Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi rapporterer Messenger RNA (mRNA)-electroporation som en metode som tillater rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i modell systemet vaktel embryo. Denne metoden kan brukes å fluorescensmerkete avmerke celler og fortegnelse deres inne vivo bevegelser av tid-lapse mikroskopi kort etter electroporation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi rapporterer at mRNA electroporation tillater fluorescerende proteiner å merke celler i levende vaktel embryo raskere og grovt enn DNA-electroporation. Den høye transfeksjoner effektivitet tillater minst 4 distinkte mRNAs å være co-transfekterte med ~ 87% effektivitet. De fleste av electroporated mRNAs er degradert i løpet av de første 2 h post-electroporation, tillater tidsfølsomme eksperimenter som skal utføres i utviklingsland embryo. Til slutt beskriver vi hvordan du dynamisk bilde Live embryo electroporated med mRNAs som koder ulike subcellulære målrettede fluorescerende proteiner.

Introduction

Electroporation er en fysisk transfeksjoner metode som bruker en elektrisk puls for å skape forbigående porer i plasma membranen, slik at stoffer som nukleinsyre syrer eller kjemikalier går over i stoffer. Electroporation er mye brukt til å levere DNA til bakterier, gjær, planter og pattedyrceller1,2,3. Det er rutinemessig brukt til å innføre genetisk nyttelast i målceller og vev innenfor utviklingsland fugle embryo å studere genetisk kontroll av utvikling eller etikett migrere bestander av celler4,5,6, 7i. Imidlertid finnes det også flere eksperimentelle begrensninger med DNA-electroporation8. For eksempel, DNA electroporation ofte introduserer svært variable antall uttrykk vektorer per celle og deretter mRNAs og proteiner de kodes. Denne variasjonen kan føre til betydelig celle celle heterogenitet som kompliserer både bildeanalyse og data tolkning9,10. I tillegg proteiner fra DNA electroporation bare begynne å uttrykke ~ 3 h post-electroporation og ikke nå maksimal effektivitet i celle tall og fluorescens intensitet til 12 h, sannsynligvis på grunn av den tiden som kreves for å overføre til kjernen og fullføre både transkripsjon og oversettelse in vivo11.

I kontrast har mRNA transfeksjoner blitt effektivt brukt i en rekke modellsystemer, inkludert Xenopus laevis oocytter av microinjection12,13, omprogrammering humane stamceller ved mRNA lipofectamine transfeksjoner14 , og electroporating gjenstridige nevrale stamceller i voksne mus15. Vi testet evnen til mRNA electroporation å effektivt merke celler under tidlig avian embryoutvikling med in vitro syntetisert mRNAs som koder distinkte fluorescerende proteiner (FPs). For våre studier, vi brukte pCS2 + vektor, en Multipurpose uttrykk vektor som vanligvis brukes for å uttrykke proteiner i Xenopus og sebrafisk embryo. Den SP6 og T7 RNA polymerase arrangører i pCS2 + tillater syntese av mRNA og protein fra alle klonet genet når det brukes i en in vitro transkripsjon/Translation system.

Her viser vi at mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo. Vi har designet og generert mange av uttrykket vektorer som brukes i disse studiene. For eksempel subcloned vi LifeAct-eGFP genet16 i pCS2 + Vector17 å uttrykke fra CMV promoter og SP6 promoter. Den innsatte genet ligger nedstrøms av SP6 promoter og oppstrøms av SV40 Poly (A) hale18. I embryo co-electroporated med mRNA og DNA, ble FPs kodet fra in vitro kopieres mRNAs først oppdaget innen 20 min av electroporation, mens FPs fra DNA uttrykk vektorer ble oppdaget først etter 3 h. flere mRNAs-koding for kjernekraft, Golgi og membran proteiner kan electroporated inn i et embryo samtidig, noe som resulterer i rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i individuelle celler. Til slutt, ved hjelp av en in vivo fluorescens Recovery etter photobleaching (FRAP) analysen, viser vi at et flertall av electroporated mRNAs forfall innen 2 t. Dermed vil den raske, første protein produksjonen kombinert med begrenset ny protein oversettelse gjøre mRNA electroporation til en verdifull teknikk når det er nødvendig med timelig kontroll av uttrykket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med godkjente retningslinjer fra Children ' s Hospital Los Angeles og University of Southern California institusjonelle Animal Care og bruk komiteer.

1. generasjon pCS2-basert uttrykk vektorer

  1. Å klone pCS2. Lifeact-eGFP, forberede vektoren ryggraden ved å fordøye 2 μg av pCS2. CycB1-GFP (en konstruksjon som inneholder en annen innsats) med BamHI (10 U) og BsrGI (10 U) i riktig fordøyelsen buffer (se tabell over materialer) fortynnet til 1x i en total reaksjon volum på 50 μL for 1 time ved 37 ° c (se figur 1 for skjematisk kloning prosedyre).
    1. Dephosphorylate den frie 3 ' OH endene av vektoren ryggraden fra begrensningen enzymet reaksjon ved å legge reker alkalisk fosfatase (1 U). Ruge for 30 min ved 37 ° c.
    2. Kjør hele blandingen i en 1% agarose gel/1x Tris acetate EDTA (TAE) buffer på 90 V for ~ 50 min og deretter beis gelen i en 0,5 μg/mL oppløsning av etidiumbromid bromide i 1x TAE buffer i 15 min med milde rocking. Sørg også for å laste molekylvekt markører i et gratis kjørefelt for å bestemme DNA-størrelser.
    3. Ved hjelp av en DNA-sikker UV Transilluminator å unngå skår DNAs, kutte ut vektoren ryggraden (forventet bandet størrelse på 4kb) fra agarose gel raskt og isolere DNA-fragment fra gel brikke ved hjelp av en gel rensing kit ved hjelp av produsentens instruksjoner.
  2. Samtidig med trinn 1,1, klargjør du innsatsen ved å fordøye 2 μg av pEGFP-N1-Lifeact med BglII (10 U) og BsrGI (10 U) i riktig fordøyelses buffer fortynnet til 1x i et totalt reaksjons volum på 50 μL for 1 time ved 37 ° c. Kjør hele blandingen i en 1% agarose gel å isolere 800 BP bandet som tidligere forklart i trinn 1.1.2-1.1.3.
  3. Etter at både vektoren og sette inn er renset og kvantifisert på spektrofotometer, kombinerer 50 ng av vektoren og 38 ng av innsatsen (1:3 molar forholdet vektor å sette inn) i T4 DNA ligase buffer før du legger T4 DNA ligase å katalysere den ligation reaksjonen. I tillegg sette opp en ingen DNA-kontroll, en vektor bare kontroll, og en innsats bare kontroll. Ruge alle reaksjoner ved romtemperatur i 30 min.
    1. Transformer 1 μL av ligation blanding (er) i kompetent E. coli DH10. Også transformere vann bare negativ kontroll og 20 PG av pUC19 positiv kontroll. Spre bakterier på Luria buljong (LB) agar plater inneholdende 50 μg/mL Ampicillin og ruge over natten ved 37 ° c.
    2. På neste morgen, telle koloniene på hver plate.
      Merk: Ideelt sett bør det ikke være noen kolonier på negative kontroll plater, > 100 kolonier på vektoren + sette inn ligation plater, og færre kolonier på vektoren bare plate.
    3. Plukk minst 8 bakterie kolonier fra agar plate forvandlet med vektoren + INSERT ligation blanding og vaksinere dem ved hjelp av sterile tannpirkere eller Pipet tips i 2 mL flytende LB buljong inneholdende 50 μg/mL Ampicillin.
    4. Pakk DNA fra hver av de kloner ved hjelp av kommersielle plasmider miniprep kits.
    5. Kjør en diagnostisk begrensning fordøye ved hjelp 500 ng av DNA fra hver klone med NotI (10 U) og BamHI (10 U) i riktig fordøyelse buffer fortynnet til 1x for 1 time ved 37 ° c og kjøre fordøyd DNA på en 1% agarose gel i 1x TAE buffer. Forventet band størrelser for pCS2. Lifeact-eGFP positive kloner er 3,9 KB og 978 BP.
    6. Transform 1 PG-100 ng av DNA fra den positive klone i kompetente E. coli DH10, og forberede 3-4 miniprep reaksjoner som beskrevet i tidligere trinn for å få en tilstrekkelig mengde DNA for in vitro transkripsjon reaksjon (10 mikrogram minimum).

