Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi rapporterer Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metode, der tillader hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i vagtler embryo modelsystemet. Denne metode kan anvendes til fluorescently label celler og registrere deres in vivo bevægelser ved time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi rapporterer, at mRNA elektroporation tillader fluorescerende proteiner til at mærke celler i levende vagtler embryoner hurtigere og bredt end DNA-elektroporation. Den høje transfektering effektivitet tillader mindst 4 særskilte mRNAs at blive Co-transfected med ~ 87% effektivitet. De fleste af de elektro porterede mRNAs nedbrydes i løbet af de første 2 h post-elektro poration, hvilket tillader tidsfølsomme eksperimenter, der skal udføres i det udviklende embryon. Endelig beskriver vi, hvordan man dynamisk billede levende embryoner elektroporeret med mRNAs at indkode forskellige subcellulære målrettede fluorescerende proteiner.

Introduction

Elektro poration er en fysisk transfektering metode, der bruger en elektrisk puls til at skabe forbigående porer i plasma membranen, så stoffer som nukleinsyre eller kemikalier til at passere ind i cytosol. Elektro poration anvendes i vid udstrækning til at levere DNA til bakterier, gær, planter og pattedyrsceller1,2,3. Det bruges rutinemæssigt til at introducere genetiske nyttelast i målceller og væv inden for det udviklende aviær embryo for at studere den genetiske kontrol med udvikling eller mærke migrerende populationer af celler4,5,6, 7. Der findes dog også flere eksperimentelle begrænsninger med DNA-elektroporation8. For eksempel introducerer DNA-elektro portering ofte meget varierende antal udtryks vektorer pr. celle og efterfølgende mRNAs og proteiner, som de koder. Denne variation kan føre til en betydelig celle celle heterogenitet, der komplicerer både billedanalyse og data tolkning9,10. Desuden, proteiner fra DNA-elektroporation kun begynde at udtrykke ~ 3 h post-elektro poration og ikke når den maksimale effektivitet i celle nummer og fluorescens intensitet indtil 12 h, sandsynligvis på grund af den tid, der kræves for at overføre til kernen og komplet både transskription og oversættelse in vivo11.

I modsætning hertil har mRNA transfektering været anvendt effektivt i en række forskellige modelsystemer, herunder xenopus laevis oocytter ved mikroinjektion12,13, omprogrammering af humane stamceller ved mRNA lipofectamintransfection14 og elektroporerende genstridige neurale stamceller i voksne mus15. Vi testede mRNA electroporations evne til effektivt at mærke celler under tidlig aviær embryonal udvikling ved hjælp af in vitro syntetiserede Mrna'er, der indkoder distinkte fluorescerende proteiner (FPs). Til vores studier brugte vi pCS2 + Vector, en multifunktions ekspressions vektor, der almindeligvis anvendes til at udtrykke proteiner i xenopus og Zebra embryoner. SP6-og T7 RNA-polymerasepromotorerne i pCS2 + tillader syntesen af mRNA og protein fra ethvert klonet gen, når det anvendes i et in vitro-transskription/oversættelsessystem.

Her viser vi, at mRNA elektroporation giver mulighed for hurtig og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner (fps) i gastrulerende vagtler embryoner. Vi designede og genererede mange af de udtryks vektorer, der anvendes i disse studier. For eksempel under klappede vi LifeAct-eGFP gene16 i pCS2 + Vector17 for at udtrykke fra CMV promoter og SP6 Promoter. Det indsatte gen ligger nedstrøms for SP6-promotoren og opstrøms for SV40 poly (A) hale18. I embryoner Co-elektroporeret med mRNA og DNA, FPs kodet fra in vitro transkriberet mRNAs blev først detekteret inden for 20 min af elektro poration, hvorimod FPs fra DNA-udtryks vektorer blev detekteret først efter 3 h. multiple mRNAs kodning for nuklear, Golgi, og membran proteiner kan elektroporeres ind i et embryon samtidigt, hvilket resulterer i hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i individuelle celler. Endelig, ved hjælp af en in vivo fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) assay, viser vi, at et flertal af de elektro porterede mRNAs forfald inden for 2 h. Således, hurtig indledende protein produktion kombineret med begrænset ny protein oversættelse gør mRNA elektro poration en værdifuld teknik, når tidsmæssig kontrol af udtryk er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte retningslinjer fra children's Hospital Los Angeles og University of Southern California institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg.

1. generation, pCS2-baserede, udtryk vektorer

  1. At klone pCS2. Lifeact-eGFP, Forbered vektor rygraden ved at fordøje 2 μg pCS2. CycB1-GFP (en konstruktion, der indeholder et andet skær) med BamHI (10 U) og BsrGI (10 U) i passende fordøjelses buffer (se tabel over materialer) fortyndet til 1x i en samlet reaktion volumen på 50 μL i 1 time ved 37 °C (Se figur 1 for den skematiske klonings procedure).
    1. Dephosphorylate den frie 3 ' OH ender af vektor rygraden fra begrænsningen enzym reaktion ved tilsætning af rejer alkalisk fosfatase (1 U). Inkuber i 30 min ved 37 °C.
    2. Kør hele blandingen i en 1% agopstået gel/1x Tris acetat EDTA (TAE) buffer på 90 V for ~ 50 min og derefter plette gelen i en 0,5 μg/mL ethidium bromid opløsning i 1x TAE buffer til 15 min med blid Rocking. Sørg også for at indlæse molekylvægt markører i en fri bane for at hjælpe med at bestemme DNA-størrelser.
    3. Brug en DNA-sikker UV-Transilluminator til at undgå nicking DNAs, skær vektor rygraden (forventet bånd størrelse på 4kb) fra agrose gel hurtigt og Isoler DNA-fragmentet fra gel-stykket ved hjælp af en gelrensningskit ved hjælp af producentens anvisninger.
  2. Samtidig med trin 1,1 forberedes indsatsen ved at fordøje 2 μg pEGFP-N1-Lifeact med BglII (10 U) og BsrGI (10 e) i passende fordøjelses buffer fortyndet til 1x i en samlet reaktions volumen på 50 μL i 1 time ved 37 °C. Kør hele blandingen i en 1% agopstået gel for at isolere 800 BP-båndet som tidligere forklaret i trin 1.1.2-1.1.3.
  3. Efter både vektor og skær er renset og kvantificeret på Spektrofotometer, kombinere 50 ng af vektoren og 38 ng af indsatsen (1:3 Molar ratio af vektor at indsætte) i T4 DNA ubiquitinligase buffer før tilsætning af T4 DNA ubiquitinligase at katalysere ligationen reaktion. Derudover, oprette en ingen DNA-kontrol, en vektor kun kontrol, og en INSERT kun kontrol. Alle reaktioner ved stuetemperatur i 30 minutter inkubates.
    1. 1 μL af ligations blandingen (erne) omdannes til kompetente E. coli -DH10. Også omdanne vand kun negativ kontrol og 20 PG af pUC19 positiv kontrol. Spred bakterier på Luria bouillon (LB) agar plader indeholdende 50 μg/mL ampicillin og Inkuber natten over ved 37 °C.
    2. Den følgende morgen tæller kolonierne på hver plade.
      Bemærk: Ideelt set bør der ikke være kolonier på de negative kontrol plader, > 100 kolonier på vektor + Indsæt ligationplader og færre kolonier på Vector-only pladen.
    3. Vælg mindst 8 bakterielle kolonier fra agar pladen transformeres med vektor + Indsæt ligering blanding og inokulere dem ved hjælp af sterile tandstikker eller pipet spidser til 2 ml flydende lb bouillon indeholdende 50 μg/ml ampicillin.
    4. Uddrag DNA fra hver af klonerne ved hjælp af kommercielle plasmid miniprep kits.
    5. Kør en diagnostisk begrænsnings-Digest ved hjælp af 500 ng af DNA fra hver klon ved hjælp af NotI (10 U) og BamHI (10 U) i den relevante fordøjelses buffer fortyndet til 1x for 1 t ved 37 °C og Kør det fordøjet DNA på en 1% agopstået gel i 1x TAE buffer. Forventede bånd størrelser for pCS2. Lifeact-eGFP positive kloner er 3,9 KB og 978 BP.
    6. Transformér 1 PG-100 ng af DNA fra den positive klon til kompetente E. coli DH10, og Forbered 3-4 miniprep-reaktioner som beskrevet i tidligere trin for at opnå en tilstrækkelig mængde DNA til in vitro-transkriptionsreaktion (mindst 10 μg).

2. klargøring af mRNA ved in vitro transskription

  1. Linearize 10 μg af pCS2. LifeAct-eGFP på 3 ' enden af skæret med NotI (10 U) i en passende fordøjelses buffer fortyndet til 1x i en samlet reaktions volumen på 50 μL ved 37 °C natten over.
    Bemærk: For at forhindre RNase-kontaminering og reducere mRNA-nedbrydning skal du bære handsker under håndtering af mRNA-prøver.
  2. Rense DNA ved hjælp af en blanding af phenol: chloroform: stoffer alkohol (25:24:1, v/v).
    1. Tilsæt 150 μL RNase frit vand for at gøre det totale volumen af fordøjelses reaktionen lig med 200 μL. Tilsæt derefter 200 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol og vortex blandingen for 20 s.
    2. Centrifugeres i en mikrofuge ved max-hastighed (18.400 x g) i 2 min. Fjern forsigtigt den øverste, vandige fase, der indeholder det lineariserede DNA. Gentag dette trin for at fjerne yderligere urenheder og vær omhyggelig med ikke at forstyrre det hvide bundfald, der kan dannes mellem de nederste og øverste flydende faser.
  3. Bundfældet DNA ved tilsætning af 1/10 volumen 3M natriumacetat (RNase-fri) og 2,5 volumener af 100% ethanol. Lad blandingen ligge ved-20 °C i > 30 min., derefter pellet DNA ved centrifugering ved max hastighed (18.400 x g).
    1. Vask DNA-pellet med 70% ethanol, derefter lufttørre pellet for > 5 min.
    2. DNA-pellet opløses i 5 μL RNase-frit vand. Kvantificere DNA ved Spektrofotometer.
      Bemærk: Den forventede DNA-koncentration er ~ 0,5-1 μg/μL med et A260/A280 forhold mellem 1,7-2,0.
  4. Brug 1 μg lineariseret pCS2. LifeAct-eGFP DNA til in vitro transkription (IVT). Følg producentens anvisninger i det kommercielle sæt (se tabel over materialer) for at inkludere 10 μL analog (slutkoncentration 0,8 mM) og NTPs (slutkoncentration 1 mM for ATP, CTP og TTP; 0,2 mM for GTP), 2 μL 10x reaktionsbuffer (slutkoncentration 1x), 2 μL SP6 RNA-polymerase og RNase-frit vand op til 20 μL.
    1. IVT-blandingen inkubates i ca. 2 timer eller længere, afhængigt af transkriptionen.
      Bemærk: 2 h inkubation fungerer godt for en 3 KB afskrift, men natten inkubation fungerer bedre for udskrifter, der er større end 5 KB.
    2. For at fjerne frie nukleotider fra transkriptionsreaktionen tilsættes 30 μL LiCl RNA-udfældnings opløsning (7,5 M lithiumchlorid, 50 mM EDTA) for at udløse mRNA. Blandingen vortex kortvarigt og opbevares ved-20 °C i 30 min. Drej mRNA ned i 15 minutter i en mikrofuge ved Max Speed (18.400 x g) og skyl med 70% ethanol (RNase-fri).
  5. Den syntetiserede mRNA opløses i 15 μL RNase-frit vand. Den syntetiserede mRNA dispenseres ved 5 μL/rør (3 rør i alt) og placeres ved-80 °C ved langtidsopbevaring. At kvantificere mRNA med et spektrofotometer.
    Bemærk: Forventede afkast er 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) er tilstrækkelig til et eksperiment med ~ 10 embryoner, idet det forudsættes, at mRNA fortyndes fra 1 μg/μL til 500 ng/μL, og at hvert embryo injiceres med ~ 200 nL. Hvert rør bør derfor indeholde nok mRNA til ~ 5 eksperimenter.
  6. Kør ~ 300 ng af mRNA på en 1% agopstået gel i 1x Tae-buffer efter rengøring af alt gel-udstyr med RNase-dekontaminerings opløsningen (f. eks. RNase Away), og sørg for, at mRNA vises som ét bånd (der kan være flere bånd til stede, hvis sekundære strukturer dannes), og at ingen smøre a i gelbanen, som indikerer nedbrydning af RNA.

