase de SP6, e água RNase-livre até 20 μL.
    1. Incubar a mistura IVT por cerca de 2 h ou mais, dependendo do tamanho da transcrição.
      Nota: 2 h incubação funciona bem para uma transcrição de 3 KB, mas a incubação durante a noite funciona melhor para transcrições que são maiores do que 5 KB.
    2. Para remover nucleotídeos livres da reação da transcrição, adicione 30 μl da solução da precipitação do RNA de LiCl (cloreto de lítio de 7,5 M, EDTA de 50 milímetros) para precipar o mRNA. Vórtice a mistura brevemente e armazene a-20 ° c por 30 min. Gire o mRNA para baixo por 15 min em um microcentrífuga na velocidade máxima (18.400 x g) e enxague com 70% de etanol (RNase-livre).
  5. Dissolver o mRNA sintetizado em 15 μL de água RNase-livre. Dispensar o mRNA sintetizado em 5 μL/tubo (total de 3 tubos) e coloc em-80 ° c para o armazenamento a longo prazo. Quantitate o mRNA com um espectrofotômetro.
    Nota: O rendimento esperado é de 15-20 μg de mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) é suficiente para um experimento com ~ 10 embriões, assumindo que o mRNA é diluído de 1 μg/μL para 500 ng/μL e que cada embrião é injetado com ~ 200 nL. Cada tubo deve, portanto, conter mRNA suficiente para ~ 5 experimentos.
  6. Run ~ 300 ng de mRNA em um gel de agarose 1% em 1x TAE buffer após a limpeza de todos os equipamentos de gel com a solução de descontaminação RNase (por exemplo, RNase Away) e garantir que o mRNA aparece como uma banda (várias bandas podem estar presentes se as estruturas secundárias formam) e que não esfregaço um ppears na pista do gel, que indica a degradação do RNA.

3. preparação de mRNA Electroporation Mix

  1. Thaw e diluir o mRNA na concentração desejada (250-500 ng/μL na água RNase-livre trabalha bem para todos os mRNAs testados neste trabalho). Adicionar 1/10 volume de corante colorido (ver tabela de materiais, RNAse-livre, 0,1% concentração final) para ajudar a visualizar o local de injeção de mRNA e colocar adequadamente os eletrodos.
    Nota:
    se o ADN e o RNA são combinados para executar um co-Electroporation, assegure-se de que o ADN esteja livre de contaminar RNases usando a extração do phenol-clorofórmio e a precipitação do álcool etílico antes da mistura do mRNA e do ADN.
    1. Certifique-se de preparar um controle negativo usando uma solução de Electroporation mock (sem RNA adicionado). Se possível, prepare um controle positivo usando mRNA pré-validado (mRNA que foi mostrado para produzir FP com sucesso em experimentos anteriores).
      Nota: O controle negativo é essencial para que todos os experimentos de imagem estabeleçam níveis de fluorescência de fundo para normalização dos dados. O controle positivo é especialmente importante quando se trabalha com mRNA recém-transcrito, ajudando a confirmar que as configurações de eletroporação funcionou.
  2. Armazene a solução do Electroporation de mRNA em uma pasta do gelo para impedir a degradação até pronto para prosseguir com Electroporation.

4. electroporate mRNAs em embriões de codorniz vivos

  1. Colete ovos de codorniz fertilizados recentemente colocados diariamente e armazene a 13 ° c em um refrigerador humidificado por não mais de 1 semana. Incubar os ovos de codorniz a 38 ° c até os estágios de desenvolvimento embrionário desejados19,20,21.
    Nota: HH3 a HH5 foram usados neste estudo para a imagem latente estática e dinâmica. Para embriões de HH3, deixar os ovos à temperatura ambiente durante 2 h antes da colheita torna o processo de isolamento muito mais fácil, uma vez que os embriões são geralmente mais resistentes às manipulações físicas quando arrefecidos.
  2. Isolar e preparar embriões de acordo com o sistema de cultura CE22. Colete pelo menos 5 embriões por condição, incluindo pelo menos um para servir como um controle negativo (não electroporated).
    1. Quebre suavemente e despeje o ovo em um prato de Petri de 10 cm. Remova a maioria da albumina grossa com uma pipeta de transferência e remova a albumina grossa restante em torno do embrião limpando delicadamente a superfície da gema com um apagamento do tecido para assegurar-se de que o embrião fura firmemente ao anel de papel.
    2. Coloque o papel de filtro pré-cortado (ver tabela de materiais) sobre o embrião e use tesouras para cortar suavemente em torno do perímetro do embrião.
    3. Use uma pipeta de Pasteur para fundamentam o embrião com PBS, usando córregos suaves para desocupar toda a gema que adere ao embrião.
      Nota: Este passo é crítico quando se trabalha com embriões mais jovens (< HH3), porque estes embriões tendem a ficar mais para a gema e muitas vezes se desprendem da membrana vitelina durante as etapas de lavagem subsequentes.
    4. Puxe lentamente o anel do embrião/papel em um ângulo oblíquo acima e fora da gema em um prato de Petri enchido com o PBS para uma limpeza mais adicional. Uma vez removida a maior parte da gema, coloque o lado ventral do embrião em uma placa de Petri de 35 mm, coberta com uma mistura semisólida de agar/albume.
  3. Prepare seis a 8 10 cm-microcapilares de vidro longos (O.D. = 1,2 milímetros) usando um instrumento de vidro do extrator da micropipeta.
  4. Coloc o lado ventral do embrião acima na câmara do Electroporation enchida com o PBS. Usando um microcapilar de vidro, injete um bolus de 200 NL da mistura do Electroporation do mRNA ou do ADN/mRNA na cavidade entre a membrana do epiblasto e do vitelina que cobre a região desejada.
    Nota: Toda a área anterior para pelúcida e alguma área para opaca foi eletroporada na maioria dos experimentos mostrados neste manuscrito.
  5. Coloc os elétrodos positivos e negativos (elétrodo quadrado liso da platina; comprimento lateral de 5 milímetros) na parte superior e na parte inferior do embrião respectivamente e electroporate usando a seguinte seqüência do pulso: cinco pulsos elétricos quadrados de 5 V, duração de 50 ms com intervalos de 100 ms usando um electroporator in vivo. Assegure-se de que a distância entre os eléctrodos é de ~ 5 mm.
    Nota: Otimizar os parâmetros de eletroporação é crucial para evitar condições que possam matar as frágeis células embrionárias. Os parâmetros da tensão, do comprimento de pulso, dos intervalos do pulso, e do número de pulsos para o ADN e o mRNA devem ser considerados para vários dispositivos do Electroporation.
  6. Incubar os embriões eletroporados a 38 ° c até o estágio de desenvolvimento desejado.
    Nota: Um estereoscópio de dissecação fluorescente (ver tabela de materiais) ajuda a tela transfected versus embriões não transfected.
  7. Se os embriões devem ser estaticamente imaged, corrigi-los em 4% paraformaldeído em PBS para 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° c.
    1. Remova os embriões da membrana do vitelina cortando lisamente em torno do perímetro do papel de filtro com tesouras e descascando fora a membrana brilhante na superfície dorsal com o fórceps afiado delicadamente.
    2. Lave os embriões fixos em PBS/Triton (0,1%) 2x por 5 min e continuar com hibridação in situ ou imunocoloração, se desejado.
    3. Finalmente, manchar o embrião em 0,5 μg/μL DAPI em PBS/Triton (0,1%) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Lave os embriões em PBS/Triton 2x durante 5 min e limpe o embrião na solução SCALE-U223 durante a noite.
  8. Para analisar a eficiência da eletroporação (veja a Figura 2), use a ferramenta de análise de partículas e binários e o canal DAPI no ImageJ para obter contornos nucleares de todas as células da imagem.
    1. Para usar a ferramenta binária no ImageJ, use um único z-Slice no canal DAPI que contém a maioria das células e clique em processar ≫ binário ≫ Make Binary. Para separar células próximas, clique em processar ≫ binário > bacia hidrográfica. Obter contornos de célula clicando em analisar ≫ analisar partículas, tamanho definido como 100-500 (μm2).
    2. Verifique se a maioria das células está descrita no canal DAPI e salve os contornos da célula clicando em mais ≫ salvar na janela pop-up do Gerenciador de ROI.
    3. Use esses contornos para obter valores de intensidade de fluorescência para o canal mRNA e DNA abrindo o arquivo salvo anteriormente em uma única fatia z no canal mRNA ou DNA e clique em medir no Gerenciador de ROI.
    4. Por fim, filtre esses valores de intensidade, contando células com intensidade de fluorescência de < 6000 como não transfectadas e células com intensidade de fluorescência de > 6000 como transfected.