2. utarbeidelse av mRNA av in vitro transkripsjon

  1. Linearize 10 μg av pCS2. LifeAct-eGFP på 3 ' enden av innsatsen med NotI (10 U) i en hensiktsmessig fordøyelsen buffer fortynnet til 1x i et totalt reaksjons volum på 50 μL ved 37 ° c over natten.
    Merk: For å forhindre RNase-forurensning og redusere mRNA-forringelse, bruk hansker under håndtering av mRNA-prøver.
  2. Rens DNA ved hjelp av en blanding av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1, v/v).
    1. Tilsett 150 μL av RNase-fritt vann for å gjøre det totale volumet av fordøyelsen reaksjonen lik 200 μL. Legg deretter til 200 μL av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol og Vortex blandingen for 20 s.
    2. Sentrifuger i en microfuge ved maks hastighet (18 400 x g) i 2 min. Fjern forsiktig den øverste vandige fasen som inneholder linearized DNA. Gjenta dette trinnet for å fjerne flere urenheter og være forsiktig så du ikke forstyrrer den hvite utfelling som kan danne mellom bunn og topp likvide faser.
  3. Utløse linearized DNA ved å legge til 1/10 volum 3M natrium acetate (RNase-Free) og 2,5 volumer på 100% etanol. La blandingen ved-20 ° c i > 30 min, deretter pellet DNA ved sentrifugering ved maks hastighet (18 400 x g).
    1. Vask DNA pellet med 70% etanol, deretter luft-tørr pellet for > 5 min.
    2. Løs opp DNA-pellet-en i 5 μL av RNase-fritt vann. Kvantifisere DNA ved spektrofotometer.
      Merk: Den forventede DNA-konsentrasjonen er ~ 0,5-1 μg/μL med et A260/A280-forhold mellom 1,7-2,0.
  4. Bruk 1 μg av linearized pCS2. LifeAct-eGFP DNA til in vitro-transkripsjon (IVT). Følg produsentens anvisninger i det kommersielle settet (se tabell over materialer) for å inkludere 10 μL av cap analog (siste konsentrasjon 0,8 mM) og NTPs (siste konsentrasjon 1 mM for ATP, CTP og TTP; 0,2 mM for GTP), 2 μL av 10x reaksjonsbuffer (endelig konsentrasjon 1x), 2 μL av SP6 RNA-polymerase og RNase-fritt vann opptil 20 μL.
    1. Ruge IVT-blandingen i omtrent 2 timer eller mer, avhengig av transkripsjon størrelse.
      Merk: 2 h inkubasjons fungerer bra for en 3 KB transkripsjon, men over natten inkubasjons fungerer bedre for transkripsjoner som er større enn 5 kb.
    2. For å fjerne fri nukleotider fra transkripsjon reaksjonen, tilsett 30 μL av LiCl RNA nedbør løsning (7,5 M litium klorid, 50 mM EDTA) for å fremskynde mRNA. Vortex blandingen kort og oppbevar ved-20 ° c i 30 min. spinn mRNA ned i 15 minutter i en microfuge ved maks hastighet (18 400 x g) og skyll med 70% etanol (RNase-fri).
  5. Løs opp syntetisert mRNA i 15 μL RNase-fritt vann. Dispensere syntetisert mRNA ved 5 μL/rør (3 rør totalt) og plasser ved-80 ° c for langtidslagring. Quantitate mRNA med en spektrofotometer.
    Merk: Forventet avkastning er 15-20 mikrogram mRNA (~ 1 μg/μL). 1. μL (1 μg/μL) er tilstrekkelig for et eksperiment med ~ 10 embryo, forutsatt at mRNA fortynnes fra 1 μg/μL til 500 ng/μL, og at hvert embryo injiseres med ~ 200 nL. Hvert rør bør derfor inneholde nok mRNA for ~ 5 eksperimenter.
  6. Kjør ~ 300 ng av mRNA på en 1% agarose gel i 1x TAE-buffer etter rengjøring av alt gel-utstyr med RNase rense løsning (for eksempel RNase away) og kontroller at mRNA vises som ett bånd (flere bånd kan være til stede hvis sekundære strukturer form) og at ingen smøre en vises i gel Lane, som indikerer RNA degradering.

3. utarbeidelse av mRNA electroporation Mix

  1. Tin og fortynne mRNA ved ønsket konsentrasjon (250-500 ng/μL i RNase-fritt vann fungerer godt for alle mRNAs testet i dette arbeidet). Legg 1/10 volum av farget fargestoff (se tabell over materialer, RNAse-fri, 0,1% endelig konsentrasjon) for å visualisere mRNA injeksjonsstedet og riktig plassere elektrodene.
    Merk:
    hvis DNA og RNA kombineres for å utføre en electroporation, må du sørge for at DNA er fritt for forurensende RNases ved å bruke kloroform ekstraksjon og etanol nedbør før mRNA og DNA-blanding.
    1. Pass på å forberede en negativ kontroll ved hjelp av en uekte (ingen RNA lagt til) electroporation løsning. Hvis mulig, utarbeide en positiv kontroll ved hjelp av pre-validert mRNA (mRNA som har vist seg å produsere FP vellykket i tidligere eksperimenter).
      Merk: Den negative kontrollen er viktig for alle bilde eksperimenter for å etablere bakgrunns fluorescens nivåer for normalisering av data. Det positiv administrere er særlig betydelig når arbeider med ny-transkribere mRNA av hjalp å anerkjenne det det electroporation innfatningene arbeidet.
  2. Oppbevar mRNA electroporation-løsningen på en is slurry for å hindre nedbrytning til den er klar til å fortsette med electroporation.

4. Electroporate mRNAs inn Living vaktel embryo

  1. Samle fersk lagt befruktet vaktel egg daglig og oppbevar på 13 ° c i et fuktet kjøleskap i ikke lenger enn 1 uke. Ruge de vaktel eggene på 38 ° c til ønsket embryonale utviklingstrinn19,20,21.
    Merk: HH3 til HH5 ble brukt i denne studien for både statisk og dynamisk bildebehandling. For HH3 embryo, forlater eggene ved romtemperatur i 2 timer før høsting gjør isolasjons prosessen mye lettere som embryo er generelt mer motstandsdyktig mot fysiske manipulasjoner når avkjølt.
  2. Isoler og Forbered embryo i henhold til EC kultur system22. Samle minst 5 embryo per betingelse, inkludert minst én til å tjene som en negativ kontroll (ikke electroporated).
    1. Forsiktig bryte og hell egget i en 10 cm Petri parabolen. Fjern flertallet av den tykke albumin med en overføring pipette og fjerne de resterende tykke albumin rundt fosteret ved forsiktig tørke overflaten av eggeplomme med et vev tørke for å sikre at fosteret stikker tett til papiret ringen.
    2. Lay precut filter papir (se tabell over materialer) på fosteret og bruke saks for å jevnt skjære rundt omkretsen av fosteret.
    3. Bruk en Pasteur pipette å ligger til grunn fosteret med PBS, ved hjelp av milde bekker å forlate noen eggeplomme stikker til fosteret.
      Merk: Dette trinnet er kritisk når du arbeider med yngre (< HH3) embryo fordi disse embryo tendens til å stikke mer til eggeplomme og vil ofte løsne fra eggeplomme membranen under påfølgende vasketrinn.
    4. Langsomt trekke embryo/papir ringen på en skrå vinkel opp og av eggeplomme i en Petri parabol fylt med PBS for videre rengjøring. Når det meste av eggeplomme er fjernet, plasserer embryo ventrale side opp på en 35 mm Petri parabolen dekket med en semi-solid blanding av agar/albumen.
  3. Forbered seks til 8 10 cm lange glass mikrokapillærer (OD = 1,2 mm) ved hjelp av et glass micropipette avtrekker instrument.
  4. Plasser embryo ventrale side opp i electroporation kammeret fylt med PBS. Ved hjelp av et glass microcapillary, injisere en bolus på 200 nL av mRNA eller DNA/mRNA electroporation blandes inn i hulrommet mellom epiblast og eggeplomme membran som dekker den ønskede regionen.
    Merk: Hele det fremre området for pellucida og et område for opaca ble electroporated i de fleste eksperimentene som ble vist i dette manuskriptet.
  5. Plasser den positive og negative elektroder (platina flat firkantet elektrode; side lengde på 5 mm) på toppen og bunnen av fosteret henholdsvis og electroporate ved hjelp av følgende puls sekvens: fem kvadrat elektriske pulser på 5 V, 50 MS varighet med 100 MS intervaller Bruk av en in vivo-electroporator. Sørg for at avstanden mellom elektrodene er ~ 5 mm.
    Merk: Optimalisere electroporation parametrene er avgjørende for å unngå forhold som kan drepe den skjøre embryonale celler. Parametre for spenning, puls lengde, puls intervaller, og antall pulser for DNA og mRNA bør vurderes for ulike electroporation enheter.
  6. Ruge electroporated embryo ved 38 ° c til ønsket utviklingsfase.
    Merk: En fluorescerende dissekere stereoscope (se tabell over materialer) bidrar til å skjermen transfekterte kontra ikke-transfekterte embryo.
  7. Hvis embryo skal statisk fotografert, fikse dem i 4% paraformaldehyde i PBS for 1 t ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c.
    1. Fjern embryo fra eggeplomme membranen ved å glatt skjære rundt omkretsen av filteret papir med saks og peeling av skinnende membran på rygg overflaten med skarp tang forsiktig.
    2. Vask faste embryo i PBS/Triton (0,1%) 2x i 5 min og fortsett med in situ hybridisering eller immunostaining om ønskelig.
    3. Til slutt, beis fosteret i 0,5 μg/μL DAPI i PBS/Triton (0,1%) i minst 30 minutter ved romtemperatur. Vask embryo i PBS/Triton 2x for 5 min og fjerne fosteret i skala-U2 løsning23 over natten.
  8. For å analysere effektiviteten av electroporation (se figur 2), bruke binær og partikkel analyseverktøyet og DAPI kanal på ImageJ å få kjernefysiske skisserer fra alle celler i bildet.
    1. Hvis du vil bruke det binære verktøyet på ImageJ, bruker du en enkelt z-sektor i DAPI-kanalen som inneholder et flertall av celler, og klikker prosess ≫ binær ≫ lag binær. Hvis du vil skille celler i nærheten, klikker du prosess ≫ binær ≫ vannskille. Få tak i celle omriss ved å klikke analyser ≫ analyser partikler, størrelse satt til 100-500 (μm2).
    2. Kontroller at et flertall av cellene er skissert i DAPI-kanalen, og lagre celle konturene ved å klikke mer ≫ lagre i popup-vinduet ROI Manager.
    3. Bruk disse oversiktene til å hente verdier for fluorescens intensitet for mRNA-og DNA-kanalen ved å åpne den tidligere lagrede filen på en enkelt z-sektor i mRNA-eller DNA-kanalen, og klikk deretter mål på AVKASTNINGS lederen.
    4. Til slutt filtrerer du disse intensitet verdiene, teller celler med < 6000 fluorescens intensitet som ikke-transfekterte og celler med > 6000 fluorescens intensitet som transfekterte.

5. bilde FPs kodet av Electroporated mRNAs

  1. Velg den sunneste og beste electroporated embryo for dynamiske Imaging eksperimenter etter å ha sett på alle electroporated embryo under fluorescerende dissekere stereoscope.
    1. Fortsett å ruge den andre electroporated embryo og ikke-electroporated embryo (negativ kontroll) i en egen inkubator mens Imaging valgt embryo i tilfelle dette embryo dør under eksperimentet.
  2. For den dynamiske bildebehandling, bruk hele-Mount ex ovo avian embryo kultur som tidligere beskrevet24,25,26 med et invertert konfokalmikroskopi mikroskop.
    Merk:
    mikroskop er utstyrt med en på scenen inkubator (se tabell over materialer) som opprettholder temperaturen ved 36 ° c under bildebehandling. Det ble observert under mikroskopet satt opp at embryo inkubert ved 36 ° c overleve lengre enn ved høyere temperaturer, muligens fordi laseren kan forårsake lokal oppvarming på fosteret. Leserne bør bestemme den optimale på scenen inkubasjons temperatur for sitt eget mikroskop oppsett.
    1. For dynamisk bilde og visualisere embryogenesis, rengjør electroporated embryo kort med PBS å fjerne eventuelle bobler som kan danne på rygg siden av fosteret under electroporation prosessen ved å flytte embryo rundt ved hjelp av tang i en PBS ren Løsning.
    2. Plasser det rene embryo direkte på en avbildnings rett som inneholder et tynt lag med albumen-agar (~ 150 μL), og pass på at du ikke genererer bobler på rygg flaten til fosteret22.
    3. Å sikre overlevelse for lang-frist tenkelig, sammenlegge en liten fuktighet gynge-opp stykke av tissue papir for det innenfor kanter av det tenkelig fat og sel fatet benytter parafin film å minimere fordampning i løpet av tenkelig og inkubasjons.
    4. Flytt denne parabolen raskt til pre-varmet stadium av et konfokalmikroskopi mikroskop og finne farget fargestoff i fosteret ved hjelp av brightfield kanal (PMT laser 20%), som identifiserer injisert og electroporated regionen.
  3. Sette tenkelig programvare å det ønsket mål (10 eller 20x), dichroic speilet (488 NM for GFP NM, 561 for RFP), utstråling Spectra (499-562 NM for GFP, 570-695 NM for RFP), og skru på en passende laser (488 NM for GFP, 561 NM for RFP).
    Merk:
    Electroporated mRNA ble oversatt til proteiner som ble sett innen 20 min (se Figur 3). Bilde metadataene som brukes for de fleste av bildene i denne utredningen var: en invertert konfokalmikroskopi mikroskop med en 20x objektiv (se tabell over materialer); piksel botid, ~ 1,5 μs; gjennomsnitt av 4-linjers skanninger.
    1. Klikk på live på bilde programvaren og Juster laser strømmen til en innstilling som passer for fluorescens intensitet, avhengig av hver laser effekt for mikroskop. Start med Imaging fosteret med 1% laser effekt, 800 gevinst, og øke laser kraft langsomt med 1% trinn til mettede piksler er sett.
    2. Følg dette ved å redusere laserstrålen litt til ingen mettede piksler ses lenger.
      Merk: Laseren makt valgt for begynnelsen av en tenkelig økt av et embryo kan være bra for tidligere tid poeng, men ikke ideelt på senere tidspunkt hvis fluorescens av cellene blir mye lysere eller dimmer over tid. For å løse dette bildet embryo på litt lavere strøminnstillinger i utgangspunktet siden electroporated cellene generelt bli lysere i løpet av de første 6 timer etter electroporation (se figur 3a-E for kvantifisering av signal økning). Hvis de senere bildene er mettet, fortsetter du med de opprinnelige bildeinnstillingene, men tar et ekstra bilde umiddelbart etter med svakere bildeinnstillinger (mindre pinhole eller svakere laser effekt).
    3. Bilde fosteret hver 3-5 min for å spore individuelle celle migrasjon på tvers av ulike tidspunkt poeng. For dette arbeidet, bildene var z-stabler (~ 50 μm tykk) av hele electroporated området, pluss litt ekstra rom mot bunnen av z-stakken i tilfelle embryo synker inn i agarose sengen gjennom Imaging Session.
    4. Observer hvor fort cellene beveger seg ved å sjekke de første punktene i den første filmen. Hvis cellene beveger seg i rask hastighet (noe som betyr at de vil gå ut av området av avbildet regionen innen et par mer tid poeng), vurdere å utvide zoom av avbildet området (1x à 0.8 x) eller Imaging en annen region.
      Merk: Embryonale regioner i området pellucida bevege seg mye raskere enn de i området opaca. I tillegg yngre embryo (HH3, HH5) inneholder ofte celler som gjennomgår raskere bevegelse sammenlignet med eldre embryo (> HH7).
    5. Etter Imaging den electroporated regionen av fosteret, bilde en un-electroporated område av samme embryo å bestemme autofluorescence nivåer (bør være minimal Hvis lav laser effekt < 10% brukes til å avbilde embryo).

6. fluorescens Recovery etter Photobleaching (FRAP) til analysen mRNA integritet

Merk: En in vivo fluorescens Recovery etter photobleaching (FRAP) analysen kan brukes til å bestemme hvor lenge transfekterte mRNA kunne oversettes til FPs. Følgende protokoll skisserer et FRAP eksperiment for å oppdage halveringstiden av H2B. Citrin mRNA i et electroporated embryo.

  1. Utføre FRAP eksperimenter på invertert konfokalmikroskopi mikroskop ved hjelp av en 20x 0,8 NA mål og en helt åpen pinhole.
    1. Etter å ha bekreftet electroporation av H2B-Citrin på stereomikroskopet og sette embryo på pre-oppvarmet Stadium på invertert konfokalmikroskopi mikroskop (se trinn 5.2.4), photobleach det meste av mobilnettet fluorescens fra H2B-Citrin på en rekke tid poeng (45 min, 2 h, og 5 h post-electroporation) ved hjelp av 405 NM laser med 70% laser effekt, 100 gjentakelser, skannehastighet 4, som etterlater bare 5% av fluorescens gjenstår.
      Merk: Denne prosessen bør ta et par minutter.
    2. Fortsett å ruge embryo på scenen ved 36 ° c etter photobleaching.
  2. Pass på å ta hensyn til aktivt å dele celler i photobleached regionen, noe som tyder på at de photobleached cellene ikke har helt dødd post-behandling.
  3. Innhent bilder (z-stabler av electroporated-regionen) i opptil 30 minutter ved regelmessige tidsintervaller (3 eller 5 min) med konfokalmikroskopi mikroskop.
    Merk: Hvis tilgjengelig, bruk en transgene H2B-XFP-linje som en positiv kontroll for å sikre celle overlevelse i photobleached regionen. Frekvensen av fluorescens gjenoppretting for FP-kodet av electroporated-mRNA bør reduseres, men at for FP-kodet via transgene bør være konsekvent gjennom hele filmen.
  4. For å sikre at bilde forholdene ikke deleteriously påvirker embryo overlevelse, samtidig ruge electroporated embryo som ikke er photobleached, som kan tjene som en kontroll for Imaging.
  5. For å quantitate de photobleaching resultatene for mRNA forfall post-electroporation, spor cellen fluorescens over tid (3 eller 5 min) ved å måle den fluorescens intensiteten av senteret (en 7,5 μm sirkel) av hver celle med ImageJ. Mål dette for alle celler i photobleached regionen som ikke gjennomgår mitose og har blitt fullstendig photobleached.
    Merk: Vurder å utelate de mitotisk cellene fra kvantifisering siden mitotisk kjerner har sterkere fluorescens enn Interphase kjerner på grunn av kromatin kondens.
  6. Plot fluorescens intensitet over tid etter blekemiddel på en rekke tids punkter (45 min, 2 h, og 5 h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA electroporation er mer effektiv enn DNA-electroporation

Vi brukte pCS2 +. H2B-Citrin for å klargjøre in vitro mRNA. Siden DNA-electroporation vanligvis utføres ved 1-2 μg/μL, brukte vi en ekvimolare konsentrasjon av mRNA (beregnet til å være rundt 0,25-0,5 μg/μL for H2B-Citrin) for mRNA electroporation. Vi først testet electroporation effektiviteten av pCS2 +. H2B-Citrin DNA sammenlignet med H2B-Citrin mRNA (in vitro skrives ut fra SP6 arrangøren av pCS2 +. H2B-Citrin) av electroporating DNA eller mRNA separat i HH5 vaktel embryo deretter undersøke electroporation effektivitet ved 12 h post-electroporation. Selv om DNA-electroporation fører til lysere fluorescens i noen electroporated celler, var effektiviteten av DNA-electroporation synlig lavere sammenlignet med den allment uttrykte mRNA-kodede FPs-en (figur 2a og B).

Å gjøre rede for iboende embryo-til-embryo variasjon i electroporation protokollen, en ekvimolare kombinasjon av mRNA koding H2B-Citrin og DNA uttrykker H2B-mKate2 ble electroporated inn i ektoderm av HH5 embryo og observert 12 h post-electroporation. Ved sammenligning av DNA og mRNA co-electroporation i samme embryo, var DNA som uttrykker FP også betydelig og konsekvent mindre effektiv enn mRNA (figur 2C). Ved kvantifisere alle embryo electroporated med bare mRNA, DNA, eller en kombinasjon av de to, fant vi ut at mRNA transfects ~ 75% av cellene i en gitt region, mens DNA bare transfects ~ 25% av cellene i en gitt region (figur 2D). Spredningen i uttrykket av fluorescerende proteiner kodet av mRNA eller DNA var ikke signifikant forskjellig i alle co-electroporated embryo (figur 2e).

Protein uttrykk er raskere i mRNA electroporation enn DNA electroporation

Den transfekterte mRNA bør føre til raskere protein produksjon siden det kan umiddelbart gjenkjent av cytosolic oversettelse maskiner som sett i Figur 3. DNA må være translocated til kjernen, kopieres, og mRNA transportert tilbake til stoffer der det er anerkjent av cytosolic oversettelse maskiner, forventes å ta mer tid. For å direkte sammenligne mRNA versus DNA uttrykket utbredelsen av protein produksjon, gjennomførte vi en rekke tid kurs eksperimenter der vi co-electroporated en ekvimolare kombinasjon av DNA (pCMV. H2B-mKate2) og mRNA (H2B-Citrin) i ektoderm av HH5 embryo. Vi oppdaget mRNA-kodet FP uttrykk rundt 22 min post-electroporation, som fortsetter å øke i relativ fluorescens intensitet for ~ 6 h (figur 3a-E, supplerende. Film S1b). I kontrast, DNA-kodet FP uttrykk er første sett på ~ 1,5 h post-electroporation (figur 3A'-E ', supplerende. Film S1c) og fortsetter å øke i lysstyrke inntil 6 h når filmen ble stoppet. Fordi DNA-electroporated celler ble mettet av 6 h-merket, reimaged vi denne tilstanden med svakere bildeforhold (figur 3F-F ' '). Over all tid poeng av denne tiden forfalle (22 min til 6 h), mRNA transfects flere ganger flere celler enn DNA (supplerende. Film S1a, den totale effektiviteten av electroporation gjennom brightfield og DAPI vises ikke fordi disse bildene er tatt fra en time-lapse av en vill type vaktel embryo). Basert på dette, konkluderer vi at mRNA electroporation fører til tidligere uttrykt protein.

Co-electroporation av flere mRNAs er svært effektiv

Deretter forsøkte vi å ytterligere teste effektiviteten til mRNA electroporation ved å electroporating flere mRNAs i en region av interesse. Co-electroporation av flere DNAs hadde tidligere vist å være relativt ineffektiv, viser med antall multi-merket blir 25%, 14%, og 10% for 2, 3 og 4 DNA konstruerer electroporated, beregnet som en andel av det totale antall celler11 . Vi electroporated først to mRNAs som koder Spectrally distinkte FPs (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrin) til HH5 embryo og oppnådde høy transfeksjoner effektivitet i alle electroporated regioner. Vi brukte denne dobbel-electroporation å fange filmer av radial ekspansjon mellom området pellucida og opaca i en HH4 gastrulating embryo, avbildet 2 h post-electroporation (supplerende film S2a, b, og c). Den H2B-Citrin er lokalisert i cellekjernen og tillater celle spredning skal spores27. Den Turquoise2-Golgi FP ser ut til å vise subcellulære polaritet innenfor de embryonale cellene, men ser ikke ut til å relatere med hastighet eller retning av bevegelige ektoderm celler i vivo28. Denne filmen (supplerende Movie S2) viser at celler electroporated med flere mRNAs kan fortsette normal mobilnettet aktivitet uten noen åpenbare defekter.

Videre, co-electroporation av 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (for å visualisere Golgi apparater), LifeAct-eGFP (for å visualisere F-utgangen), H2B-Citrin (for å visualisere nucleus), og membran-kirsebær FP (for å visualisere membraner)-resulterte i 87% transfeksjoner effektiviteten til alle 4 mRNAs i alle electroporated områder (Figur 4). LifeAct-EGFP og H2B-Citrin ble adskilt av det lineære unmixing prosesserings verktøyet i den kommersielle programvaren.

FRAP analysen viser den raske nedbrytning av electroporated mRNA i løpet av de to første timene etter electroporation.

Det er velkjent at nakne mRNAs er raskt degradert av mobilnettet RNAases29. Vi postulert at mRNA-electroporation kan være nyttig for eksperimenter med tap eller vinning ved å tillate raske og effektive uttrykk for proteiner i et embryo som utvikler seg. Derfor ville det være nyttig å quantitate frekvensen av mRNA forfall etter mRNA electroporation, siden mRNA forringer raskere enn DNA i celler. I tidligere rapporter om mRNA electroporation i voksen mus nevrale stamceller, rundt 80% mRNA ble identifisert 2 h post-electroporation av qRT-PCR, men lite eller ingen mRNA ble oppdaget av 24 h post-electroporation15. Vi forsøkte å ytterligere kvantifisere mRNA uttrykk post-electroporation ved å designe en in vivo FRAP-analyse for å oppdage mRNA-nivåer i electroporated celler.

Photobleaching er irreversible ødeleggelse av fluoroforen som kan oppstå når fluoroforen (fluorescerende proteiner i vårt tilfelle) er i en spent tilstand, noe som eliminerer fluorescens under observasjon30,31. Eventuelle slippes lys fra fluorescerende proteiner (FPs) som kan oppdages i photobleached celler over Baseline nivåer bør derfor representerer nylig oversatt FPs kodet av intakt, transfekterte mRNAs. Derfor forsøkte vi å photobleach de electroporated cellene for å eliminere alle eksisterende FP-avledede fluorescens på en rekke ulike tids punkter og spore påfølgende fluorescens gjenoppretting.

Ved hjelp av optimaliserte innstillinger for photobleaching som beskrevet i protokoll delen, fant vi ut at photobleaching i utgangspunktet reduserer fluorescens intensitet i alle photobleached celler med ~ 95% når analyseres umiddelbart etter photobleaching hendelsen. Dette ble gjort ved 45 min, 2 h, og 5 h post-electroporation (figur 5a-C). Fluorescens utvinning i hver celle i photobleached regionen ble sporet over en 30 min tidsperiode etter photobleaching på hvert tidspunkt ved Imaging den samme regionen med regelmessige tidsintervaller (3 eller 5 min). Våre data tyder på at det er en betydelig nedgang i transfekterte mRNA nivåer mellom 45 min og 5 h post-electroporation. Dette vises ved den store reduksjonen i FRAP målt ved 5 h sammenlignet med 45 min post-electroporation. For å markere fluorescens utvinning i bleket cellene, spesielt i 5 h tid punkt, forbedret vi lysstyrken i figur 5a-C ved hjelp av lysstyrke/kontrast verktøyet i ImageJ og vise disse endrede bilder i figur 5D-F. Interessant er det en stor heterogenitet i fluorescens utvinning fra celle-til-celle innenfor photobleached området på 2 h fordi noen celler gjenopprette fluorescens raskere enn andre celler (figur 5e ' ', se pilspisser). Men alle celler i 5 h photobleached området gjenopprette fluorescens tregere (figur 5F ' ') enn photobleached celler på 2 h. Vi oppdager også aktivt dele celler i vår photobleached regionen, noe som tyder på at cellene ikke har dødd som følge av photobleaching prosessen (figur 5e ' ').

Vi kvantifisere disse resultatene i figur 6a ved å vise normalisert signal intensiteten av hver celle innenfor de photobleached områdene over en 30 min periode etter photobleaching hendelsen. For hver celle ble de fluorescens verdiene normalisert mot signal intensiteten til den cellen umiddelbart etter photobleaching. Dette normalisering ble gjort for alle celler på tvers av alle tidspunkt punkter avbildet (45 min, 2 h, 5 h). Normalisert verdiene av fluorescens utvinning av cellene i samme bilde bleket regionen ble deretter samlet sammen og grafisk over tid etter photobleaching hendelse; Derfor representerer hvert punkt i grafen ~ 35 celler. Den normalisert data er også vist i figur 6b, der hver linje representerer en celle med utvinne fluorescens signal intensitet umiddelbart etter photobleaching. Denne data samlet tyder på at ved 5 h, har alle celler utarmet det meste av sine mRNA, med en stor del av denne drop forekommer mellom 45 min og 2 h post-electroporation.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av kloning prosedyre for å gjøre pCS2 + LifeAct-eGFP konstruere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: mRNA electroporation er mer effektiv enn DNA-electroporation. (a-a ' ') DNA uttrykker pCS2. H2B-Citrin ble electroporated inn i ektoderm av HH5 embryo. Fluorescens ble observert 12 h post-electroporation. Scale bar = 50 μm. (b-b ' ') MRNA uttrykker H2B-Citrin ble electroporated inn i EKTODERM av HH5 embryo. Fluorescens ble observert 12 timer etter electroporation. Scale bar = 50 μm. (c-C ' ') ekvimolare kombinasjon av DNA (PCMV. H2B-mKate2) og MRNA (H2B-Citrin) ble electroporated inn i HH5 embryo og observerte 12 h post-electroporation. Tre embryo ble testet per betingelse (n = 2 eksperimenter). Scale bar = 50 μm. (D) tre embryo fra A, B og C (9 totalt embryo) ble kvantifisert for electroporation effektivitet ved hjelp av partikkel analyseverktøyet på ImageJ. En 200 μm-region fra hvert embryo ble kvantifisert (minst 150 celler ble telt per region). Midt strek representerer gjennomsnittet, mens topp-og bunn linjene representerer standardavvik fra gjennomsnittet. (E) tre co-ELECTROPORATED (DNA og mRNA) embryo blir analysert for spredning av signal på tvers av alle electroporated celler i en gitt 200 μm regionen. Hvert embryo hadde rundt 100 celler positive for mRNA electroporation og 30 celler positive for DNA electroporation. Midt strek representerer gjennomsnittet, mens topp-og bunn linjene representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Det er ingen signifikant forskjell mellom spredningen av mRNA g. DNA electroporation, men mRNA electroporation er mye mer effektivt enn DNA. (A-C) Dimensjoner = 425,10 x 425,10 x 55 μm. pixel bor 2,55 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Metadata for mikroskop = invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) (A) Ex: 488 nm (0,05%), utslipps spor S1 = 508-579 NM; (B) ex = 488 NM (5,0%), utslipps spor S1 = 508-579 NM; (C) ex = 488 NM (5,0%), 561 NM (5,0%), utslipps spor S1 = 508-579 NM; S2 = 606-695 NM Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: mRNA electroporation viser uttrykk med 22 min post-electroporation og er mye raskere enn DNA electroporation. Representative bilder av tid kurs etter mRNA (H2B-Citrin) og DNA (pCMV. H2B-mKate2) electroporation med tomten profil analyse på 22 min (a-A ' '), 45 min (B-b ' '), 1,5 h (C-C ' '), 3 h (D-D ' '), og 6 h (e-e '') på ved starten av bilde (n = 1). Plott profil analyse angis for hvert tids punkt som vises over den tegnede pilen i det sammenslåtte bildet. Hver topp i plottet profilen representerer kjernen i en electroporated celle. Cellene generelt blitt lysere over 6 h intervall av filmen, som indikerer at mRNA er fortsatt oversettes til nye fluorescerende protein. For 6-timers tids punkt, bilder av samme region tatt med identiske bildeforhold (e-e ' ') og svakere bilde betingelser (F-F ' ') vises fordi bildene av DNA electroporated celler var svært mettet ved hjelp av den første og bildeforhold. Scale bar = 20 μm. mål: 425,10 x 425,10 x 55 μm. bildet vises som en projeksjon av maksimal intensitet i alle tids punkter som er avbildet. Pixel dvele 2,55 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Metadata for mikroskop = invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) Ex = 488 NM (15%), 594 nm (5,0%) for første; Ex = 488 NM (7,5%), 594 NM (0,5%) for siste gang punkt (figur 2F), utslipps spor S1 = 499-562 NM; S2 = 605-661 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: co-electroporation av fire mRNAs målretting ulike sub-cellulære strukturer er svært effektiv. Ektoderm av et HH3 embryo ble electroporated med mRNAs som koder mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrin, og membran-Cherry. Fosteret var fast og avbildet på 4 timer etter electroporation. De fleste cellene er electroporated innenfor elektroden målrettede regionen med alle fire mRNAs (87%). Representative tall vist (3 embryo hver, n = 2 eksperimenter). Scale bar = 50 μm. (A) slå sammen alle fire MRNAs (MTurquoise2-Golgi, LifeAct-EGFP, H2B-Citrin og membran-Cherry). (B) kun H2B-Citrin kanal (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 NM). (C) bare MTurquoise2-Golgi kanal (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 NM). (D) Merge H2B-Citrin og MTurquoise2-Golgi viser at Golgi konvolutter en side av kjernen i de fleste celler. (E) bare LifeAct-eGFP kanal (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 NM). (F) bare membran-Cherry kanal (Ex = 594 nm (37,1%), EM = S2:570-695 NM). (G) Flett LifeAct-eGFP og membran-Cherry viser overlapping i de fleste celler. Dimensjoner = 425,10 x 425,10. Pixel dvele 1,58 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Mikroskop metadata = invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) Ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), utslipp spor S1 = 455-499 NM; S2 = 570-695 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Photobleaching analysen viser rask nedbrytning av Electroporated mRNA i løpet av de første fem timene etter electroporation. Photobleaching av en 100 μm ² region som inneholder celler electroporated med mRNA uttrykker H2B-Citrin er utført på 45 min, 2 h, og 5 h post-electroporation. Fosteret ble avbildet ved regelmessige tidsintervaller etter photobleaching (3 eller 5 min). Photobleaching betingelser er som følger: 70% 405 NM laser, 100 gjentakelser, ca 5 min varighet for hele regionen. Scale bar 50 = μm. (a-A ' ') 45 min før og etter blekemiddel. B viser embryo umiddelbart etter photobleaching og C viser embryo 30 min post-blekemiddel. Scale bar = 50 μm. (b-b ' ') 2 timer før og etter blekemiddel. Omkretsen av plassen er forskjøvet fordi cellene i photobleached regionen beveget seg litt under blekemiddel perioden. (C-C ' ') 5 timer før og etter blekemiddel. (D-D ' ') Samme bilder som A-A ' ' med forbedret lysstyrke (maksimumsverdi justert til 11550 for å forbedre lysstyrken etter innsamlingen). (e-e ' ') Samme bilder som B-B ' ' med forbedret lysstyrke (maksimumsverdi justert til 11550 for å forbedre lysstyrken etter innsamlingen). De hvite pilspisser peker til celler som har høyere fluorescens gjenoppretting enn omkringliggende celler. Den cyan Pilspissen peker på en photobleached celle som nylig har gjennomgått mitose. (f-f ' ') Samme bilder som C-C ' ' med forbedret lysstyrke (maksimal verdi justert til 11550 for å forbedre lysstyrke etter samling). Dimensjoner = 425,10 x 425,10 x 42 μm. bildet vises som en projeksjon av maksimal intensitet i alle tids punkter som er avbildet. Pixel dvele 1,58 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Metadata for mikroskop = invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) ex = 488nm (1,5%), utslipps spor S1 = 508-553 NM Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: kvantifisering av fluorescens utvinning i photobleached celler. (A) fluorescens intensitet av alle celler i bleket regionene (~ 35 celler) ble sporet for hver enkelt celle i løpet av hver tidsperiode etter blekemiddel. Det er en stor nedgang i takt med gjenvunnet signal intensitet fra 45 min til 2 h, etterfulgt av en mindre dråpe fra 2 t til 5 t. Den øverste feil linjen vises for hvert punkt, som representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Linjen som vises, er en lineær regression linje. R ² for 45 min, 2 h og 5 h er henholdsvis 0,83, 0,58 og 0,84. Den øverste halvdelen av feil feltet vises for hvert punkt. (B) fluorescens intensitet av alle celler i bleket regionene (~ 35 celler) ble sporet for hver enkelt celle i løpet av hver tidsperiode etter blekemiddel og grafisk uten normalisering. Det er en stor nedgang i takt med gjenvunnet signal intensitet fra 45 min til 2 h, etterfulgt av en mindre dråpe fra 2 t til 5 h. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggs film 1: mRNA electroporation fører til tidligere protein uttrykk enn DNA-electroporation. H2B-Citrin mRNA og H2B-mKate2 DNA electroporated i ektoderm av HH5 embryo. Region avbildet er på grensen til ekstra-embryonale og embryonale vev. Scale bar = 50 μm. (a) både H2B-CITRIN og H2B-mKate2 kanal vist (Ex = 488 NM (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 NM; S2:605-661 NM). (b) bare mRNA H2B-Citrin-kanal vist (Ex = 488 NM (15%), Em = 499-562 NM). (c) kun H2B-mKate2 DNA-kanal vist (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 NM). Dimensjoner = 850,19 x 850,19 x 110 μm. bildet vises som en projeksjon av maksimal intensitet i alle tids punkter som er avbildet. Pixel dvele 2,55 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Metadata for mikroskop: invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) Ex = 488 NM (15%), 594 nm (5,0%), utslipps spor S1 = 499-562 NM; S2 = 605-661 NM. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende film 2: co-electroporation av mRNAs tillater tydelig celle atferd skal dynamisk studert. Radial utvidelse av celler mellom den embryonale og ekstra embryonale grensen er electroporated med mRNA (H2B-Citrin og mTurquoise2-Golgi) og avbildet under ytre migrasjon. Denne filmen ble avbildet av konfokalmikroskopi mikroskopi fra 2 til 5 h post-electroporation av Imaging hver 6 min. Scale bar = 50 μm.  (a) både H2B-Citrin og MTurquoise2-Golgi kanaler vises (Ex = 458 NM (28%), 488 nm (5,0%), Em = 446-526 NM; S2:508-553 NM). (b) kun H2B-Citrin kanal vist (Ex = 488 nm (5,0%), EM = S2:508-553 NM). (c) kun MTurquoise2-Golgi kanal vist (Ex = 458 NM (28%), Em = 446-526 NM). Dimensjoner = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. bildet vises som en projeksjon av maksimal intensitet i alle tids punkter som er avbildet. Pixel dvele 0,79 μs. gjennomsnittlig linje 4. Biter per piksel = 16. Metadata for mikroskop = invertert konfokalmikroskopi mikroskop, 20x objektiv (se tabell over materialer) Ex = 458 NM (28%), 488 nm (5,0%), utslipp spor S1 = 446-526 NM; S2 = 508-553 NM. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen, ga vi steg for steg instruksjoner om hvordan du presist microinject og electroporate mRNA inn i cellene i gastrulating vaktel embryo. Vi viste at in vitro syntetisert mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo (figur 2 og 3). Fluorescens fra H2B-Citrin protein oversatt fra electroporated mRNAs kan oppdages av konfokalmikroskopi mikroskopi innen ~ 20 min og økt i FP-fluorescens i timevis (Figur 3, supplerende film 1). Dette er overraskende raskt og nær antatt modningstid for Citrin32,33. FPs uttrykt fra DNA-vektorer ble oppdaget etter 2-3 h (Figur 3, supplerende. Film 1), som ligner på tidligere rapporter8,34,35. Ulike FPs har unike modnings tider, så avansert planlegging vil sikre at den ideelle FP er valgt i form av Spectral skillet og modning Kinetics ønsket for eksperimentet. I tillegg syntetisert mRNAs mer effektivt co-transfect embryonale celler enn DNA vektorer11. Jo høyere transfeksjoner effektivitet resulterer i at flere celler blir transfekterte i regionen av interesse med singel (figur 2) eller flere populasjoner av MRNAs (Figur 4).

Stabiliteten av mRNA er sterkt regulert og kan påvirkes av polyadenylation, skjøting, oversettelse, sekundær struktur, og uoversatt regioner for å nevne noen36,37. Halv-livene til både endogene og syntetisert mRNA i cellene kan variere fra minutter til dager36,38. Vi brukte in vivo fluorescens Recovery etter photobleaching (FRAP) til å bleke eksisterende mRNA-kodede H2B-Citrin proteiner og observerte den mest merkbare H2B-Citrin fluorescens utvinning i løpet av de første 2 timene etter electroporation (figur 5 og 6). ulike mRNAs vil utvilsomt ha forskjellige halv-liv basert på deres lengde, interne sekvenser, 5 ' og 3 ' modifikasjoner36,37, så hver må være analyseres hvis ønskelig.

Vital Imaging krever vanligvis en trade-off mellom optimale forhold for høy kvalitet Imaging og rask, mindre giftig Imaging39,40. Når bildebehandling, er det tilrådelig å bruke så lite laser kraft som mulig for å minimere photobleaching og photoskade til embryonale celler (se notater for trinn 5,3 av protokollen)40. Hvis du endrer mikroskop innstillingen for raske samlinger (f.eks. raskere skannehastighet og mindre snitt), kan det ofte hjelpe uten å miste den nødvendige bildeoppløsningen41. Til slutt bør det utvises forsiktighet ved håndtering og manipulering av embryo under høsting, electroporation og bildebehandling (se trinn 4). Tidlig stadium embryo er delikat og kan lett skades.

Total, det akkurat beregner og akkurat lokaliseringen av mRNA electroporation tillatelse forstyrrelsene eksperimenter det kapitalisere på det rask gjengivelsen, tilpasse-transfeksjoner effektiv, og hastig forråtnelse av mRNA transkripsjoner. Over-uttrykk eller misexpression av et gen av interesse kan oppnås gjennom electroporation av syntetisert mRNAs. Tittering konsentrasjonen for hver mRNA er avgjørende, som electroporating for mye mRNA kan forårsake ikke-spesifikk cellulær toksisitet, mens for lite mRNA kan ikke etiketten ønskede celler eller indusere fenotypiske endringer tilstrekkelig. En overflod av vektorer generert for in vitro syntese av mRNAs som kodes FP fusjoner markører for visualisering eller endret gen produkter for forstyrrelser av ulike biologiske prosesser som allerede eksisterer fra ulike dyr modellsystemer. Mange av disse konstruerer designet for in vitro mRNA syntese kan raskt og rimelig innhentet fra non-profit plasmider repositories.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Vi takker David Huss for nyttig innsikt i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet delvis av Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) og USC Provost ' s undergrad Research Fellowship til M.T., den Saban Research Institute intramural Training pre-doktor Award til MD, og University of Southern California Undergraduate Research Associates program prisen til R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174, (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3, (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007, (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3, (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296, (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41, (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42, (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39, (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32, (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13, (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144, (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8, (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12, (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216, (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149, (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5, (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8, (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88, (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97, (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414, (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121, (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233, (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39, (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102, (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12, (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55, (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics