Transferencia de neutrófilos asociados a tumores manipulados a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico en Vivo

Cancer Research

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Summary

Aquí, mostramos el potencial terapéutico de los neutrófilos anti-angiogénicos asociados a tumores después de su transferencia a ratones portadores de tumores. Este protocolo se puede utilizar para manipular la actividad de neutrófilos ex vivo y para evaluar posteriormente su funcionalidad in vivo en el desarrollo de tumores. Es un modelo adecuado para estudiar posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos.

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Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

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Abstract

La contribución de los neutrófilos a la regulación de la tumorigenesis está recibiendo mayor atención. Estas células son heterogéneas, y dependiendo del entorno tumoral puede poseer capacidad pro o antitumoral. Una de las citoquinas importantes que regulan las funciones neutrófilas en un contexto tumoral son los interferones de tipo I. En presencia de interferones, los neutrófilos adquieren propiedades antitumorales, incluyendo citotoxicidad o estimulación del sistema inmunitario. Por el contrario, la ausencia de una señalización de interferón da lugar a una actividad protumoral prominente, caracterizada por una fuerte estimulación de la angiogénesis tumoral. Recientemente, podríamos demostrar que las propiedades pro-angiogénicas de los neutrófilos dependen de la activación de la vía de señalización de nicotinamida fosforibosiltransferasa (NAMPT) en estas células. La inhibición de esta vía en neutrófilos asociados a tumores conduce a su potente fenotipo anti-angiogénico. Aquí, demostramos nuestro modelo recientemente establecido que permite la evaluación in vivo del potencial tumorigénico de neutrófilos asociados a tumores manipulados (TAN). En poco tiempo, los neutrófilos pro-angiogénicos asociados a tumores pueden aislarse de ratones con deficiencia de interferón con tumores y repolarizarse en fenotipo antiangiogénico mediante el bloqueo de la señalización NAMPT. La actividad angiogénica de estas células se puede evaluar posteriormente mediante un ensayo de anillo aórtico. Los TAN antiangiogénicos se pueden transferir a receptores de tipo silvestre portadores de tumores y se debe controlar el crecimiento tumoral durante 14 días. En el día 14 ratones son sacrificados, los tumores se extirpan y se cortan con su vascularización evaluada. En general, nuestro protocolo proporciona una herramienta novedosa para evaluar in vivo la capacidad angiogénica de las células primarias, como los neutrófilos asociados a tumores, sin necesidad de utilizar modelos de líneas celulares de neutrófilos artificiales. Vc

Introduction

Los interferones tipo I (IFN) desempeñan un papel importante en la estimulación de las respuestas del huésped a las neoplasias, ya que la falta de señalización IFN de tipo I da como resultado un crecimiento tumoral significativamente elevado1. Uno de los mecanismos involucrados en este proceso es la regulación de la actividad tumorigénica de los neutrófilos asociados a tumores, que es controlada por el receptor del factor 3 estimulante de la colonia (CSF3R) señalización aguas abajo2. Se demostró que el factor 3 estimulante de colonias (CSF3), o factor estimulante de colonias de granulocitos, activa la señalización que implica nicotinamida fosfosibositransferasa (NAMPT)3,4. NAMPT es una enzima limitante de la tasa para la síntesis de dinucleótidos de adenina nicotinamida, que mejora la glucólisis y regula la reparación del ADN, la expresión génica y la respuesta al estrés promoviendo la supervivencia y proliferación de las células cancerosas5. NAMPT está sobreexpresado en múltiples tipos de cáncer, incluyendo colorrectal, ovario, mama, gástrico, cáncer de próstata y gliomas6. NAMPT es esencial no sólo para las células tumorales, sino también para una amplia variedad de otros tipos de células que están presentes en los tumores, tales como las células mieloides - impulsa su diferenciación4, inhibe la apoptosis y estimular la expresión de múltiples citoquinas o enzimas degradantes de matriz en macrófagos7.

Los neutrófilos asociados a tumores representan moduladores importantes del crecimiento tumoral. Las funciones TAN dependen en gran medida de la disponibilidad de IFN de tipo I, ya que estas citoquinas prima de la actividad antitumoral de los neutrófilos. Por el contrario, la ausencia de IFN apoya la activación tumorigénica de estas células, especialmente sus propiedades pro-angiogénicas. De acuerdo con esto, los ratones deficientes en IFN desarrollan tumores vascularizados significativamente más grandes y mejores, que están fuertemente infiltrados con neutrófilos protumorales/pro-angiogénicos1,2,8, 9,10. Es importante destacar que estos TAN pro-angiogénicos muestran una actividad elevada de NAMPT, lo que sugiere su papel esencial en la polarización protumoral de los neutrófilos.

El agotamiento de neutrófilos utilizando anticuerpos Ly6G o la inhibición de su migración (anticuerpo CXCR2) da como resultado una disminución de la angiogénesis tumoral, el crecimiento y la metástasis1,8. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales generados son inmunogénicos, y su administración se asocia con una serie de efectos secundarios potencialmente mortales11. El tratamiento con moléculas pequeñas, como el inhibidor de NAMPT FK866, que modulan la tumoriogenicidad de los neutrófilos, podría ayudar a evitar tales complicaciones. Desafortunadamente, inhibición sistémica farmacológica de NAMPT, junto a su efecto terapéutico sobre el crecimiento tumoral, conduce a efectos secundarios graves incluyendo toxicidad gastrointestinal y trombocitopenia. Por lo tanto, la aplicación sistémica de los inhibidores NAMPT no es factible12,13,14.

Por esta razón, sugerimos aquí un protocolo donde la actividad NAMPT se bloquee directamente en los TAN aislados. Estos neutrófilos antitumorales se transfieren de forma adoptiva a un huésped portador de tumores. Este protocolo ayudará a evitar efectos secundarios tóxicos sistémicos de los compuestos, mientras que su efecto sobre las células diana se mantendrá.

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Protocol

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, han sido aprobados por las autoridades reguladoras: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) y Regierungspr-sidium T-bingen, Alemania. Todas las manipulaciones deben realizarse en condiciones estériles (bajo campana de flujo laminar) utilizando reactivos e instrumentos estériles (jeringas, tijeras, fórceps, bisturíes desechables, platos Petri).

NOTA: El esquema general del protocolo se muestra en la Figura1.

1. Preparación de la línea celular del melanoma B16F10

  1. Preparar células micoplasma negativas cultivadas a una monocapa de confluente del 90% (aproximadamente 10 x 106 células/matraz T75) en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDMc: IMDM + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) + 1% penicilina-estreptomicina).
  2. Retire el medio y enjuague las células con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Aplicar 6 ml de una solución de desprendimiento celular que contenga enzimas proteolíticas y collagenolíticas (ver la Tabla de Materiales)e incubar a 37oC durante 2 min.
  3. Golpee suavemente el matraz para movilizar las células adherentes restantes desde la parte inferior. Recoger la suspensión celular en tubos de 15 ml y centrifugar a 300 x g durante 7 min y 20oC.
  4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pozo de pellets en 1 ml de PBS. Añadir 14 mL de PBS y centrífuga (300 x g y 20oC durante 7 min).
  5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de PBS.
  6. Cuente las celdas y resuspenda a la concentración de 3 x 106/mL PBS (para el paso 2) o 6 x 106/mL PBS (para el paso 6) para inyección. Mantenga las células en hielo durante un máximo de 30 min.

2. Modelo de tumor alogénico en ratones

  1. Utilice 10 hembras Ifnar1-/- ratones de 8-12 semanas de edad que se mantengan bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF).
    NOTA: Los ratones hembra son preferibles en un modelo subcutáneo de crecimiento tumoral, ya que los machos son más agresivos y por lo tanto propensos a infracciones del sitio del tumor, lo que influye en el crecimiento tumoral.
  2. Afeitar la piel del ratón en el flanco con una afeitadora eléctrica, y desinfectar la piel con tejido húmedo con 70% de etanol.
  3. Recoger las células de melanoma B16F10 preparadas a una concentración de 3 x 106/mL PBS (ver el paso 1) en una jeringa de 1 ml y una aguja de 0,4 x 19 mm. Inyectar 100 ml de la suspensión por vía subcutánea.
    1. Mezcle bien las células antes de cada inyección. Utilice agujas de no menos de 0,4 mm de diámetro para no molestar a las células tumorales.
  4. Coloque hasta 5 ratones en una jaula y controle el tamaño del tumor (longitud, anchura y profundidad) con una pinza durante 14 días.
    NOTA: De acuerdo con la normativa animal, el tamaño del tumor no debe superar los 15 mm de diámetro, los ratones con tumores más grandes o necróticos/abiertos deben sacrificarse de antemano.
  5. En el día 14, sacrificar los ratones en la cámara de CO 2.
  6. Desinfectar la piel con 70% de etanol y eliminar tumores con tijeras y fórceps en un plato estéril de Petri. Mantenga los tumores en un tubo de 50 ml en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) sobre hielo.

3. Aislamiento TAN

  1. Coloque los tumores en placas estériles de 6 pocillos, 5 tumores por pozo. Cortar los tumores en trozos de 2-3 mm con tijeras estériles.
    1. Digestir con 1 ml de solución dispensa/colagenasa D/DNase I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg en 1 ml de DMEMc) por tumor. Incubar a 37oC, 5% CO2 en una incubadora húmeda y mezclar con una jeringa de 10 ml sin aguja cada 15 min 3 veces.
  2. Para eliminar las fibras no digeridas, malla las células a través de filtros de 100 m en tubos de 15 ml (un pozo por filtro por tubo). Añadir PBS a 15 ml, tubos centrífugos a 460 x g, 4 oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
  3. Eritrocitos Lyse con tampón de lisis (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 oC) añadiendo 1 mL en cada tubo. Mezclar bien, y combinar la solución de todos los tubos en uno. Detenga la reacción después de 2 minutos con 11 ml de DMEMc helado (4 oC).
  4. Centrifugar a 460 x g,4oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Resuspenda el pellet con 15 ml de PBS frío. Centrifugar a 460 x g,4oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
  5. Resuspenda el pellet en 1 ml de PBS. Añadir 3 ml de anticuerpos fc-bloque (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL), e incubar sobre hielo durante 15 min.
  6. Añadir anticuerpos: 10 mL de Ly6G-PE (stock 0,2 mg/ml) y 10 mL de CD11b-APC (stock 0,2 mg/ml). Añadir 20 ml de 6-Diamidin-2-phenylindol colorante de viabilidad (DAPI, stock 5 mg/ml) e incubar sobre hielo en la oscuridad durante 30 min.
    NOTA: Se puede utilizar otra combinación de colorantes de viabilidad y conjugados fluorescentes de anticuerpos.
  7. Añadir PBS hasta 15 ml, centrífuga a 460 x g, 4 oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
  8. Resuspenda el pellet en DMEMc a la concentración aproximadamente 10 x 106/mL, y manténgalo en hielo.
  9. Ordene los neutrófilos CD11b+ Ly6Ghi alive (DAPI-negativo) con un clasificador de células activado por fluorescencia (estrategia de gating ver Figura 2).
    NOTA: Mantenga el tubo con suspensión celular y el tubo con DMEMc para células clasificadas a 4 oC. Utilice los siguientes ajustes de clasificación óptimos: una boquilla de 70 mm, una velocidad umbral de un máximo de 22.000 eventos/segundo y un caudal de 1-3.
  10. Compruebe la pureza de los neutrófilos ordenados utilizando un catómetro para una pureza recomendada de >95%.
  11. Centrífuga sercifó neutrófilos ordenados a 460 x g, 4 oC durante 5 min, y eliminar el sobrenadante. Resuspenda las celdas ordenadas en DMEMc a la concentración de 1 x 106/mL.
    NOTA: El número esperado de neutrófilos en un tumor B16F10 de 14 días (10 mm de diámetro) es de aproximadamente 3 x 104 células.

4. Inhibición de NAMPT en TAN in vitro

  1. Preparar el material fk866 (inhibidor de NAMPT) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 100 mM.
  2. Neutrófilos clasificados por semillas (paso 3.11) en 2 pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos (1,5 x 105 neutrófilos/pozo). Añadir FK866 en el pozo de intervención (concentración final de 100 nM), y una cantidad igual de DMEMc con DMSO en el pozo de control. Incubar durante 2 h a 37oC, 5% CO2 en una incubadora húmeda.
  3. Centrifugar a 460 x g,4oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Resuspende en 200 ml de PBS en cada pozo. Repita 2 veces.
  4. Centrifugar a 460 x g,4oC durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Resuspender en medio de crecimiento celular endotelial comercial (complementado con suplemento de crecimiento de células endoteliales de 4 L/ml, factor de crecimiento epidérmico humano recombinante de 0,1 ng/ml, factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante de 1 ng/ml, heparina de 90 g/ml y 1 g/ml hidrocortisona) a una concentración final de 0,2 x 106 células/ml (en 0,75 ml) (para el paso 5) o en PBS a la concentración final de 0,6 x 106 celdas/ml (en 0,25 ml) (para el paso 6).

5. Estimación de las propiedades angiogénicas de los TAN utilizando el ensayo del anillo aórtico

  1. Disecciona la aorta torácica de un ratón macho C57BL/6J (WT). Limpie y corte en anillos de 0,5 mm de ancho. Coloque todos los anillos en un pozo de una placa de 24 pocillos con 1 ml de medio de crecimiento celular endotelial suplementado. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2 en una incubadora húmeda.
    NOTA: Es preferible el uso de ratones machos jóvenes (menores de 8 semanas) para la disección de aorta, ya que dan una respuesta angiogénica más robusta15.
  2. Llenar los pocillos de la placa de fondo plano de 96 pocillos con 50 ol de matriz de membrana de sótano solubilizada, dejar que el gel se ajuste durante 30 minutos en una incubadora húmeda de 37 oC, 5% CO2 para permitir que la matriz se polimerice. Prepare al menos 3 pozos por condición.
  3. Incruste los anillos en la matriz de membrana del sótano solubilizada colocando un anillo aórtico en la parte superior de la capa de matriz sólida, 1 anillo en el centro de cada pocil. Añadir otros 50 l de matriz de membrana de sótano solubilizada para cubrir cada anillo.
    1. Colocar la placa en una incubadora húmeda de 37oC, 5% CO2 durante otros 30 minutos para permitir la polimerización de la segunda capa de matriz.
  4. Añadir 150 ml/pozo de medio de crecimiento de células endoteliales suplementados y 2x104Ifnar1-/- TANs (control y TRATAMIENTO CON FK866) (paso 4.4).
  5. Incubar la placa durante 14 días a 37oC, 5%CO2 en una incubadora húmeda.
  6. Imagen utilizando un microscopio de contraste de fase estándar y estimar la ramificación endotelial. La evaluación cuantitativa de los parámetros morfométricos y espaciales de los recipientes, incluido el índice de bifurcación, se puede realizar automáticamente utilizando el programa de procesamiento de imágenes diseñado para imágenes científicas.
    NOTA: Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.

6. Transferencia adoptiva de neutrófilos tratados en el modelo tumoral alogénico

  1. Preparar células de melanoma B16F10 (paso 1.6) en PBS a una concentración de 6 x 106 células/ml.
  2. Preparar 2 tipos de neutrófilos: Neutrófilos tratados con FK866 y controlar los neutrófilos no tratados (paso 4.4) en PBS a una concentración 6 x 105 células/ml. Mezclar neutrófilos con células de melanoma B16F10 (la proporción final de neutrófilos a células tumorales 1:10) para tener 2 tipos de mezclas celulares.
  3. Tomar 10 hembras WT ratones 8-12 semanas de edad, 5 en cada grupo. Afeitar la piel en el flanco con una afeitadoa eléctrica, y desinfectar con 70% de etanol.
  4. Inyectar 100 l de la suspensión celular (paso 6.2) por vía subcutánea con una jeringa de insulina y una aguja de 0,4 mm de diámetro, a ambos grupos de ratones. Coloque 1-5 ratones del mismo grupo en una jaula.
  5. En el día 2, preparar 2 tipos de neutrófilos: neutrófilos tratados con FK866 y controlar los neutrófilos no tratados (paso 4.4) en PBS a una concentración 6 x 105 células/ml. Inyectar 100 ml de suspensión celular (paso 6.4) i.v. en la vena de la cola con una jeringa de insulina y una aguja de 0,4 mm de diámetro, a ambos grupos de ratones. Coloque ratones de vuelta a la jaula.

7. Medición del crecimiento tumoral, examen histológico

  1. Supervise el crecimiento del tumor cada dos días. Evaluar el tamaño del tumor con pinzas y calcular el volumen del tumorcon la fórmula V-4/3***(h*w 2)/8 (h-altura, ancho, anchura de la anchura).
  2. Sacrificar ratones en el día 14 en la cámara de CO 2. Retire los tumores y mida el peso del tumor.
  3. Congele los tumores en el compuesto de temperatura de corte óptimo en nitrógeno líquido, y guárdelos a -80 oC.
  4. Descongelar las muestras a -20 oC y preparar secciones de 5 mm con un criotoma. Dejar secar los criocortes durante 30 min a 20oC. Fijar las secciones en acetona fría de -20 oC durante 2 min y dejarlas secar durante 30 min a 20 oC.
  5. Bloquear con anticuerpos de bloque Fc (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL 1:500) en PBS durante 1 h a 20 oC.
  6. Mancha con conejo anti ratón Anticuerpo gamma Laminin (1:1500 en PBS, 200 l) durante 1 h a 20 oC. Lávese con PBS tres veces.
  7. Mancha con anticuerpo secundario de cabra anticonejo (stock 0,5 mg/ml, 1:400 en PBS,), antiratón sMA (1:500 en PBS) y 2 l de DAPI (stock 5 mg/ml, 1:100 en PBS) en un volumen final de 200 l de solución de anticuerpos. Incubar durante 1 h a 20oC en oscuridad. Lávese con PBS tres veces.
  8. Seque los toboganes durante 20 minutos a 20oC en la oscuridad. Montaje con medio de montaje anhidro para microscopía y cubierta con cubre. Dejar secar 1 h a 37oC.
  9. Realizar un examen microscópico. Cuantificar la vascularización contando el número total (opcionalmente área) de Laminin+ vasos y el número (área) de SMA+ vasos desarrollados.
    NOTA: Para realizar el análisis de imágenes, tome todas las imágenes en las mismas condiciones (luz, contraste, ampliación). En este caso, los parámetros de procesamiento son fijos y el procesamiento de imágenes se vuelve completamente automático. Los resultados representativos se describen en la Figura 4 y la Figura5.

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Representative Results

Utilizando el procedimiento descrito aquí, los neutrófilos Ifnar1-/- fueron aislados de tumores y tratados con el inhibidor de NAMPT FK866 durante 2 h. Se utilizaron como control los neutrófilos No tratados Ifnar1-/-. La efectividad del tratamiento se evaluó utilizando el ensayo del anillo aórtico, que refleja los pasos clave involucrados en la angiogénesis (degradación de la matriz, migración, proliferación, reorganización). Podríamos demostrar que los neutrófilos tratados con FK866 tienen una capacidad significativamente disminuida para estimular la formación de ramas aórticas, en comparación con las células no tratadas (Figura3A,3B). Los neutrófilos antiangiogénicos tratados con FK866 se inyectaron por vía subcutánea en ratones portadores de tumores (en el día 0 del flanco y en el día 2 i.v.). Podríamos observar un crecimiento tumoral significativamente deteriorado, en comparación con ratones inyectados con neutrófilos No tratados (Figura 4A,4B). El examen histológico de los tumores extraídos demostró la supresión significativa de la angiogénesis en tumores aislados de ratones tratados con TANs tratados con FK866, en comparación con los inyectados con neutrófilos Ifnar1-/- no tratados ( Figura 5A ,B).

Figure 1
Figura 1. El esquema del protocolo. Paso 1. Preparación de la línea celular del melanoma B16F10; 2. Modelo de tumor alogénico en ratones; 3. Aislamiento de los TAN de los tumores; 4. Inhibición de NAMPT en TANs in vitro; 5. Estimación de las propiedades angiogénicas de los TAN en el ensayo del anillo aórtico; 6. Transferencia adoptiva de neutrófilos tratados en el modelo tumoral alogénico; 7. Monitoreo del crecimiento tumoral, examen histológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Estrategia de ampliación para la clasificación de TANs. CD11b+ Ly6Ghi alive neutrofilos se clasifican a partir de tumores con la pureza 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Supresión de las propiedades angiogénicas de los TAN después del tratamiento con FK866. Las propiedades angiogénicas de ifnar1clasificados -/-Los TAN tratados con FK866 o con medio se estimaron utilizando un ensayo de anillo de aorta. La formación de la rama fue monitoreada durante 14 días, se presentan los resultados representativos en el día 14 (A). El tratamiento con FK866 disminuyó significativamente el número de ramas endoteliales (B). Los datos se muestran como mediana, rango intercuartil y min-max, *p<0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Retraso del crecimiento tumoral después de la transferencia adoptiva de neutrófilos tratados con FK866. Se evaluó la influencia de los TAN en el crecimiento tumoral. Los TAN fueron aislados, tratados con FK866 y se inyectaron en ratones portadores de tumores como se describió anteriormente. En el día 14 ratones fueron sacrificados, los tumores extirpados y analizados. Ifnar1-/- Se compararon los TAN tratados con FK866 frente a los controles. (A) Se midió el crecimiento del tumor, (B) se estimó la masa tumoral y (C). Los datos se muestran como mediana, rango intercuartil y min-max, *p<0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Vascularización tumoral suprimida después de la transferencia adoptiva de neutrófilos tratados con FK866. Los tumores se aislaron como se describió anteriormente (Fig. 4). La maduración del recipiente se evaluó utilizando anticuerpos anti-SMA (vasos maduros) y laminina antigamma (células endoteliales). (A) Se muestran las manchas representativas de los tumores: SMA (verde), laminina (rojo). Barras de escala: 50 m. (B) La cuantificación de la vascularización tumoral después de la transferencia adoptiva de los VALORES aquenes cultivados con FK866 (verde) o medio (rojo) los datos se muestran como mediana, rango intercuartil y min-max, *p<0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A pesar de los progresos en el tratamiento quirúrgico y farmacológico del cáncer, la terapia exitosa sigue siendo un desafío. Dado que se sabe que las células inmunitarias desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento tumoral, deben establecerse métodos novedosos que inhibidoran la tumorigeniidad de dichas células. Aquí demostramos un enfoque novedoso para suprimir el crecimiento tumoral a través de la transferencia adoptiva de neutrófilos asociados a tumores anti-angiogénicos. La focalización selectiva de la señalización pro-angiogénica de NAMPT en los TAM, utilizando el inhibidor de FK866, previene los efectos secundarios, que se observan en el tratamiento sistémico de FK866.

La parte más crítica del protocolo es la necesidad de utilizar neutrófilos primarios recién aislados. Los neutrófilos son células de corta vida, sometidas a apoptosis o activadas durante el procedimiento de aislamiento. Los neutrófilos murinos deben mantenerse en medios de 4 oC durante todos los pasos de aislamiento, incluida la clasificación celular. El aislamiento de los neutrófilos debe realizarse lo antes posible y el experimento no debe pausarse. El uso del bloque Fc permite reducir la tinción inespecífica de las células con alta expresión del receptor Fc, como las células NK. También recomendamos minimizar el número de anticuerpos conjugados fluorescentes para simplificar la estrategia de gating y evitar la activación de neutrófilos debido a la unión de anticuerpos.

El paso limitante del protocolo es el aislamiento de los neutrófilos vivos de los tumores debido a una cantidad relativamente baja de estas células en los tumores (no más del 1% de las células vivas individuales en el melanoma). Esto sólo podría ser posible mediante la ordenación basada en citometría de flujo. Al mismo tiempo, el uso de neutrófilos de sangre para este protocolo debe evitarse debido a la regulación menor de la expresión NAMPT y su baja funcionalidad, que se altera a la llegada del tejido tumoral16. Posiblemente, con el fin de utilizar neutrófilos de la sangre, deben activarse previamente utilizando factores de crecimiento derivados de tumores.

Para evitar la apoptosis de neutrófilos, se sugiere un tratamiento corto con FK866 (2-4 h), ya que no tiene ninguna influencia en la viabilidad de los TAN, mientras que el tratamiento prolongado induce la apoptosis de neutrófilos16. En resumen, el protocolo demuestra el potencial de los neutrófilos antiangiogénicos manipulados ex vitro para suprimir funcionalmente el crecimiento tumoral en el modelo tumoral de melanoma de ratón.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nuestro trabajo fue apoyado por subvenciones de Deutsche Krebshilfe, Número de Concesión: 111647, y Consejo Alemán de Investigación (DFG), Número de Subvención: JA 2461/2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

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References

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