5. imagem FPs codificado por mRNAs electroporated

  1. Escolha o embrião o mais saudável e o melhor em para os experimentos dinâmicos da imagem latente após ter oltado todos os embriões em o estereoscópio de dissecação fluorescente.
    1. Continuar a incubar os outros embriões eletroporados e o embrião não eletroporado (o controle negativo) em uma incubadora separada enquanto a imagem do embrião escolhido no caso deste embrião morre durante o experimento.
  2. Para a imagem latente dinâmica, use a cultura do embrião da aviária da inteiro-montagem ex ovo como descrita previamente24,25,26 com um microscópio confocal invertido.
    Nota:
    o microscópio é equipado com uma incubadora do estágio (veja a tabela dos materiais) que mantem a temperatura em 36 ° c durante a imagem latente. Observou-se durante o set-up do microscópio que os embriões incubados em 36 ° c sobrevivem mais por muito tempo do que em umas temperaturas mais elevadas, possivelmente porque o laser pode causar o aquecimento local no embrião. Os leitores devem determinar a temperatura de incubação em estágio ideal para sua própria set-up de microscópio.
    1. Para imagem dinamicamente e visualizar a embriogênese, limpe o embrião eletroporado brevemente com PBS para remover quaisquer bolhas que possam se formar no lado dorsal do embrião durante o processo de eletroporação, movendo o embrião em torno usando fórceps em um PBS limpo Solução.
    2. Coloque o embrião limpo diretamente em um prato de imagem contendo uma fina camada de albume-Agar (~ 150 μL) certificando-se de não gerar quaisquer bolhas na superfície dorsal do embrião22.
    3. Para assegurar a sobrevivência para a imagem latente a longo prazo, adicione um pedaço enrolado úmido pequeno do papel de tecido nas bordas do interior do prato da imagem latente e sele o prato usando a película de parafina para minimizar a evaporação durante a imagem latente e a incubação.
    4. Mova este prato rapidamente para o estágio pré-aquecido de um microscópio confocal e localize o corante colorido no embrião usando o canal brightfield (laser PMT 20%), que identifica a região injetada e em.
  3. Definir software de imagem para o objetivo desejado (10 ou 20x), espelho dicróico (488 nm para GFP nm, 561 para RFP), espectros de emissão (499-562 nm para GFP, 570-695 nm para RFP), e ligar um laser apropriado (488 nm para GFP, 561 nm para RFP).
    Nota:
    o mRNA electroporated foi traduzido nas proteínas que foram consideradas dentro de 20 minutos (veja Figura 3). Os metadados de imagem utilizados para a maioria das imagens neste trabalho foram: um microscópio confocal invertido com um objetivo de 20x (ver tabela de materiais); tempo de permanência do pixel, ~ 1,5 μs; média de varreduras de 4 linhas.
    1. Clique em Live no software de imagem e ajuste a potência do laser para uma configuração apropriada para a intensidade de fluorescência, dependendo de cada potência do laser do microscópio. Comece por imagem o embrião usando 1% de potência do laser, 800 ganho, e aumentar a potência do laser lentamente por incrementos de 1% até que os pixels saturados são vistos.
    2. Siga isto diminuindo a potência do laser ligeiramente até que nenhum pixel saturado seja visto anymore.
      Nota: O poder do laser escolhido para o começo de uma sessão da imagem latente de um embrião pode ser bom para uns pontos mais adiantados do tempo mas não ideal em uns pontos mais atrasados do tempo se a fluorescência das pilhas se torna muito mais brilhante ou mais dimmer sobre o tempo. Para abordar isso, a imagem do embrião em configurações de energia ligeiramente inferiores inicialmente, uma vez que as células eletroporadas geralmente obter mais brilhantes durante as primeiras 6 horas após a electroporação (ver Figura 3a-E para a quantificação do aumento do sinal). Se as imagens posteriores estiverem saturadas, continue a imagem com as configurações de imagem originais, mas tome uma imagem adicional imediatamente após com configurações de imagem mais fracas (pinhole menor ou potência laser mais fraca).
    3. Imagem do embrião a cada 3-5 min, a fim de rastrear a migração de células individuais em diferentes pontos temporais. Para este trabalho, as imagens eram z-pilhas (~ 50 μm grossos) da área em inteira, mais algum quarto extra para a parte inferior da z-pilha caso que o embrião afunda na cama do agarose durante todo a sessão da imagem latente.
    4. Observe o quão rápido as células estão se movendo, verificando os primeiros pontos de tempo do primeiro filme. Se as células estão se movendo em uma taxa rápida (o que significa que eles vão sair da área da região imaged dentro de um par mais pontos de tempo), considere expandir o zoom da área imaged (1x à 0.8 x) ou imagem de uma região diferente.
      Nota: As regiões Embryonic na área pelúcida movem-se muito mais ràpida do que aquelas na área opaca. Adicionalmente, os embriões mais novos (HH3, HH5) contêm frequentemente as pilhas que estão submetendo-se a um movimento mais rápido comparado aos embriões mais velhos (> HH7).
    5. Após a imagem da região eletroporada do embrião, uma região não-eletroporada do mesmo embrião para determinar os níveis de autofluorescência (deve ser mínima se a baixa potência do laser < 10% é usada para a imagem do embrião).

6. recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) para a integridade do mRNA do ensaio

Nota: Uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (FRAP) pode ser usada para determinar quanto tempo transfected o mRNA poderia ser traduzido em FPs. O protocolo a seguir descreve uma experiência de FRAP para detectar a meia-vida de H2B. MRNA citrino em um embrião em.

  1. Realize experimentos de FRAP no microscópio confocal invertido usando um objetivo de 20x 0,8 NA e um furo de pino completamente aberto.
    1. Após ter confirmado o electroporation de H2B-Citrine no estereomicroscópio e em ajustar o embrião no estágio Pre-heated no microscópio confocal invertido (veja a etapa 5.2.4), photobleach a maioria da fluorescência celular do H2B-citrino em uma variedade de tempo pontos (45 min, 2 h e 5 h pós-eletroporação) usando o laser de 405 nm com 70% de potência laser, 100 iterações, velocidade de digitalização 4, que deixa apenas 5% de fluorescência restante.
      Nota: Este processo deve demorar alguns minutos.
    2. Continuar a incubar os embriões no estádio a 36 ° c após o fotobranqueamento.
  2. Certifique-se de prestar atenção para dividir ativamente as células dentro da região fotobranqueada, que indicam que as células fotobranqueadas não morreram completamente após o tratamento.
  3. Adquira imagens pós-lixívia (pilhas z da região eletroporada) por até 30 min em intervalos regulares de tempo (3 ou 5 min) usando o microscópio confocal.
    Nota: Se disponível, use uma linha transgênica do H2B-XFP como um controle positivo para assegurar a sobrevivência da pilha na região photobleached. A taxa de recuperação da fluorescência para o FP codificado pelo mRNA em deve diminuir, mas aquela para o FP codificado através do transgene deve permanecer consistente durante todo o filme inteiro.
  4. Para garantir que as condições de imagem não afetam de forma deletária a sobrevida embrionária, incubar simultaneamente embriões eletroporados que não são fotobleached, o que pode servir como um controle para a imagem.
  5. Para quantificar os resultados de fotobranqueamento para pós-eletroporação de decaimento de mRNA, acompanhe a fluorescência da célula ao longo do tempo (3 ou 5 min) medindo a intensidade de fluorescência do centro (um círculo de 7,5 μm) de cada célula usando ImageJ. Meça isto para todas as células dentro da região fotobranqueada que não estão submetidas a mitose e foram completamente fotobranqueadas.
    Nota: Considere omitir as células mitóticas da quantificação, uma vez que os núcleos mitóticos têm fluorescência mais forte do que os núcleos interfásicos devido à condensação da cromatina.
  6. Plotar a intensidade de fluorescência ao longo do tempo pós-lixívia em uma variedade de pontos temporais (45 min, 2 h e 5 h).

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Representative Results

o electroporation do mRNA é mais eficiente do que o electroporation do ADN

Nós usamos pCS2 +. H2B-Citrine para preparar in vitro transcrito mRNA. Como a eletroporação de DNA geralmente é realizada em 1-2 μg/μL, utilizou-se uma concentração equimolar de mRNA (calculada para ser em torno de 0,25-0,5 μg/μL para H2B-citrino) para eletroporação de mRNA. Nós testamos primeiramente a eficiência do Electroporation de pCS2 +. DNA H2B-citrino comparado ao mRNA H2B-citrino (in vitro transcrito do promotor SP6 de pCS2 +. H2B-citrino) por electroporating DNA ou mRNA separadamente em HH5 embriões de codorniz então examinando a eficiência do Electroporation em 12 h borne-Electroporation. Embora o electroporation do ADN conduza à fluorescência mais brilhante em algumas pilhas em, a eficiência do Electroporation do ADN era visivelmente mais baixa comparada ao mRNA extensamente-expressado FPS codificado (Figura 2a e B).

Para responder à variabilidade inerente do embrião-à-embrião no protocolo do Electroporation, uma combinação do equimolar da codificação H2B-Citrine do mRNA e do ADN que expressam H2B-mKate2 foi em no ectoderme de embriões HH5 e observou 12 h pós-eletroporação. Ao comparar o DNA e a coeletroporação do mRNA no mesmo embrião, o DNA expressando o FP também foi significativamente e consistentemente menos eficiente do que o do mRNA (Figura 2C). Ao quantificar todos os embriões eletroporados com apenas mRNA, DNA, ou uma combinação dos dois, verificou-se que os transfectos de mRNA ~ 75% das células em uma determinada região, enquanto o DNA só transfects ~ 25% das células em uma determinada região (Figura 2D). O spread na expressão de proteínas fluorescentes codificadas por mRNA ou DNA não foi significativamente diferente em todos os embriões coeletroporados (Figura 2e).

A expressão da proteína é mais rápida no Electroporation do mRNA do que o electroporation do ADN

O mRNA transfected deve conduzir à produção mais rápida da proteína desde que pode imediatamente ser reconhecido pela maquinaria citosólico da tradução como visto em Figura 3. O DNA deve ser translocalizado para o núcleo, transcrito, e o mRNA transportado de volta para o citosol, onde é reconhecido por máquinas de tradução citosólica, espera-se levar mais tempo. Para comparar diretamente o mRNA versus as taxas de expressão de DNA da produção de proteínas, realizou-se uma série de experimentos de curso de tempo em que nós co-electroporated uma combinação equimolar de DNA (pCMV. H2B-mKate2) e mRNA (H2B-citrino) no ectoderma de HH5 embriões. Nós detectamos a expressão FP mRNA-codificada ao redor 22 minutos borne-Electroporation, que continua aumentando na intensidade relativa da fluorescência para ~ 6 h (Figura 3a-E, suplementar. Filme S1b). Em contraste, a expressão FP codificada pelo DNA é vista pela primeira vez em ~ 1,5 h pós-eletroporação (Figura 3a'-E ', suplementar. Filme S1c) e continua a aumentar em brilho até 6 h quando o filme foi interrompido. Porque as pilhas em ADN foram saturadas pela marca de 6 h, nós reimaged esta circunstância com as condições de imagem latente mais fracas (Figura 3F-f ' '). Através de todos os pontos do tempo deste lapso de tempo (22 min a 6 h), o mRNA transfects diversas vezes mais pilhas do que o ADN (suplementar. Filme S1A, a eficiência total do Electroporation através do brightfield e do DAPI não é mostrada porque estas imagens são tomadas de um lapso de tempo de um tipo selvagem embrião de codorniz). Baseado nisto, nós concluímos que o electroporation do mRNA conduz à proteína expressada mais adiantada.

O co-Electroporation de mRNAs múltiplo é altamente eficiente

Em seguida, procurou-se testar ainda mais a eficiência da eletroporação de mRNA eletroporando múltiplos mRNAs em uma região de interesse. O co-Electroporation de DNAs múltiplo tinha sido mostrado previamente para ser relativamente ineficiente, mostrando com o número de ser multi-labeled sendo 25%, 14%, e 10% para 2, 3, e 4 construções do ADN electroporated, calculado como uma proporção do número total de pilhas11 . Nós em primeiramente dois mRNAs que codificam espectralmente o FPS distinto (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) em embriões HH5 e obteve a eficiência elevada do transfection em todas as regiões em. Utilizamos este duplo-Electroporation para captar filmes de expansão radial entre área pelúcida e opaca em um embrião gastrulating HH4, imaged 2 h post-Electroporation (suplementar filme S2a, b, e c). O H2B-Citrine é localizado dentro do núcleo da pilha e permite que a proliferação da pilha seja traçada27. O Turquoise2-Golgi FP aparece para mostrar a polaridade subcelular dentro das células embrionárias, mas não parece correlacionar com a velocidade ou direção de células Ectoderma em movimento in vivo28. Este filme (filme suplementar S2) mostra que as células eletroporadas com múltiplos mRNAs podem continuar a atividade celular normal sem quaisquer defeitos aparentes.

Além disso, o co-Electroporation de 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (para visualizar o instrumento de Golgi), LifeAct-eGFP (para visualizar o F-Actin), H2B-citrino (para visualizar o núcleo), e o FP da membrana-cereja (para visualizar membranas)-conduziu ao transfection de 87% eficiência de todos os 4 mRNAs em todas as regiões eletroporadas (Figura 4). O lifeact-EGFP e o H2B-Citrine foram separados pela ferramenta de processamento linear separação no software comercial.

O ensaio de Frap mostra a degradação rápida do mRNA em durante as primeiras duas horas borne-Electroporation.

É bem sabido que os mRNAs nus são rapidamente degradados pelas RNAases celulares29. Nós Postulamos que o electroporation do mRNA pôde ser útil para a perda ou os experimentos do ganho--função permitindo a expressão rápida e eficiente das proteínas em um embrião tornando-se. Conseqüentemente, seria útil quantificar a taxa de deterioração do mRNA após o electroporation do mRNA, desde que o mRNA degrada mais rapidamente do que o ADN nas pilhas. Em relatórios precedentes do Electroporation do mRNA em pilhas de haste neural adultas do rato, ao redor 80% mRNA foi identificado o borne-Electroporation de 2 h pelo qRT-PCR, contudo pouco a nenhum mRNA foi detectado por 24 h borne-Electroporation15. Procurou-se quantificar ainda mais a expressão de mRNA pós-eletroporação, projetando um ensaio de FRAP in vivo para detectar níveis de mRNA em células eletroporadas.

O fotobranqueamento é a destruição irreversível do fluoróforo que pode ocorrer quando o fluoróforo (proteínas fluorescentes no nosso caso) está em estado excitado, o que elimina a fluorescência durante a observação30,31. Qualquer luz emitida proveniente de proteínas fluorescentes (FPs) que podem ser detectadas em células fotobranqueadas acima dos níveis basais deve, portanto, representar FPs recém-traduzidos codificados por mRNAs intactas e transfectadas. Conseqüentemente, nós procuramos photobleach as pilhas em para eliminar toda a fluorescência FP-derivada existente em uma variedade de pontos do tempo e para seguir a recuperação subseqüente da fluorescência.

Usando configurações de fotobranqueamento otimizadas como descrito na seção de protocolo, descobrimos que o fotobranqueamento inicialmente reduz a intensidade de fluorescência em todas as células fotobranqueadas por ~ 95% quando analisado imediatamente após o evento de fotobranqueamento. Isso foi feito em 45 min, 2 h e 5 h pós-eletroporação (Figura 5a-C). A recuperação da fluorescência em cada célula dentro da região fotobranqueada foi rastreada durante um período de 30 min após o fotobranqueamento em cada ponto de tempo por imagem da mesma região em intervalos regulares (3 ou 5 min). Nossos dados sugerem que há uma diminuição significativa nos níveis transfected do mRNA entre 45 minutos e borne-Electroporation de 5 h. Isto é mostrado pela grande diminuição em FRAP medido em 5 h comparado a 45 min borne-Electroporation. Para destacar a recuperação de fluorescência nas células branqueadas, especialmente no ponto de tempo de 5 h, aprimoramos o brilho na Figura 5a-C usando a ferramenta de brilho/contraste no ImageJ e mostramos essas imagens modificadas na Figura 5D-F. Curiosamente, há uma grande heterogeneidade na recuperação de fluorescência de célula a célula dentro da área fotobranqueada a 2 h porque algumas células recuperam fluorescência mais rápido do que outras células (Figura 5E ' ', veja pontas de seta). No entanto, todas as células dentro da área fotobranqueada de 5 h recuperam a fluorescência mais lentamente (Figura 5F ' ') do que as células fotobranqueadas a 2 h. Também detectamos células que se dividem ativamente em nossa região fotobranqueada, sugerindo que as células não morreram como resultado do processo de fotobranqueamento (Figura 5E ' ').

Nós quantificamos estes resultados na Figura 6a , mostrando a intensidade do sinal normalizado de cada célula dentro das áreas fotobranqueadas durante um período de 30 min após o evento de fotobranqueamento. Para cada célula, os valores de fluorescência foram normalizados contra a intensidade do sinal dessa célula imediatamente após o fotobranqueamento. Esta normalização foi feita para todas as células em todos os pontos de tempo imaged (45 min, 2 h, 5 h). Os valores normalizados de recuperação de fluorescência das células dentro da mesma região branqueada de foto foram então agrupados e representados graficamente ao longo do tempo após o evento de fotobranqueamento; Portanto, cada ponto no gráfico representa ~ 35 células. Os dados não normalizados também são mostrados na Figura 6B, em que cada linha representa uma célula com a recuperação da intensidade do sinal de fluorescência imediatamente após o fotobranqueamento. Estes dados totais sugerem que por 5 h, todas as pilhas esgotem a maioria de seu mRNA, com uma grande parcela desta gota que ocorre entre 45 min e 2 h borne-Electroporation.

Figure 1
Figura 1: esquema do procedimento de clonagem para tornar o constructo pCS2 + LifeAct-eGFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: o electroporation do mRNA é mais eficiente do que o electroporation do ADN. (a-a ' ') O ADN que expressa pCS2. H2B-Citrine foi em no ectoderme de embriões HH5. A fluorescência foi observada 12 h borne-Electroporation. Barra de escala = 50 μm. (b-b ' ') o mRNA que expressa H2B-Citrine foi em no ectoderme de embriões HH5. A fluorescência foi observada 12 horas borne-Electroporation. Scale bar = 50 μm. (c-c ' ') a combinação equimolar de DNA (PCMV. H2B-mKate2) e mRNA (H2B-citrino) foi eletroporada em embriões HH5 e observou 12 h pós-eletroporação. Três embriões foram testados por condição (n = 2 experimentos). Barra de escala = 50 μm. (D) foram quantificados três embriões de a, B e C (9 embriões totais) para eficiência de eletroporação utilizando ferramenta de análise de partículas no ImageJ. Uma região de 200 μm de cada embrião foi quantificada (pelo menos 150 células foram contabilizadas por região). O traço médio representa a média, enquanto as barras superior e inferior representam o desvio padrão da média. (E) três embriões de co-em (ADN e mRNA) são analisados para a propagação do sinal através de todas as pilhas em em uma região dada do μm 200. Cada embrião teve ao redor 100 pilhas positivas para o electroporation do mRNA e as 30 pilhas positivas para o electroporation do ADN. O traço médio representa a média, enquanto as barras superior e inferior representam o desvio padrão da média. Não há nenhuma diferença significativa entre a propagação de mRNA contra o electroporation do ADN, mas o electroporation do mRNA é muito mais eficiente do que aquele do ADN. (A-C) Dimensões = 425,10 x 425,10 x 55 μm. pixel habitar 2,55 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio = microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) (A) Ex: 488 nm (0, 5%), faixa de emissão S1 = 508-579 nm; (B) ex = 488 nm (5,0%), faixa de emissão S1 = 508-579 nm; (C) ex = 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), faixa de emissão S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 nm por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: a eletroporação do mRNA mostra expressão por 22 min pós-eletroporação e é muito mais rápida que a eletroporação do DNA. Imagens representativas do curso do tempo após o mRNA (H2B-Citrine) e o ADN (pCMV. H2B-mKate2) eletroporação com análise de perfil de plotagem a 22 min (a-a ' '), 45 min (b-b ' '), 1,5 h (c-c ' '), 3 h (d-d ' ') e 6 h (e-e ' ') em início da imagem (n = 1). A análise de perfil de plotagem é fornecida para cada ponto de tempo mostrado na seta desenhada na imagem mesclada. Cada pico no perfil de plotagem representa o núcleo de uma célula eletroporada. As células geralmente se tornam mais brilhantes sobre o intervalo de 6 h do filme, indicando que o mRNA ainda está sendo traduzido em Nova proteína fluorescente. Para o ponto de tempo de 6 horas, as imagens da mesma região capturadas usando condições de imagem idênticas (e-e ' ') e as condições de imagem mais fracas (f-f ' ') são mostradas porque as imagens das células de DNA em foram altamente saturadas usando a inicial condições de imagem. Barra de escala = 20 μm. dimensões: 425,10 x 425,10 x 55 μm. a imagem é mostrada como uma projeção de intensidade máxima em todos os pontos de tempo imaged. Pixel habitar 2,55 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio = microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) para a inicial; Ex = 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) para o último ponto de tempo (Figura 2F), faixa de emissão S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: a co-electroporação de quatro mRNAs que visam diferentes estruturas subcelulares é altamente eficiente. O ectoderma de um embrião HH3 foi em com os mRNAs que codificam mTurquoise2-Golgi, lifeact-EGFP, H2B-citrino, e membrana-cereja. O embrião foi fixado e imaged em 4 horas borne-Electroporation. A maioria das células é eletroporada dentro da região de eletrodo direcionada com todos os quatro mRNAs (87%). Figuras representativas mostradas (3 embriões cada, n = 2 experimentos). Barra de escala = 50 μm. (A) mesclar todos os quatro mRNAs (MTurquoise2-Golgi, Lifeact-EGFP, H2B-citrino e membrana-cereja). (B) apenas canal H2B-citrino (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 nm). (C) apenas mTurquoise2-canal de Golgi (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 nm). (D) mesclar H2B-citrino e MTurquoise2-Golgi mostra que Golgi envelopes de um lado do núcleo na maioria das células. (E) apenas o canal lifeact-EGFP (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). (F) apenas canal de membrana-cereja (Ex = 594 nm (37,1%), em = S2:570-695 nm). (G) mesclar lifeact-EGFP e membrana-cereja mostra sobreposição na maioria das células. Dimensões = 425,10 x 425,10. Pixel habitar 1,58 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio = microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) Ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), faixa de emissão S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: o ensaio de fotobranqueamento mostra a rápida degradação do mRNA eletroporado durante as primeiras cinco horas pós-eletroporação. O fotobranqueamento de uma região de 100 μm ² contendo células eletroporadas com mRNA expressando H2B-citrino é realizado em 45 min, 2 h e 5 h pós-eletroporação. O embrião foi fotografado em intervalos regulares de tempo após o fotobranqueamento (3 ou 5 min). As condições de fotobranqueamento são as seguintes: 70% 405 nm laser, 100 iterações, cerca de 5 min de duração para toda a região. Barra de escala 50 = μm. (a-a ' ') 45 min pré e pós-lixívia. B mostra embrião imediatamente após o fotobranqueamento e C mostra embrião 30 min pós-alvejante. Barra de escala = 50 μm. (b-b ' ') 2 h pré e pós-lixívia. O perímetro do quadrado é deslocado porque as células dentro da região fotobranqueada se moveram ligeiramente durante o período de lixívia. (C-c ' ') 5 h pré e pós-lixívia. (d-d ' ') As mesmas imagens como A-A ' ' com brilho aprimorado (valor máximo ajustado para 11550 para aumentar o brilho pós-coleta). (e-e ' ') As mesmas imagens como B-B ' ' com brilho aprimorado (valor máximo ajustado para 11550 para aumentar o brilho pós-coleta). As pontas de seta brancas apontam para células que têm maior recuperação de fluorescência do que as células circundantes. A ponta de seta ciano aponta para uma célula fotobranqueada que sofreu recentemente a mitose. (f-f ' ') As mesmas imagens que C-C ' ' com brilho aumentado (valor máximo ajustado a 11550 para realçar a borne-coleção do brilho). Dimensões = 425,10 x 425,10 x 42 μm. a imagem é mostrada como uma projeção de intensidade máxima em todos os pontos de tempo imaged. Pixel habitar 1,58 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio = microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) ex = 488nm (1,5%), faixa de emissão S1 = 508-553 nm por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: quantificação da recuperação da fluorescência em células fotobranqueadas. (A) a intensidade de fluorescência de todas as células dentro das regiões branqueadas (~ 35 células) foi rastreada para cada célula única durante cada período de tempo pós-lixívia. Há uma grande gota na taxa de intensidade do sinal recuperado de 45 min a 2 h, seguido por uma gota menor de 2 h a 5 h. A barra de erro superior é mostrada para cada ponto, que representa o desvio padrão da média. A linha mostrada é uma linha de regressão linear. R ² para 45 min, 2 h e 5 h é 0,83, 0,58 e 0,84 respectivamente. A metade superior da barra de erro é mostrada para cada ponto. (B) a intensidade de fluorescência de todas as células dentro das regiões branqueadas (~ 35 células) foi rastreada para cada célula única durante cada período de tempo pós-lixívia e representada graficamente sem normalização. Há uma grande queda na taxa de intensidade do sinal recuperado de 45 min a 2 h, seguido por uma gota menor de 2 h a 5 h. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme complementar 1: o electroporation de mRNA conduz à expressão mais adiantada da proteína do que o electroporation do ADN. H2B-Citrine mRNA e H2B-mKate2 DNA em no ectoderme do embrião HH5. A região imaged está na beira do tecido extra-embrionário e embrionário. Barra de escala = 50 μm. (a) ambos H2B-Citrine e H2B-mKate2 canal mostrado (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2:605-661 nm). (b) apenas o canal mRNA H2B-citrino mostrado (Ex = 488 nm (15%), Em = 499-562 nm). (c) somente canal de DNA H2B-mKate2 mostrado (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 nm). Dimensões = 850,19 x 850,19 x 110 μm. a imagem é mostrada como uma projeção de intensidade máxima em todos os pontos de tempo imaged. Pixel habitar 2,55 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio: microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), faixa de emissão S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Filme complementar 2: o co-Electroporation de mRNAs permite que os comportamentos distintos da pilha sejam estudados dinamicamente. A expansão radial das pilhas entre a beira embrionário e extra-embrionário é em com o mRNA (H2B-Citrine e mTurquoise2-Golgi) e imaged durante a migração externa. Este filme foi fotografado por microscopia confocal de 2 a 5 h pós-eletroporação por imagem a cada 6 min. barra de escala = 50 μm.  (a) ambos os canais H2B-citrino e MTurquoise2-Golgi mostrados (Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em = 446-526 nm; S2:508-553 nm). (b) somente canal H2B-citrino mostrado (Ex = 488 nm (5,0%), em = S2:508-553 nm). (c) apenas mTurquoise2-canal de Golgi mostrado (Ex = 458 nm (28%), Em = 446-526 nm). Dimensões = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. a imagem é mostrada como uma projeção de intensidade máxima em todos os pontos de tempo imaged. Pixel habitar 0,79 μs. linha média 4. Bits por pixel = 16. Metadados do microscópio = microscópio confocal invertido, objetivo 20x (ver tabela de materiais) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), faixa de emissão S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 nm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Neste protocolo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre como precisamente microinjetar e electroporate mRNA nas células de embriões de codorniz gastrulating. Demonstramos que a eletroporação de mRNA sintetizada in vitro permite expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulantes de codorniz (Figura 2 e 3). A fluorescência da proteína H2B-citrina traduzida de mRNAs em podia ser detectada pela microscopia confocal dentro de ~ 20 minutos e aumentada na fluorescência do FP por horas (Figura 3, filme suplementar 1). Isto é surpreendentemente rápido e perto do tempo de maturação presumido para citrino32,33. Os FPs expressos a partir de vetores de DNA foram detectados após 2-3 h (Figura 3, suplementar. Filme 1), que é semelhante aos relatórios anteriores8,34,35. Vários FPs têm tempos de maturação únicos, então o planejamento avançado garantirá que o FP ideal seja escolhido em termos da distinção espectral e da cinética de maturação desejada para o experimento. Adicionalmente, os mRNAs sintetizados mais eficientemente cotransfect células embrionárias do que os vetores de DNA11. A maior eficiência de transfecção resulta em mais células sendo transfectadas na região de interesse com o único (Figura 2) ou com múltiplas populações de mRNAs (Figura 4).

A estabilidade do mRNA é altamente regulada e pode ser afetada por poliadenilação, splicing, tradução, estrutura secundária e regiões não traduzidas para citar alguns36,37. As meias-vidas de mRNA endógena e sintetizada dentro das células podem variar de minutos a dias36,38. Utilizou-se a recuperação da fluorescência in vivo após o fotobranqueamento (FRAP) para lixívia de proteínas H2B-citrina, codificadas com mRNA, e observou-se a mais apreciável recuperação da fluorescência H2B-citrina durante as primeiras 2 horas pós-eletroporação (Figura 5 e 6). mRNAs diferentes, sem dúvida, têm diferentes meias-vidas com base em seu comprimento, seqüências internas, 5 ' e 3 ' modificações36,37, assim, cada um deve ser analisado se desejado.

A imagem latente vital exige tipicamente um trade-off entre condições óptimas para a imagem latente de alta qualidade e a imagem latente rápida, menos-tóxica39,40. Quando a imagem latente, é aconselhável usar como a baixa potência do laser como possível minimizar o photobranqueamento e o photodamage às pilhas embrionário (veja notas para a etapa 5,3 do protocolo)40. Alterando a configuração do microscópio para coleções rápidas (por exemplo, velocidades de digitalização mais rápidas, menos média) muitas vezes podem ajudar sem perder a resolução de imagem necessária41. Finalmente, deve-se tomar cuidado ao manusear e manipular os embriões durante a colheita, eletroporação e imagem latente (ver passo 4). Os embriões de fase inicial são delicados e podem ser facilmente danificados.

Total, o sincronismo exato e a localização exata do Electroporation do mRNA permitem experimentos do perturbação que capitalizam na expressão rápida, na eficiência do co-transfection, e na deterioração rápida de transcritos do mRNA. A sobreexpressão ou o misexpression de um gene do interesse podem ser conseguida através do Electroporation de mRNAs sintetizados . Tittering a concentração para cada mRNA é crucial, porque electroporating demasiado mRNA pode causar a toxicidade celular não específica, quando demasiado pouco mRNA não pode etiquetar pilhas desejadas ou induzir mudanças fenotípicas adequadamente. Uma infinidade de vetores gerados para a síntese in vitro de mRNAs que codificam marcadores de fusões de FP para visualização ou produtos genéticos alterados para perturbações de diversos processos biológicos já existem a partir de vários sistemas de modelos animais. Muitos desses construtos projetados para a síntese de mRNA in vitro podem ser obtidos de forma rápida e barata a partir de repositórios de plasmídeo sem fins lucrativos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a David Huss por insights úteis sobre este trabalho. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de pesquisa de Verão de Rose Hills Foundation (2016-2018) e bolsista de pesquisa de graduação da USC Provost para a MT, o prêmio de pré-doutorado de treinamento intramural da Saban Research Institute para M.D., e a Universidade de Prêmio do programa de iniciação científica do Sul da Califórnia à R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

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References

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