3. klargøring af mRNA-Elektroporationmix

  1. Tø og fortyndet mRNA ved den ønskede koncentration (250-500 ng/μL i RNase-frit vand fungerer godt for alle mRNAs-testet i dette arbejde). Tilsæt 1/10 volumen af farvet farvestof (se tabel over materialer, RNAse-fri, 0,1% endelig koncentration) for at hjælpe med at visualisere mRNA injektionsstedet og korrekt placere elektroderne.
    Bemærk:
    hvis DNA og RNA kombineres for at udføre en co-electroporation, skal du sikre dig, at DNA er fri for kontaminerende RNases ved at bruge phenol-chloroform ekstraktion og ethanol nedbør før mRNA og DNA-blanding.
    1. Vær sikker på at forberede en negativ kontrol ved hjælp af en mock (ingen RNA tilsat) elektroporation løsning. Hvis det er muligt, skal du forberede en positiv kontrol ved hjælp af prævalideret mRNA (mRNA, der har vist sig at producere FP med succes i tidligere eksperimenter).
      Bemærk: Den negative kontrol er afgørende for alle billedbehandlings eksperimenter for at etablere baggrunds fluorescens niveauer for normalisering af data. Den positive kontrol er især vigtig, når du arbejder med nyligt transskriberet mRNA ved at hjælpe med at bekræfte, at elektro portering indstillinger fungerede.
  2. Opbevar mRNA-elektroporations opløsningen på en isopslæmning for at forhindre nedbrydning, indtil den er klar til at fortsætte med elektroporation.

4. elektroporat mRNAs i levende vagtler embryoner

  1. Saml frisklagte befrugtede vagtler dagligt og opbevar ved 13 °C i et luft befugtet køleskab i højst 1 uge. Inkuber vagtler æggene ved 38 °c indtil de ønskede embryonale udviklingsmæssige stadier19,20,21.
    Bemærk: HH3 til HH5 blev anvendt i dette studie til både statisk og dynamisk billeddannelse. For HH3 embryoner, forlader æggene ved stuetemperatur for 2 h før høst gør isoleringen processen meget lettere, da embryonerne er generelt mere modstandsdygtige over for fysiske manipulationer, når afkølet.
  2. Isolér og Forbered embryoner i henhold til EF'S kultur system22. Indsamle mindst 5 embryoner per tilstand, herunder mindst én til at tjene som en negativ kontrol (ikke elektro porated).
    1. Forsigtigt bryde og hæld ægget i en 10 cm Petri skål. Fjern størstedelen af det tykke albumin med en overførings pipette, og fjern det resterende tykke albumin omkring embryonet ved forsigtigt at tørre ægge blommens overflade af med en vævs serviet for at sikre, at embryonet klæber stramt til papir ringen.
    2. Læg forsnit filterpapir (Se tabel over materialer) på embryonet og bruge saks til jævnt skåret omkring omkredsen af embryonet.
    3. Brug en Pasteur-pipette til at underlægge embryonet med PBS ved hjælp af blide vandløb for at frafilægge enhver blomme, der klæber til embryonet.
      Bemærk: Dette trin er kritisk, når du arbejder med yngre (< HH3) embryoner, fordi disse embryoner har tendens til at holde sig mere til æggeblomme og vil ofte løsne sig fra vitelline membranen under efterfølgende vaske trin.
    4. Træk langsomt embryonet/papir ringen i en skrå vinkel op og ud af æggeblommen i en Petri skål fyldt med PBS for yderligere rengøring. Når det meste af æggeblomme er blevet fjernet, skal du placere embryo ventrale side op på en 35 mm Petri skål dækket med en halv solid blanding af agar/albumen.
  3. Forbered seks til 8 10 cm-lange glas mikrokapillærer (OD = 1,2 mm) ved hjælp af et glas mikropipette aftrækker instrument.
  4. Placer embryonen ventrale side opad i det elektro porationkammer, som er fyldt med PBS. Ved hjælp af et glas mikrokapillær indsprøjtes en bolt på 200 nL af mRNA eller DNA/mRNA-elektroporations blandingen i hulrummet mellem epiblast-og vitellinmembranen, der dækker den ønskede region.
    Bemærk: Hele det forreste område for pellucida og nogle områder for opaca blev elektro porteret i de fleste af de eksperimenter, der er vist i dette manuskript.
  5. Placer de positive og negative elektroderne (platin flad firkantet elektrode; sidelængde på 5 mm) på henholdsvis toppen og bunden af embryonet og elektroporat ved hjælp af følgende pulssekvens: fem kvadrat elektriske impulser på 5 V, 50 MS varighed med 100 MS intervaller ved hjælp af en in vivo-elektroporator. Sørg for, at afstanden mellem elektroderne er ~ 5 mm.
    Bemærk: Optimering af elektro poration parametre er afgørende for at undgå forhold, der kan dræbe de skrøbelige embryonale celler. Parametre for spænding, puls længde, puls intervaller, og antallet af impulser til DNA og mRNA bør overvejes for forskellige elektro poration enheder.
  6. De elektro porterede embryoner inkubateres ved 38 °C i den ønskede udviklingsfase.
    Bemærk: Et fluorescerende dissekere stereoskop (Se tabel over materialer) hjælper med at screene transficeret vs. ikke-transficeret embryoner.
  7. Hvis embryonerne skal imældes statisk, skal de fikseres i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
    1. Fjern embryonerne fra vitellinmembranen ved at skære jævnt rundt om filter papirets omkreds med en saks og skrælle den skinnende membran på rygoverfladen med skarpe pincet forsigtigt.
    2. De faste embryoner vaskes i PBS/Triton (0,1%) 2x i 5 min og Fortsæt med in situ-hybridisering eller immun farvning, hvis det ønskes.
    3. Endelig plette embryonet i 0,5 μg/μL DAPI i PBS/Triton (0,1%) mindst 30 minutter ved stuetemperatur. Vask embryoner i PBS/Triton 2x i 5 minutter og Ryd embryonet i SCALE-U2-opløsning23 natten over.
  8. For at analysere effektiviteten af elektro portering (Se figur 2), skal du bruge værktøjet Binary og partikel analyse og dapi Channel på ImageJ til at opnå nukleare konturer fra alle celler i billedet.
    1. Hvis du vil bruge det binære værktøj på ImageJ, skal du bruge et enkelt z-udsnit i DAPI-kanalen, der indeholder størstedelen af cellerne, og klikke på Behandl ≫ binære ≫ lave binære. Hvis du vil adskille celler i nærheden, skal du klikke på Behandl ≫ binære ≫ vandskuret. Få celle konturer ved at klikke på analysér ≫ analysere partikler, størrelse indstillet til 100-500 (μm2).
    2. Sørg for, at et flertal af cellerne er skitseret i DAPI-kanalen, og Gem celle konturerne ved at klikke på mere ≫ Gem på pop op-vinduet ROI Manager.
    3. Brug disse konturer til at opnå fluorescens intensitetsværdier for mRNA-og DNA-kanalen ved at åbne den tidligere gemte fil på et enkelt z-udsnit i mRNA-eller DNA-kanalen og derefter klikke på mål på ROI Manager.
    4. Endelig filtreres disse intensitetsværdier, tælle celler med < 6000 fluorescens intensitet som ikke-transfected og celler med > 6000 fluorescens intensitet som transficeret.

