ラットおよびウサギ動脈瘤モデルにおける動脈瘤灌流および親動脈の知覚の評価のための蛍光血管造影

Neuroscience

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Summary

我々は、フルオレセイン系蛍光ビデオ血管造影(FVA)を用いて、ラットおよびウサギにおける側壁動脈瘤の動脈瘤灌流および血管透過性を効率的に評価するためのプロトコルを提示する。92.6%の肯定的な予測値によって、それは特別な装置が必要としないで、簡単だが非常に有効で経済的な方法である。

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Strange, F., Sivanrupan, S., Gruter, B. E., Rey, J., Taeschler, D., Fandino, J., Marbacher, S. Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models. J. Vis. Exp. (149), e59782, doi:10.3791/59782 (2019).

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Abstract

脳動脈瘤治療は、完全な閉塞を達成するだけでなく、親動脈の血流を維持することに焦点を当てています。フルオレセインナトリウムとインドシアニングリーンは、それぞれ血流と血管灌流状態の観察を可能にするために使用されます。本研究の目的は、ウサギやラットにおける側壁動脈瘤の誘導後のリアルタイム血流、血管灌流状態および動脈瘤の閉塞を検証し、これらの種の手順を検証するためにFVAを適用することです。

20の側壁動脈瘤は、ドナーウサギの頚動脈に脱細胞化動脈血管パウチを縫合することによって10匹のウサギで作成された。さらに、48匹のラットに48個のマイクロ外科的側壁動脈瘤が作成された。作成後1ヶ月のフォローアップ中に親動脈/動脈瘤複合体を解剖し、FVAはウサギの耳静脈カテーテル法およびラットのフェミニル静脈カテーテル法を介して静脈静脈蛍(10%、1mL)注射を用いて行った。その後、動脈瘤を採取し、パテンシーをマクロ的に評価した。

ウサギの動脈瘤16体中14人は、完全に閉塞したルミナを有する残留親動脈灌流を示さなかったが、11(79%)であった。FVA によって検出されました。技術的な問題により、4つの動脈瘤が除外された。ラットでは、残留動脈瘤灌流は48例中25例で大視認された。灌流の大術的証拠のない23人のうち、FVAは22の動脈瘤(96%)の発生率を確認した。FVA に関連する有害事象はありませんでした。フルオレセインは容易に適用可能であり、特別な装置は必要ない。これは、ウサギとラットとの実験環境で親動脈の完全性と動脈瘤の受入/残留灌流を評価するための安全かつ非常に効果的な方法です。対照的な薬剤としてフルオレセインを使用するFVAは、動脈瘤および基礎血管の経度を制御するのに有効であり、バイパス手術にも適応することができる。

Introduction

完全な動脈瘤の消滅および親動脈の完全性の証拠は動脈瘤の外科において最も重要である。ドップラー超音波検査、従来の脳血管造影(DSA)、コンピュータ断層撮影血管造影(CTA)または磁気共鳴血管造影(MRA)1など、親動脈の動脈の痛みと動脈瘤閉塞を確認するためのいくつかのオプションがあります。2.しかし、これらは多くの場合、実験室の設定では利用できない高価で時間のかかる方法です。さらに、それらは放射線被曝などの関連する副作用を持っているか、動きのアーティファクトを避けるために実験動物の追加の固定の必要性を持っている可能性があります。

新しい血管内デバイスの数が増えるにつれて、このようなデバイスの前臨床試験が連続して必要とされています。しかし、これらの研究はしばしば死後分析(例えば、マクロ病理学および専門学)に依存し、動的灌流に関する情報を欠いている。さらに、研究者にとっては、実験的な外科的処置の間に即時かつ信頼性の高い情報を得ることが重要である。蛍光血管造影は、費用対効果が高く、視覚化技術1、3、4を行いやすいです。

そのように、indocyanine緑(ICG)ビデオ血管造影は、しばしば臨床神経外科的処置で使用され、広範囲に研究されている5、6.フルオレセインビデオ血管造影(FVA)は、人間の視野の波長範囲内にある蛍光信号を作成する追加の利点を持つ代替技術であり、したがって、拡張スペクトル赤外線カメラなしで肉眼で見ることができます7.フルオレセインビデオ血管造影は、臨床脳血管外科であまり使用され、実験設定でのFVAに関する報告は1、4が不足している。

この報告書の目的は、ラットおよびウサギ前臨床脳血管研究におけるFVAの適用の実現可能性と範囲を実証することです。

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Protocol

げっ歯類は動物介護施設に収容され、実験はスイスのベルン大学動物福祉委員会(BE 108/16)および(BE65/16)によって検討され、承認されました。すべての動物は、食べ物と水への無料アクセスと標準的な実験室の食事で維持されました。すべての動物実験は、3R(置換、削減、改良)を慎重に検討して行われました。10匹の女性ニュージーランド白ウサギと48匹のオスのウィスターラットが含まれていた。ARRIVEのガイドラインは厳密に8に従いました。

注:ドナーウサギの頸動脈に脱細胞性動脈容器袋を縫合することにより、10匹のウサギで20個の側壁動脈瘤が作成された。さらに、48のマイクロ外科的側壁動脈瘤は、4、9の前に説明したように48匹のラットで作成された。画像化手順および顕微鏡解析は、動脈瘤作成の4週間後に行った。

1. フルオレセインビデオ血管造影に必要な材料の調製

  1. 青いバンドパスフィルタ(「材料の表」を参照)をテーピングして懐中電灯を修正します。トーチは青色光のみを放出する必要があります。ろ過されていない光の漏れを避けるために黒いテープを使用してください。
  2. カメラ(顕微鏡に取り付けられたものなど)に緑色のバンドパスフィルター(材料の表を参照)を装備し、発光フィルタとして機能します。緑色の光だけが通過できるはずです。

2. 職場・資料の準備

  1. 消毒液でワークスペースを消毒します。
  2. 汚染を防ぐために生殖不能のドレープでテーブルをカバーする。
  3. 手術には滅菌器具を使用してください。

3. 手術のための動物の準備

  1. 動物の体重を量る。
  2. 麻酔を誘発し、体重に応じて用量を調整します。
    1. ウサギの場合は、バランスのとれた麻酔を開始します。注射中に片手で目をシールドし、恐ろしい反応を減らします。動物を鎮静するのに役立つシートでケージをカバーします。
    2. 注射前に4%のイソファランと96%の酸素を持つガス室でラットを麻酔する。
  3. 麻酔の深さを監視します。動物が眠っていることを確認するために、彼らのつま先の間にピンチ。
    1. ウサギを背中に置き直す。彼らは反応してはいけません。
    2. ラットの場合は、尾をつまみ、反応が観察されないようにします。
  4. 乾燥を防ぐためにげっ歯類の目に歯類の目に歯色を適用します。飲み込む可能性を避けるために、ネズミの舌を引き出します。
  5. 麻酔の保存から始めましょう。
    1. ウサギの場合は、カテーテル化(22GシールドIVカテーテル、射出口付き、材料の表を参照)耳静脈。バランスのとれた麻酔を維持します。3 ウェイ ストップコックを使用して、複数の同時注射を有効にします。
    2. ラットの場合は、塩酸ケタミン50mg/kg、塩酸メデトミジンを経頭に注入してください。手術中に有毒なつま先のピンチで麻酔を監視します。反応の場合は、追加の麻酔薬を投与する。
  6. 動物を上の位置でボードにテープを貼り、切開位置を密接に剃ります。ベータ消毒剤で領域を消毒します。
    1. ウサギの場合は、首、特にステルノクレイドマストイドの筋肉の周りを消毒する。
    2. ラットの場合は、膀胱から大腸を横断する領域を消毒する。
  7. 手術中にマスクを通して酸素を投与し、加熱パッドで体温を維持します。

4. 動脈の調製

  1. 最良の結果を出すには、周囲の組織9、10から選択した血管を徹底的に解剖する。
    1. ラットの場合、尾静脈を同定する(より侵襲性が低く、好ましくは生存動物に用いられる)か、フルオレセイン注射用の大腿静脈を解剖する4、11。
      注:ウサギの場合、耳静脈はすでに麻酔に使用されているので、フロレセイン注射のために血管のさらなる解剖は必要ありません。
  2. 選択した容器の下に白いパッドを置き、周囲の組織とのコントラストを高める。
  3. 解剖された動脈の顕微鏡に取付けられたカメラに焦点を合わせます。

5. フルオレスチンビデオ血管造影

  1. フルオレセインナトリウム(100mg/mL、材料の表を参照)で満たされた5 mLシリンジをアルミニウム箔で覆い、光の暴露から保護します。ライトを消し(可能な限り)、フルオレスチンナトリウムを静脈内に注入します。光漂白を防ぐために暗闇の下で注入します。
    1. ウサギの場合は、3ウェイストップコックを通して0.3mL/kgのフルオレセインナトリウムをカテーテル化された耳静脈に注入します。
    2. ラットの場合は、カテーテルまたは25G針を介して大腿静脈に0.4 mL/kgフルオレセインナトリウムを注入する。
  2. 針またはカテーテルを0.5 mLの生理食液で洗い流し、すべての染料が注入されることを確認します。
  3. 変更された懐中電灯で外科分野を照らす。
  4. 修正されたカメラで撮影を開始します。血流は注射後数秒で見えるはずです(図1)。
    注:ここでは、フレームレート= 50フレーム/秒、焦点距離= 70 mm、およびF3.4を使用しました。

6. マクロ分析

  1. 動脈瘤および親動脈複合体を切除し、親動脈をマイクロハサミで開くことによって経度マクロを評価し、親動脈の内気および動脈瘤のオリフィスを評価する(図1、2)9を参照してください。 動脈瘤のサイズを測定します。動脈瘤親動脈複合体は、さらなる分析(例えば、ヒストロジー)のために保存することができる。

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Representative Results

手術中に心拍数と血圧をモニターした。平均心拍数はウサギで193/分、ラットで196/分であった。ウサギの体重は3.05-4.18kg、ラットの体重は335〜690gであった。

10匹中8匹のウサギでFVAを行うことができました(図1)。2匹のウサギの4つの動脈瘤検査は、技術的な問題のためにカメラで記録されませんでした。ラットのFVAに関する技術的な問題は報告されなかった。しかし、大腿静脈を穿刺するのが困難なため、FVAは1匹のラットでは行うことができませんでした。

8匹のウサギの16の動脈瘤のうち、2つの動脈瘤は親動脈の持続的な灌流を示した(表1参照)が、FVAは残留灌流を有する5症例を同定した。14匹のウサギ動脈瘤は、残留灌流マクロを示さなかったが、11(79%)であったその後、FVA を使用して検出されました。残留灌流は48匹中25匹(表1)でマクロ的に観察され、他の23匹のラットは残留灌流のマクロ的な徴候を示さなかった(図2)。23の動脈瘤のうち22はFVA(96%)を用いて確認された。全体で27症例中25例が確認され、正の予測値は92.6%、感度は100%、特異性は94.1%であった。(表2)。

要約すると、25の動脈瘤は残留灌流を示し、53の親動脈は特許であり、11はマクロ視認およびビデオ血管造影で閉塞した。ウサギのFVAに関連するわずかな合併症しかありませんでした。カテーテル法中の限界耳静脈の穿起など。それ以上の有害事象は経験されなかった。FVAによる死亡率および罹患率は報告されなかった。

Figure 1
図 1: ウサギのパテンシーを可視化する.(A)親動脈の多さは蛍光画像上にはっきりと見える(フルレセインからの緑色の放出が見られる)。(B)この動脈は遮蔽されている(蛍光画像)。両方の動脈をマクロスコピア的に検査した(C-D)。パネル(C) は、パネル A から動脈に表示されます。内膜が開いている。パネル(D)は、閉塞がマクロ的に見られるパネルBからの動脈を示す。オレンジ色の点線は、親動脈の境界線をマークします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: ラットの灌流を可視化する。(A) このパネルは、残留した動脈瘤を示す(赤い点線は残留灌流を示す)。(B) 灌流は検出できない。パネル(C) は、マクロスピーカルな精査中にパネル A からの動脈を示します。動脈瘤オリフィスが開いている。(D) 閉塞動脈瘤上の新生児のマクロ的な図。オレンジ色の点線は、親動脈と動脈瘤のドームをマークします。パネル(A)および(B)は蛍光のみの画像であり、緑色は蛍光発光を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パテンシー/残留灌流
マクロスコピカル + マクロスコピカル - フルオラセイン + フルオラセイン -
ウサギ 2 14歳 5 11歳
ラット 23歳 25名 22歳 21歳
合計 25名 39歳 27歳 32歳

表 1: パテンシー テスト。親動脈の有量はウサギでのみテストされ、ここで示されています。フルオレセインは、マクロスコパシー評価よりも親動脈の多くのペイテンシャルを検出した。(この設定のすべてのラットは、動脈瘤が腹部大動脈に縫合されたので、開いた親動脈を持っていた。動脈瘤の有性はラットのみで試験した。FVAを用いて23個のマクロ的に検出されたペテンシーのうち22個が確認された。25の21はFVAに対してパテンシーを示さなかった。

マクロスコピック陽性 マクロスコピックネガティブ 合計
フルオラセイン陽性 25名 2 27歳
フルオラセイン陰性 0 32歳 32歳
合計 25名 34歳

表 2: FVA の特異性と感度を計算するために使用される 2 ずつの表。

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Discussion

FVAはげっ歯類の容器を調べる有望で複雑な方法であり、市販の装置および市販の装置と行うことができる。FVAは容器が最初に適切な解剖を必要とするように容器の完全性の術中の評価が必要であるあらゆる外科の間に実施することができる。

著者らは、感染症、虚血およびコンパートメント症候群12などの不注意な事象のリスクが低いため、動脈注射に対する静脈注射を好んだ。静脈内注射は、信頼性の高い、空間的に制限された、高度に濃縮された染色を可能にし、小さな色素投与量13、14必要とする。さらに、静脈注射はフルオラセイン14、15の迅速なクリアランスを可能にする。別の方法は、選択した動脈に直接造影剤を注入することです。この方法は、研究者が血液とフルオラセインで外科場を汚染するのを防ぎたかったので、これらの実験では使用されなかった。このリスクを軽減するために、末梢静脈造影剤注射が推奨される13.

FVAの利点は、高コントラスト(人間の目で容易に検出可能)、上に示すように高感度(表2)、低コストで容易な取り扱い16である。フルオレスチンナトリウムは灌流を調べるのに選ばれた造影剤であった。可視光単独では、色素の励起および典型的な緑色光の発光に使用することができる。それにもかかわらず、この造影剤は青色光(約480nm)に最適で、強い緑色光(波長約530nm)15を発する。吉岡らによると、フルオレセインは非常に迅速に動脈を着色します 14.さらに、フルオレセイン富化血液の流れをリアルタイム15,17で観察することができる。FVA に必要な短い時間は、別の利点を提示します。このシリーズでは、1つのFVAを行うために平均2分(±1分)かかりました。

コントラスト剤としてフルオレスチンを使用する欠点は、非常に慎重な解剖を必要とする細い動脈壁のみでうまく機能することです。市川らは、石灰化や解剖されていない動脈による厚い壁を通る光の放出が妨げられるため、色素の絶滅を示した15.注射後、フルオレセインは肝臓で蛍光フルレセイングルクロニドに代謝される。注射後30分以内に、フルオレスチングルクロニドの濃度はフルオラセイン18の濃度を超える。フルオラセインは、長いクリアランス時間を必要とします。フルオレセインの静脈内注射後の即時再注射は、動脈および動脈瘤が最初の注射17から既に蛍光であるとして推奨されない。

フルオレセインの分子量は、色素の漏出を可能にするわずか376 kDaです。血管壁はまた、偽陽性の流れ評価(塗布後の時間の増加)につながる可能性がある蛍光になります。フッ素14の注入後約5分を開始して血管壁の斑状色が認められた。しかし、斑点の着色は、より大きな動脈でのみ観察された。中小動脈は、この染色構造17を示さなかった。残留充填を検出するために、動脈瘤を直ちに評価することをお勧めします。

毒性のリスクは非常に低いが、心臓および呼吸反応につながるフルオレスチンのいくつかの症例が記載されている14.本研究では、重篤な有害事象は発生しなかった。唯一の合併症は、耳静脈穿穿穿刺の2例であった。Lane et al.al.によると、フルオレセインナトリウムはヒト17で使用しても有害ではない。一方、フルオレセインは非常に不安定であり、白色光16に曝露してはならない- 代わりに赤色光源を使用することができる。

ウサギのフルオレセインの濃度を選択するために、研究者はラットの最も低い既知の作業用量(100 mg/mLフルオレセインナトリウムの0.2 mL)から始まり、徐々に1mLに増加した。その用量で強い蛍光シグナルが登録された。投与量は、蛍光が改善するかどうかをテストするために徐々に増加しました - これはそうではありませんでした。著者らは、100 mg/mLフルオレセインナトリウム13の1 mLを継続することを決定した。

術中に血管を調べるために利用できるもう一つの色素はICGである。そのサイズは775 kDaであり、そのようなかろうじて周囲の組織14を貫通する。発光波長が長いため、組織は800nm19でより透明になり、より深い構造が14,16に見えるようになるので、組織はより容易に浸透する。750-800nm内の励起波長は16、20、造影剤からの発光波長は約800nm16であり、いずれも人間の目には見えない。 血漿中の短い半減期のために、色素は注入され、繰り返し再利用することができる16.この色素を使用する場合の制限には、厚壁動脈20の問題および可視スペクトル13の外側の光の必要性が含まれる。その結果、ICGは高価な装置に依存しており、すべての実験室で容易に適用できるわけではない。

結論として、FVAはげっ歯類動脈瘤モデルの動脈瘤および親動脈のスクリーンの感受性に高い感受性の速く、安価で、信頼できる方法である。それは事実上罹患率と死亡率に関連付けられていない。それは外科およびフォローアップの間にリアルタイムの血流の監視を可能にする。その有効性を改善するために、注射は暗闇の中で行われるべきであり、細心の注意を払って解剖された容器に対して行われるのが最善である。この方法は、脳血管実験室で簡単かつ安全に実装することができ、実験コストを最小限に抑えることができます。

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Disclosures

すべての著者は、利益相反を確認しません。

Acknowledgments

この研究は、スイスのカントンスピタル・アラウからの研究助成金によって一部支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For rabbits
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera Sony NEX-5R
Catheter 22G Vasofix Safety
Disinfictant
Fluorescein sodium Fluorescein Faure 10%
Glas plate
Green filter Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Infusion pump Perfusor Secura
Ketamine hydrochloride any generic products
Needle 25G
Oxygen
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml, 50ml
Tape
Three-way-stopcock
Torch light
Xylazin any generic products
For rats
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera Sony NEX-5R
Disinfictant
Fluorescein sodium Fluorescein Faure 10%
Green filter Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Isoflurane
Ketamine hydrochloride any generic products
Medetomidine hydrochloride any generic products
Needle 25G
Oxygen
Plate
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml
Tape
Torch light

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References

  1. Kakucs, C., Florian, I. A., Ungureanu, G., Florian, I. S. Fluorescein Angiography in Intracranial Aneurysm Surgery: A Helpful Method to Evaluate the Security of Clipping and Observe Blood Flow. World Neurosurgery. 105, 406-411 (2017).
  2. Ajiboye, N., Chalouhi, N., Starke, R. M., Zanaty, M., Bell, R. Unruptured Cerebral Aneurysms: Evaluation and Management. ScientificWorldJournal. 2015, 954954 (2015).
  3. Suzuki, K., et al. Confirmation of blood flow in perforating arteries using fluorescein cerebral angiography during aneurysm surgery. Journal of Neurosurgery. 107, (1), 68-73 (2007).
  4. Gruter, B. E., et al. Fluorescence Video Angiography for Evaluation of Dynamic Perfusion Status in an Aneurysm Preclinical Experimental Setting. Operative Neurosurgery. Hagerstown. (2019).
  5. Raabe, A., et al. Prospective evaluation of surgical microscope-integrated intraoperative near-infrared indocyanine green videoangiography during aneurysm surgery. Journal of Neurosurgery. 103, (6), 982-989 (2005).
  6. Riva, M., Amin-Hanjani, S., Giussani, C., De Witte, O., Bruneau, M. Indocyanine Green Videoangiography in Aneurysm Surgery: Systematic Review and Meta-Analysis. Neurosurgery. (2017).
  7. Kuroda, K., et al. Intra-arterial injection fluorescein videoangiography in aneurysm surgery. Neurosurgery. 72, 2 Suppl Operative 141-150 (2013).
  8. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLOS Biology. 8, (6), 1000412 (2010).
  9. Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments. (92), e51071 (2014).
  10. Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32, (4), 772-777 (2011).
  11. Shurey, S., et al. The rat model in microsurgery education: classical exercises and new horizons. Archives of Plastic Surgery. 41, (3), 201-208 (2014).
  12. Foster, S. D., Lyons, M. S., Runyan, C. M., Otten, E. J. A mimic of soft tissue infection: intra-arterial injection drug use producing hand swelling and digital ischemia. World Journal of Emergency Medicine. 6, (3), 233-236 (2015).
  13. Flower, R. W. Injection technique for indocyanine green and sodium fluorescein dye angiography of the eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 12, (12), 881-895 (1973).
  14. Yoshioka, H., et al. Advantage of microscope integrated for both indocyanine green and fluorescein videoangiography on aneurysmal surgery: case report. Neurologia medico-chirurgica (Tokyo). 54, (3), 192-195 (2014).
  15. Ichikawa, T., et al. Development of and Clinical Experience with a Simple Device for Performing Intraoperative Fluorescein Fluorescence Cerebral Angiography: Technical Notes. Neurologia medico-chirurgica. 56, (3), 141-149 (2016).
  16. Alander, J. T., et al. A review of indocyanine green fluorescent imaging in surgery. International Journal of Biomedical Imaging. 2012, 940585 (2012).
  17. Lane, B., Bohnstedt, B. N., Cohen-Gadol, A. A. A prospective comparative study of microscope-integrated intraoperative fluorescein and indocyanine videoangiography for clip ligation of complex cerebral aneurysms. Journal of Neurosurgery. 122, (3), 618-626 (2015).
  18. Blair, N. P., Evans, M. A., Lesar, T. S., Zeimer, R. C. Fluorescein and fluorescein glucuronide pharmacokinetics after intravenous injection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27, (7), 1107-1114 (1986).
  19. Hillmann, D., et al. In vivo optical imaging of physiological responses to photostimulation in human photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (46), 13138-13143 (2016).
  20. Golby, A. J. Image-Guided Neurosurgery. Elsevier Science. (2015).

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