5. billede FPs kodet af elektro Porated mRNAs

  1. Vælg det sundeste og bedste elektro porerede embryo til de dynamiske billeddiagnostiske eksperimenter efter at have underrettet alle elektro porterede embryoner under det fluorescerende dissekere stereoskop.
    1. Fortsætte med at inkubere de andre elektro porterede embryoner og det ikke-elektro-porerede embryon (den negative kontrol) i en separat inkubator under billeddannelse af det valgte embryon, hvis dette embryon dør under forsøget.
  2. For den dynamiske billeddannelse, bruge hele Mount ex ovo aviær embryo kultur som tidligere beskrevet24,25,26 med en inverteret confokale mikroskop.
    Bemærk:
    mikroskopet er udstyret med en på scenen inkubator (Se tabel over materialer), der bevarer temperaturen ved 36 °c under billeddannelse. Under mikroskop set blev det observeret, at embryoner inkuberet ved 36 °C overlever længere end ved højere temperaturer, muligvis fordi laseren kan forårsage lokal opvarmning på embryonet. Læsere bør bestemme den optimale on-Stage inkubationstemperatur for deres egen mikroskop opsætning.
    1. For dynamisk at billede og visualisere embryogenese, Rengør det elektro porterede embryo kortvarigt med PBS for at fjerne eventuelle bobler, der kan dannes på Rygsiden af embryonet under elektro porteringen ved at flytte embryonet rundt ved hjælp af tang i en PBS Clean Løsning.
    2. Placer det rene embryon direkte på en billedbehandlings skål, der indeholder et tyndt lag albumen-agar (~ 150 μL), og sørg for ikke at frembringe bobler på fostrets overflade22.
    3. For at sikre overlevelse for langtids scanning tilsættes et lille fugtigt oprullet stykke silkepapir på indersiden af billedbehandlings skålen og forsegler skålen ved hjælp af paraffin folie for at minimere fordampning under billeddannelse og inkubation.
    4. Flyt denne skål hurtigt til det forvarmede stadie af et Konfokal mikroskop og Find det farvede farvestof i embryonet ved hjælp af lysfelt Channel (PMT laser 20%), som identificerer det injicerede og elektro porterede område.
  3. Indstil billedbehandlingssoftware til det ønskede mål (10 eller 20x), koldtlysreflektorlamper Mirror (488 nm for gfp nm, 561 for RFP), emissions spektre (499-562 nm for gfp, 570-695 nm for RFP), og tænd for en passende laser (488 nm for gfp, 561 nm for RFP).
    Bemærk:
    elektroporeret mRNA blev oversat til proteiner, der blev set inden for 20 minutter (Se figur 3). De billedbehandlings metadata, der bruges til de fleste af billederne i dette papir, var: et inverteret Konfokal mikroskop med et 20x mål (Se tabel over materialer); pixel opholdstid, ~ 1,5 μs; gennemsnit af 4-line scanninger.
    1. Klik på live på billedbehandlings softwaren, og Juster laser strømmen til en indstilling, der passer til fluorescens intensitet, afhængigt af hver mikroskop lasereffekt. Start med Imaging The embryo ved hjælp af 1% laser effekt, 800 Gain, og øg laser strømmen langsomt med 1% intervaller, indtil mættede pixels ses.
    2. Følg dette ved at reducere laser strømmen lidt, indtil ingen mættede pixels ses længere.
      Bemærk: Den laser effekt valgt til begyndelsen af en Imaging session af et embryo kan være godt for tidligere tidspunkter, men ikke ideel på senere tidspunkter, hvis fluorescens af cellerne bliver meget lysere eller svagere over tid. For at løse dette, billede embryonet ved lidt lavere strømindstillinger oprindeligt, da de elektro porerede celler generelt bliver lysere i løbet af de første 6 timer efter elektroporation (Se figur 3a-E for kvantificering af signal stigning). Hvis de senere billeder er mættede, skal du fortsætte til billedet med de oprindelige billedbehandlings indstillinger, men tage et ekstra billede umiddelbart efter med svagere billedbehandlings indstillinger (mindre pinhole eller svagere laser effekt).
    3. Billede embryonet hver 3-5 min for at spore individuelle celle migration på tværs af forskellige tidspunkter. Til dette arbejde var billederne z-stakke (~ 50 μm tyk) af hele det elektro porterede område, plus nogle ekstra rum mod bunden af z-stakken, hvis embryonet synker ind i den agerede seng i hele billedbehandlings sessionen.
    4. Observere, hvor hurtigt cellerne bevæger sig ved at kontrollere de første par tidspunkter i den første film. Hvis cellerne bevæger sig med en hurtig hastighed (hvilket betyder, at de vil forlade området i den afbildet region inden for et par flere tidspunkter), overveje at udvide zoom af det afbildet område (1x à 0,8 x) eller billeddannelse en anden region.
      Bemærk: Embryonale regioner i området pellucida bevæge sig meget hurtigere end dem i området opaca. Desuden indeholder yngre embryoner (HH3, HH5) ofte celler, der gennemgår hurtigere bevægelser sammenlignet med ældre embryoner (> HH7).
    5. Efter billeddannelse den elektro porerede region af embryonet, billede en un-elektro porteret region af det samme embryo til at bestemme autofluorescens niveauer (bør være minimal, hvis lav laser effekt < 10% bruges til at billedet embryonet).

6. genvinding af fluorescens efter foto blegning (FRAP) til analyse af mRNA-integritet

Bemærk: En in vivo fluorescens restitution efter photobleaching (Frap) assay kan bruges til at bestemme, hvor længe transficeret mRNA kan oversættes til fps. Følgende protokol skitserer et FRAP-eksperiment for at detektere halveringstiden for H2B. Citrine mRNA i et elektro porteret embryon.

  1. Udfør Frap eksperimenter på omvendt confokal mikroskop ved hjælp af en 20x 0,8 na mål og et helt åbent pinhole.
    1. Efter at have bekræftet elektroporation af H2B-citrin på stereomicroskop og indstilling af embryonet på den forvarmede fase på det omvendte konfokale mikroskop (Se trin 5.2.4), foto blege det meste af cellulær fluorescens fra H2B-citrin på en lang række tids point (45 min, 2 h, og 5 h post-electroporation) ved hjælp af 405 nm laser med 70% laser effekt, 100 iterationer, Scan Speed 4, som efterlader kun 5% af fluorescens resterende.
      Bemærk: Denne proces bør tage et par minutter.
    2. Fortsæt med at inkubere embryonerne på scenen ved 36 °C efter foto blegning.
  2. Sørg for at være opmærksom på aktivt at dividere celler inden for den fotoblegede region, hvilket indikerer, at de foto blegede celler ikke er helt døde efter behandling.
  3. Erhverve post-blege billeder (z-stakke af den elektro porterede region) i op til 30 min ved regelmæssige tidsintervaller (3 eller 5 min) ved hjælp af confokale mikroskop.
    Bemærk: Hvis det er muligt, skal du bruge en transgene H2B-XFP-linje som en positiv kontrol for at sikre cellens overlevelse i den fotoblegede region. Hastigheden af fluorescens genvinding for FP kodet af den elektro porterede mRNA bør falde, men at for FP kodet via transgene bør forblive konsistent i hele filmen.
  4. For at sikre, at billedbehandlings betingelserne ikke påvirker embryo overlevelse på en skadelig måde, skal der samtidig inkubere elektro porerede embryoner, som ikke er fotoblegede, og som kan fungere som kontrol for billeddannelse.
  5. For at kvantificere foto blegning resultater for mRNA henfald post-elektro poration, spore celle fluorescens over tid (3 eller 5 min) ved at måle fluorescens intensitet af centrum (en 7,5 μm cirkel) af hver celle ved hjælp af ImageJ. Mål dette for alle celler i den fotoblegede region, der ikke gennemgår mitose og er blevet fuldstændig fotobleget.
    Bemærk: Overvej at udelade mitotiske celler fra kvantificeringen, da mitotiske kerner har stærkere fluorescens end interfase kerner på grund af kromatin kondensation.
  6. Der afbildes fluorescens intensitet over tid efter blegemiddel på en række tidspunkter (45 min, 2 h og 5 timer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA elektroporation er mere effektiv end DNA-elektroporation

Vi brugte pCS2 +. H2B-Citrine til at forberede in vitro transkriberet mRNA. Da DNA-elektroporation sædvanligvis udføres ved 1-2 μg/μL, brugte vi en equimolær koncentration af mRNA (beregnet til at være omkring 0,25-0,5 μg/μL for H2B-citrin) til mRNA-elektroporation. Vi testede først elektroporations effektiviteten af pCS2 +. H2B-Citrine DNA sammenlignet med H2B-Citrine mRNA (in vitro transkriberet fra SP6 promotoren af pCS2 +. H2B-citrin) ved elektroporerende DNA eller mRNA separat i HH5 vagtler embryoner derefter undersøge elektro poration effektivitet ved 12 h post-elektro poration. Selv om DNA-elektroporation fører til lysere fluorescens i nogle elektro porterede celler, var effektiviteten af DNA-elektroporering synligt lavere sammenlignet med det bredt udtrykte mRNA-kodet FPs (figur 2a og B).

For at kunne beskrive den iboende variation i embryo-til-embryo-variationen i elektroporations protokollen blev en ækvimolære kombination af mRNA-kodning H2B-citrin og DNA, som udtrykker H2B-mKate2, elektroporeret i ectoderm af HH5 embryoner og observeret 12 h post-elektro portering. Ved sammenligning af DNA og mRNA-Co-elektroporation i samme embryo var DNA-ekspanderende FP også signifikant og konsekvent mindre effektiv end mRNA (figur 2c). Ved at kvantificere alle embryoner, der er elektroporeret med kun mRNA, DNA eller en kombination af de to, konstaterede vi, at mRNA transfficerer ~ 75% af cellerne i en given region, mens DNA kun transfficerer ~ 25% af cellerne i en given region (figur 2D). Spredningen i ekspression af fluorescerende proteiner kodet af mRNA eller DNA var ikke signifikant forskellig i alle Co-elektroporerede embryoner (figur 2E).

Protein ekspression er hurtigere i mRNA-elektroporation end DNA-elektroporation

Den transficeret mRNA bør føre til hurtigere protein produktion, da det umiddelbart kan genkendes af cytosolisk oversættelsesmaskiner, som det ses i figur 3. DNA skal omplaceres til kernen, transskriberet, og mRNA transporteres tilbage til cytosol, hvor det er anerkendt af cytosolisk oversættelsesmaskiner, forventes at tage mere tid. For direkte at sammenligne mRNA versus DNA-ekspressions rater for protein produktion udførte vi en serie af tids kursus eksperimenter, hvor vi Co-electroporated en ækvimolære kombination af DNA (pcmv. H2B-mKate2) og mRNA (H2B-citrin) ind i ectoderm af HH5 embryoner. Vi opdagede mRNA-kodet FP udtryk omkring 22 min post-electroporation, som fortsætter med at stige i relativ fluorescens intensitet for ~ 6 h (figur 3a-E, supplerende. Movie S1b). I modsætning hertil ses DNA-kodet FP-udtryk først ved ~ 1,5 h post-electroporation (figur 3A'-E ', supplerende. Movie S1c) og fortsætter med at stige i lysstyrke indtil 6 timer, når filmen blev stoppet. Da DNA-elektrode celler blev mættet af 6-h-mærket, generede vi denne tilstand med svagere billeddannelses forhold (figur 3F-F ' '). På tværs af alle tidspunkter af denne tid bortfalder (22 min til 6 h), mRNA transfekter flere gange flere celler end DNA (supplerende. Movie S1a, den totale effektivitet af elektroporation gennem lysfelt og dapi er ikke vist, fordi disse billeder er taget fra en tid-lapse af en vildtype vagtler embryo). Baseret på dette, konkluderer vi, at mRNA elektroporation fører til tidligere udtrykte protein.

Co-elektroporation af flere mRNAs er yderst effektiv

Dernæst søgte vi at teste effektiviteten af mRNA-elektroporation yderligere ved at elektro porere flere mRNAs til en region af interesse. Co-electroporation af flere DNAs havde tidligere vist sig at være relativt ineffektiv, viser med antallet af multi-mærket er 25%, 14%, og 10% for 2, 3, og 4 DNA konstruktioner elektro porated, beregnet som en andel af det samlede antal celler11 . Vi først electroporated to mRNAs at indkode spectrally distinkte fps (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) i HH5 embryoner og opnået høj transfektering effektivitet i alle elektro porterede regioner. Vi brugte denne dobbelt-electroporation til at fange film af radial ekspansion mellem området pellucida og opaca i en HH4 gastrulerende embryo, afbildet 2 h post-electroporation (supplerende film S2a, b, og c). H2B-citrin er lokaliseret i cellekernen og tillader celle spredning at blive sporet27. Turquoise2-Golgi FP ser ud til at vise subcellulære polaritet i embryonale celler, men synes ikke at korrelere med hastighed eller retning af bevægelige ectoderm celler in vivo28. Denne film (supplerende film S2) viser, at celler elektroporeret med flere mRNAs kan fortsætte normal cellulær aktivitet uden synlige defekter.

Desuden Co-elektroporation af 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (at visualisere Golgi apparater), lifeact-egfp (at visualisere F-actin), H2B-Citrine (at visualisere Nucleus), og membran-Cherry FP (til at visualisere membraner)-resulterede i 87% transfektering alle 4 Mrna'er i alle elektroporerede områder (figur 4). LifeAct-EGFP og H2B-Citrine blev adskilt af det lineære udblandings forarbejdnings værktøj i den kommercielle software.

FRAP-analyse viser den hurtige nedbrydning af elektro porteret mRNA i de første to timer efter elektro portering.

Det er velkendt, at nøgne mRNAs hurtigt nedbrydes af cellulære Rnaaser29. Vi postulerede, at mRNA elektroporation kan være nyttigt for tab eller gevinst-af-funktion eksperimenter ved at tillade hurtig og effektiv ekspression af proteiner i et foster i udvikling. Det ville derfor være nyttigt at kvantificere hastigheden af mRNA-henfald efter mRNA-elektroporation, da mRNA nedbrydes hurtigere end DNA i celler. I tidligere rapporter om mRNA elektroporation i voksne mus neurale stamceller, omkring 80% mRNA blev identificeret 2 h post-elektroporation af QRT-PCR, men lidt at ingen mRNA blev detekteret af 24 h post-elektroporation15. Vi søgte yderligere at kvantificere mRNA-ekspression efter elektro portering ved at designe en in vivo FRAP-analyse til påvisning af mRNA-niveauer i elektroporerede celler.

Foto blegning er den irreversible ødelæggelse af fluoroforet, der kan opstå, når fluoroforet (fluorescerende proteiner i vores tilfælde) er i en ophidset tilstand, som eliminerer fluorescens under observation30,31. Enhver udledt lys fra fluorescerende proteiner (fps), der kan påvises i foto blegede celler over baseline niveauer bør derfor repræsentere nyligt oversat fps kodet af intakt, transficeret mRNAs. Derfor søgte vi at fotoblege de elektro porterede celler for at eliminere alle eksisterende FP-afledte fluorescens på en række tidspunkter og spore efterfølgende fluorescens genvinding.

Ved hjælp af optimerede foto blegning indstillinger som beskrevet i afsnittet protokol, vi fandt, at foto blegning i første omgang reducerer fluorescens intensitet i alle fotoblegede celler med ~ 95%, når de er analyseret umiddelbart efter foto blegning begivenhed. Dette blev gjort ved 45 min, 2 h, og 5 h post-elektro portering (figur 5a-C). Fluorescens genfinding i hver celle i den foto blegede region blev sporet over en 30 min. periode efter foto blegning på hvert tidspunkt ved at afbilde det samme område med regelmæssige tidsintervaller (3 eller 5 min). Vores data tyder på, at der er et signifikant fald i transficeret mRNA niveauer mellem 45 min og 5 h post-elektro poration. Dette fremgår af det store fald i FRAP målt ved 5 timer sammenlignet med 45 min post-elektro portering. For at fremhæve fluorescens genfinding i de blegede celler, især i 5-h-tidspunktet, forbedrede vi lysstyrken i figur 5a-C ved hjælp af værktøjet lysstyrke/kontrast i ImageJ og viser disse modificerede billeder i figur 5D-F. Interessant, der er en stor heterogenitet i fluorescens opsving fra celle-til-celle inden for det foto blegede område på 2 h, fordi nogle celler genvinde fluorescens hurtigere end andre celler (figur 5e ' ', se pilespidser). Men alle celler i det 5 h fotoblegede område genopretter fluorescens langsommere (figur 5F ' ') end de foto blegede celler ved 2 timer. Vi opdager også aktivt dividere celler inden for vores fotoblegede region, hvilket tyder på, at cellerne ikke er døde som følge af foto blegning proces (figur 5E ' ').

Vi kvantificerer disse resultater i figur 6a ved at vise den normaliserede signalintensitet for hver celle i de foto blegede områder over en 30 min. periode efter foto blegning begivenheden. For hver celle blev fluorescens værdierne normaliseret mod den pågældende celles signalintensitet umiddelbart efter foto blegning. Denne normalisering blev udført for alle celler på tværs af alle tidspunkter afbildet (45 min, 2 h, 5 h). De normaliserede værdier for fluorescens genvinding af cellerne inden for samme foto blegede region blev derefter samlet og graferet over tid efter foto blegning begivenhed; hvert punkt i grafen repræsenterer derfor ~ 35-celler. De ikke-normaliserede data vises også i figur 6b, hvor hver linje repræsenterer en celle med genoprettelse af fluorescens signalintensitet umiddelbart efter foto blegning. Disse data generelt tyder på, at 5 h, alle celler har udtømt de fleste af deres mRNA, med en stor del af dette fald forekommer mellem 45 min og 2 h post-elektro poration.

Figure 1
Figur 1: skematisk kloning procedure til at gøre pCS2 + LifeAct-eGFP konstruktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mRNA-elektroporation er mere effektiv end DNA-elektroporation. (a-a ' ') DNA udtrykker pCS2. H2B-Citrine blev elektroporeret i ectoderm af HH5 embryoner. Fluorescens blev observeret 12 h post-elektro poration. Scale bar = 50 μm. (b-b ' ') mRNA udtrykker H2B-Citrine blev elektroporeret i ectoderm af HH5 embryoner. Fluorescens blev observeret 12 timer efter elektro portering. Scale bar = 50 μm. (c-C ' ') equimolar kombination af DNA (pcmv. H2B-mKate2) og mRNA (H2B-citrin) blev elektroporeret i HH5 embryoner og observeret 12 h post-elektro poration. Tre embryoner blev testet pr. tilstand (n = 2 eksperimenter). Scale bar = 50 μm.D) tre embryoner fra A, B og C (9 samlede embryoner) blev kvantificeret for elektroporations effektivitet ved hjælp af partikel Analyseværktøjet på ImageJ. En 200 μm-region fra hvert embryo blev kvantificeret (mindst 150 celler blev talt pr. region). Midterste streg repræsenterer betyder, mens top-og bund søjler repræsenterer standardafvigelse fra middelværdien. (E) tre Co-elektroporerede (DNA og mRNA) embryoner analyseres for spredning af signalet på tværs af alle elektroporerede celler i en given 200 μm region. Hvert embryo havde ca. 100 celler positivt for mRNA-elektroporation og 30 celler, som var positive for DNA-elektroporation. Midterste streg repræsenterer betyder, mens top-og bund søjler repræsenterer standardafvigelse fra middelværdien. Der er ingen signifikant forskel mellem spredningen af mRNA vs. DNA-elektroporation, men mRNA elektro poration er langt mere effektiv end DNA. (A-C) Dimensioner = 425,10 x 425,10 x 55 μm. pixel Dwell 2,55 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop-metadata = inverteret Konfokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) (A) Ex: 488 nm (0,05%), emissions spor S1 = 508-579 nm; B) ex = 488 nm (5,0%), emissions spor S1 = 508-579 nm; C) ex = 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), emissions spor S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 nm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: mRNA-elektroporation viser udtryk med 22 min efter-elektro portering og er meget hurtigere end DNA-elektroporation. Repræsentative billeder af Time Course efter mRNA (H2B-Citrine) og DNA (pCMV. H2B-mKate2) elektroporation med plot profilanalyse på 22 min (a-a ' '), 45 min (b-B ' '), 1,5 h (C-c ' '), 3 h (D-d ' '), og 6 h (E-e ' ') på starten af billeddannelse (n = 1). Afbildnings profilanalyse angives for hvert tidspunkt, der vises på tværs af den tegnede pil i det flettede billede. Hver spids i plot profilen repræsenterer kernen i en elektroporeret celle. Cellerne bliver generelt lysere i løbet af 6-h-intervallet af filmen, hvilket indikerer, at mRNA stadig bliver oversat til nyt fluorescerende protein. For 6-timers tidspunktet vises billeder af samme region, der er taget med identiske billedbehandlings betingelser (e-e ' ') og svagere billedbehandlings betingelser (f-f ' '), fordi billederne af de DNA-elektroporerede celler var meget mættede ved hjælp af den oprindelige billeddannelses forhold. Skala bjælke = 20 μm. mål: 425,10 x 425,10 x 55 μm. billedet vises som en maksimal intensitet projektion på tværs af alle tidspunkter afbildet. Pixel Dwell 2,55 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop metadata = omvendt confokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) til Initial; Ex = 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) for sidste tidspunkt (figur 2F), emissions spor S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Co-electroporation af fire mRNAs rettet mod forskellige sub-cellulære strukturer er meget effektiv. Ectoderm fra et HH3 embryo blev elektroporeret med mRNAs, der indkoder mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine og membran-kirsebær. Embryonet blev fastgjort og afbildet 4 timer efter elektro portering. De fleste celler er elektro porteret inden for elektrode målområdet med alle fire mRNAs (87%). Repræsentative tal vist (3 embryoner hver, n = 2 eksperimenter). Scale bar = 50 μm.a) fusionere alle fire Mrna'er (MTurquoise2-Golgi, Lifeact-EGFP, H2B-Citrine og membran-kirsebær). B) kun H2B-citrin-kanalen (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 nm). C) kun MTurquoise2-Golgi-kanalen (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 nm). (D) Merge H2B-Citrine og MTurquoise2-Golgi viser, at Golgi konvolutter den ene side af kernen i de fleste celler. E) kun lifeact-egfp-kanal (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). F) kun membran-kirsebær kanal (Ex = 594 nm (37,1%), EM = S2:570-695 nm). (G) flette lifeact-egfp og membran-kirsebær viser overlap i de fleste celler. Dimensioner = 425,10 x 425,10. Pixel Dwell 1,58 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop metadata = omvendt confokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), emissions spor S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Photobleaching-analyse viser en hurtig nedbrydning af elektro porteret mRNA i de første fem timer efter elektrolysering. Foto blegning af et 100 μm ² område indeholdende celler, der er elektroporeret med mRNA, og som udtrykker H2B-citrin, udføres ved 45 min, 2 h og 5 timer efter elektro portering. Embryonet blev afbildet med regelmæssige tidsintervaller efter foto blegning (3 eller 5 min). Foto blegning betingelser er som følger: 70% 405 nm laser, 100 iterationer, om 5 min varighed for hele regionen. Scale bar 50 = μm. (a-a ' ') 45 min før og efter blegemiddel. B viser embryo umiddelbart efter foto blegning og C viser embryo 30 min efter blegemiddel. Scale bar = 50 μm. (b-B ' ') 2 h præ-og post-blegemiddel. Omkredsen af kvadratet flyttes, fordi cellerne i den fotoblegede region bevægede sig en anelse under blege tiden. (C-c ' ') 5 timer før og efter blegemiddel. (d-d ' ') Samme billeder som A-A ' ' med forbedret lysstyrke (maksimumværdi justeret til 11550 for at forbedre lysstyrken efter indsamling). (e-e ' ') Samme billeder som B-B ' ' med forbedret lysstyrke (maksimumværdi justeret til 11550 for at forbedre lysstyrken efter indsamlingen). De hvide pilespidser peger på celler, der har højere fluorescens genfinding end omgivende celler. Cyan pilespids peger på en fotobleget celle, der for nylig har gennemgået mitose. (f-f ' ') Samme billeder som C-C ' ' med forbedret lysstyrke (maksimumværdi justeret til 11550 for at forbedre lysstyrken efter indsamling). Dimensioner = 425,10 x 425,10 x 42 μm. billedet vises som en maksimal intensitet projektion på tværs af alle tidspunkter afbildet. Pixel Dwell 1,58 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop metadata = omvendt confokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) ex = 488nm (1,5%), emissions spor S1 = 508-553 nm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: kvantificering af fluorescens genfinding i foto blegede celler. A) Fluorescens intensiteten for alle celler i de blegede områder (~ 35 celler) blev sporet for hver enkelt celle i hver tidsperiode efter blegemiddel. Der er et stort fald i hastigheden af genvundet signalintensitet fra 45 min til 2 h, efterfulgt af et mindre fald fra 2 h til 5 h. Den øverste fejl linje vises for hvert punkt, som repræsenterer standardafvigelsen fra middelværdien. Den viste linje er en lineær regressionslinje. R ² for 45 min, 2 h og 5 h er henholdsvis 0,83, 0,58 og 0,84. Den øverste halvdel af fejl bjælken vises for hvert punkt. B) Fluorescens intensiteten for alle celler i de blegede områder (~ 35 celler) blev sporet for hver enkelt celle i hver tidsperiode efter blegemiddel og graferet uden normalisering. Der er et stort fald i hastigheden af genvundet signalintensitet fra 45 min til 2 h, efterfulgt af et mindre fald fra 2 h til 5 h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende film 1: mRNA elektroporation fører til tidligere protein udtryk end DNA-elektroporation. H2B-Citrine mRNA og H2B-mKate2 DNA elektroporeret i ectoderm af HH5 embryo. Region afbildet er ved grænsen af ekstraembryonale og embryonale væv. Skala bar = 50 μm.a) både H2B-citrin og H2B-mKate2 viste kanal (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2:605-661 nm). (b) kun MRNA H2B-Citrine kanal vist (Ex = 488 nm (15%), Em = 499-562 nm). c) kun H2B-mKate2 DNA-kanal vist (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 nm). Dimensioner = 850,19 x 850,19 x 110 μm. billedet vises som en maksimal intensitet projektion på tværs af alle tidspunkter afbildet. Pixel Dwell 2,55 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop-metadata: inverteret Konfokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), emissions spor S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 2: Co-electroporation af mRNAs tillader distinkte celle adfærd at blive dynamisk undersøgt. Radial ekspansion af celler mellem embryonale og ekstraembryonale grænse er elektroporeret med mRNA (H2B-Citrine og mTurquoise2-Golgi) og afbildet under passiv migration. Denne film blev afbildet af confokal mikroskopi fra 2 til 5 h post-elektro poration ved billeddannelse hver 6 min. Scale bar = 50 μm.  a) både H2B-citrin-og MTurquoise2-Golgi-kanaler vist (Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em = 446-526 nm; S2:508-553 nm). (b) kun H2B-Citrine kanal vist (Ex = 488 nm (5,0%), EM = S2:508-553 nm). c) kun den viste MTurquoise2-Golgi-kanal (Ex = 458 nm (28%), Em = 446-526 nm). Dimensioner = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. billedet vises som en maksimal intensitet projektion på tværs af alle tidspunkter afbildet. Pixel Dwell 0,79 μs. gennemsnitlig linje 4. Bits pr. pixel = 16. Mikroskop-metadata = inverteret Konfokal mikroskop, 20x mål (Se tabel over materialer) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), emissions spor S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 nm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, vi gav trin for trin instruktioner om, hvordan man præcist mikroinjicere og elektroporat mRNA i cellerne i gastrulerende vagtler embryoner. Vi påviste, at in vitro syntetiseret mRNA elektroporation giver hurtig og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulerende vagtler embryoner (figur 2 og 3). Fluorescens fra H2B-Citrine protein oversat fra elektro porteret mRNAs kunne påvises ved Konfokal mikroskopi inden for ~ 20 min og steg i FP fluorescens i timer (figur 3, supplerende film 1). Dette er overraskende hurtigt og tæt på den formodede modningstid for Citrine32,33. FPs udtrykt fra DNA-vektorer blev detekteret efter 2-3 h (figur 3, supplerende. Film 1), som svarer til tidligere rapporter8,34,35. Forskellige FPs har unikke modningstid, så avanceret planlægning vil sikre, at den ideelle FP er valgt i form af spektral skelnen og modning kinetik ønskede for eksperimentet. Derudover syntetiseres mRNAs mere effektivt Co-transfect embryonale celler end DNA vektorer11. Den højere transfvektions effektivitet resulterer i, at flere celler transfteres i regionen af interesse med enkelt (figur 2) eller flere populationer af mRNAs (figur 4).

Stabiliteten af mRNA er stærkt reguleret og kan påvirkes af polyadenylering, splicing, oversættelse, sekundær struktur og ikke-oversatte regioner for at nævne et par36,37. Halveringstider for både endogene og syntetiserede mRNA inden for celler kan variere fra minutter til dage36,38. Vi brugte in vivo fluorescens opsving efter foto blegning (FRAP) at blege eksisterende mRNA-kodet H2B-Citrine proteiner og observeret den mest mærkbare H2B-citrin fluorescens opsving i løbet af de første 2 timer efter elektro portering (figur 5 og 6). forskellige mRNAs vil utvivlsomt have forskellige halverings steder baseret på deres længde, interne sekvenser, 5 ' og 3 ' modifikationer36,37, så hver skal være analyseret hvis det ønskes.

Vital Imaging kræver typisk en trade-off mellem optimale betingelser for høj kvalitet billeddannelse og hurtig, mindre giftige billeddannelse39,40. Ved billeddannelse er det tilrådeligt at bruge så lav laser effekt som muligt for at minimere fotoblegning og foto skade på embryonale celler (Se bemærkningerne til trin 5,3 i protokollen)40. Ændring af mikroskopet indstilling for hurtige samlinger (f. eks hurtigere scanningshastigheder, mindre gennemsnit) ofte kan hjælpe uden at miste den nødvendige billedopløsning41. Endelig skal der udvises forsigtighed ved håndtering og manipulation af embryonerne under høst, elektro portering og billeddannelse (Se trin 4). De tidlige stadier af embryonerne er sarte og kan let beskadiges.

Samlet set giver den præcise timing og præcise lokalisering af mRNA-elektroporation mulighed for fordrivelse eksperimenter, der udnytter den hurtige ekspression, co-transfection effektivitet, og hurtig forfald af mRNA transskriptioner. Over-udtryk eller misexpression af et gen af interesse kan opnås gennem elektroporation af syntetiseret mRNAs. Tittering koncentrationen for hver mRNA er afgørende, da elektroporerende for meget mRNA kan forårsage ikke-specifik cellulær toksicitet, mens for lidt mRNA kan ikke mærke ønskede celler eller inducere fænotypiske ændringer tilstrækkeligt. En overflod af vektorer genereret for in vitro-syntese af mRNAs at indkode FP fusioner markører for visualisering eller ændrede genprodukter til perturbationer af forskellige biologiske processer allerede findes fra forskellige animalske modelsystemer. Mange af disse konstruktioner designet til in vitro mRNA syntese kan hurtigt og billigt opnået fra non-profit plasmid depoter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi takker David Huss for nyttige indblik i dette arbejde. Dette arbejde blev delvist støttet af Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) og USC Provosts undergrad Research Fellowship til M.T., Saban Research Institute Intramural Training pre-doktor Award til M.D., og University of Southern California bachelor forskning Associates program Award til R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174, (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3, (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007, (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3, (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296, (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41, (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42, (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39, (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32, (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13, (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144, (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8, (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12, (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216, (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149, (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5, (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8, (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88, (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97, (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414, (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121, (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233, (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39, (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102, (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12, (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55, (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics