Transferência de neutrophils tumor-associados manipulados em ratos do tumor-rolamento para estudar seu potencial angiogênico em vivo

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Aqui, nós mostramos o potencial terapêutico de neutrófilos tumor-associados antiangiogénicos após sua transferência em ratos tumor-tendo. Este protocolo pode ser utilizado para manipular a atividade de neutrófilos ex vivo e posteriormente avaliar sua funcionalidade in vivo no desenvolvimento de tumores. É um modelo adequado para o estudo de potenciais imunoterapias à base de neutrófilos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A contribuição de neutrófilos para a regulação da tumorigenese está recebendo maior atenção. Estas pilhas são heterogêneas, e dependendo do meio do tumor pode possuir a capacidade pro-ou do anti-tumor. Um dos citocinas importantes que regulam funções do neutrófilo em um contexto do tumor é tipo mim interferons. Na presença de interferões, neutrófilos ganham propriedades antitumorais, incluindo citotoxicidade ou estimulação do sistema imunológico. Inversamente, a ausência de uma sinalização do interferon conduz à atividade proeminente do pro-tumor, caracterizada com a estimulação forte da angiogênese do tumor. Recentemente, nós poderíamos demonstrar que as propriedades pro-Angiogenic dos neutrófilos dependem da ativação da via de sinalização do Fosforribosiltransferase do nicotinamida (NAMPT) nestas pilhas. A inibição desta via em neutrófilos tumor-associados conduz a seu phenotype antiangiogénico potente. Aqui, Nós demonstramos nosso modelo recentemente estabelecido permitindo in vivo a avaliação do potencial tumorigênico de neutrófilos tumor-associados manipulados (tans). Logo, os neutrófilos tumor-associados pro-Angiogenic podem ser isolados dos ratos interferon-deficientes do tumor-rolamento e repolarizado no phenotype antiangiogénico obstruindo da sinalização de NAMPT. A atividade angiogênica dessas células pode ser posteriormente avaliada por meio de um ensaio de anel aórtico. Os TANs antiangiogénicos podem ser transferidos em receptores do tipo selvagem do tumor-rolamento e o crescimento do tumor deve ser monitorado por 14 dias. No dia 14 camundongos são sacrificados, tumores removidos e cortados com sua vascularização avaliada. Globalmente, nosso protocolo fornece uma nova ferramenta para in vivo avaliar a capacidade angiogênica de células primárias, tais como neutrophils associados a tumores, sem a necessidade de usar modelos de linha celular de neutrófilos artificiais. vc

Introduction

Os interferões do tipo I (IFNs) desempenham um papel importante na estimulação das respostas do hospedeiro às Neoplasias, pois a falta de sinalização do tipo I IFN resulta em crescimento tumoral significativamente elevado1. Um dos mecanismos envolvidos neste processo é a regulação da atividade tumorigênica de neutrófilos tumor-associados, que é controlado pela sinalização a jusante do receptor de fator 3 (CSF3R) que estimula a colônia2. Fator estimulante de colônia 3 (CSF3), ou fator estimulador de colônias de granulócitos, demonstrou-se ativar a sinalização envolvendo a nicotinamida Fosforibosiltransferase (NAMPT)3,4. O NAMPT é uma enzima limitadora de taxa para a síntese de dinucleotídeo de nicotinamida adenina, que melhora a glicólise e regula o reparo do DNA, a expressão gênica e a resposta ao estresse promovendo a sobrevivência e proliferação de células cancerosas5. O NAMPT é superexpresso em vários tipos de câncer, incluindo câncer colorretal, ovariano, mama, gástrico, próstata e gliomas6. O NAMPT é essencial não só para as células tumorais, mas também para uma grande variedade de outros tipos de células que estão presentes em tumores, tais como células mielóides-que impulsiona a sua diferenciação4, inibe a apoptose e estimula a expressão de múltiplas citocinas ou enzimas degradantes da matriz em macrófagos7.

Os neutrófilos tumor-associados representam moduladores importantes do crescimento do tumor. As funções TAN são fortemente dependentes da disponibilidade do tipo I IFN, pois estas citocinas Prime a atividade antitumoral dos neutrófilos. Ao contrário, a ausência de ifns apoia a ativação tumorigênico destas pilhas, especial suas propriedades pro-Angiogenic. De acordo com isso, camundongos deficientes em ifns desenvolvem tumores vascularizados significativamente maiores e melhores, que são fortemente infiltrados com neutrófilos pró-tumorais/pró-angiogênicos1,2,8, 9,10. Importante, tais TANs pro-Angiogenic mostram a atividade elevada de NAMPT, sugerindo seu papel essencial na polarização do pro-tumor dos neutrófilos.

A depleção de neutrófilos usando Ly6G anticorpo ou inibição de sua migração (CXCR2 anticorpo) resulta em diminuição da angiogênese tumoral, crescimento e metástase1,8. Não obstante, os anticorpos monoclonais gerados são immunogenic, e sua administração é associada com uma escala de efeitos secundários life-threatening11. O tratamento com moléculas pequenas, tais como o inibidor FK866 de NAMPT, que modulam o tumoriogenicity do neutrófilo, poderia ajudar a evitar tais complicações. Infelizmente, a inibição sistemática farmacológica de NAMPT, ao lado de seu efeito terapêutico no crescimento do tumor, conduz aos efeitos secundários severos que incluem a toxicidade gastrintestinal e o thrombocytopenia. Portanto, a aplicação sistêmica de inibidores de NAMPT nãoé viável12,13,14.

Por esta razão, sugerimos aqui um protocolo onde a atividade de NAMPT é bloqueada diretamente em TANs isolados. Tais neutrófilos antitumorais são então transferidos adoptivamente em um hospedeiro de tumor-Bearing. Este protocolo ajudará a evitar efeitos colaterais tóxicos sistêmicos dos compostos, enquanto seu efeito sobre as células-alvo será sustentado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelas autoridades reguladoras: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) e Regierungspräsidium Tübingen, Alemanha. Todas as manipulações devem ser executadas em condições estéreis (sob a capa do fluxo laminar) usando reagentes e instrumentos estéreis (seringas, tesouras, fórceps, Scalpels descartáveis, pratos de Petri).

Nota: o esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1.

1. preparação da linha celular de melanoma B16F10

  1. Prepare células micoplasma-negativas cultivadas a uma monocamada confluente de 90% (aproximadamente 10 x 106 células/T75 balão) no meio de Dulbecco modificado de Iscove completo (imdmc: imdm + 10% de soro bovino FETAL (FBS) + 1% de penicilina-estreptomicina).
  2. Retire o meio, e enxague as células com tampão fosfato salina (PBS). Aplicar 6 mL de uma solução de descolamento celular contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas (ver a tabela de materiais) e incubar a 37 ° c por 2 min.
  3. Bata o balão suavemente para mobilizar as restantes células aderentes do fundo. Colete a suspensão celular em tubos de 15 mL e centrifugue a 300 x g durante 7 min e 20 ° c.
  4. Retire o sobrenadante, e ressuscitem bem o pellet em 1 mL de PBS. Adicionar 14 mL de PBS e centrifugar (300 x g e 20 ° c por 7 min).
  5. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet em 1 mL de PBS.
  6. Contar as células, e ressuscitem-los para a concentração de 3 x 106/ml PBS (para o passo 2) ou 6 x 106/ml PBS (para o passo 6) para a injeção. Mantenha as células no gelo por um máximo de 30 min.

2. modelo de tumor alogênico em camundongos

  1. Use 10 fêmeas Ifnar1-/- camundongos 8-12 semanas de idade que são mantidos específico-patógeno-livre (SPF) condições.
    Nota: camundongos fêmeas são preferíveis em um modelo subcutâneo de crescimento tumoral, uma vez que os machos são mais agressivos e, portanto, propensos a infrações do local do tumor, o que influencia o crescimento tumoral.
  2. Raspar a pele do rato no flanco com uma máquina de barbear eléctrica, e desinfectar a pele com tecido molhado com 70% de etanol.
  3. Colete as células de melanoma B16F10 preparadas em uma concentração de 3 x 106/ml de PBS (ver o passo 1) em uma seringa de 1 ml e 0,4 x 19 mm de agulha. Injete 100 mL da suspensão subcutaneamente.
    1. Misture bem as células antes de cada injeção. Use agulhas não inferiores a 0,4 mm de diâmetro para não perturbar as células tumorais.
  4. Coloque até 5 camundongos em uma gaiola, e controle o tamanho do tumor (comprimento, largura e profundidade) com um paquímetro para 14 dias.
    Nota: de acordo com a regulamentação animal, o tamanho do tumor não deve exceder 15 mm de diâmetro, camundongos com tumores maiores ou necróticos/abertos devem ser sacrificados de antemão.
  5. No dia 14, Sacrifique os ratos na câmara de CO2 .
  6. Desinfecte a pele com 70% de etanol e remova os tumores com tesouras e fórceps em uma placa de Petri estéril. Manter os tumores em um tubo de 50 mL em completo Dulbecco ' s modificado Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) no gelo.

3. isolamento TAN

  1. Coloque os tumores em placas estéreis de 6 poços, 5 tumores por poço. Corte tumores em pedaços de 2-3 mm com tesouras estéreis.
    1. Digerir com 1 mL de solução de Dispase/Collagenase D/DNase I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg em 1 mL de DMEMc) por tumor. Incubar a 37 ° c, 5% CO2 em uma incubadora úmida, e misture com uma seringa de 10 ml sem uma agulha cada 15 min 3 vezes.
  2. Para remover fibras não digeridas, as células de malha através de filtros de 100 μm em tubos de 15 mL (um poço por filtro por tubo). Adicione PBS a 15 mL, tubos de centrifugação a 460 x g, 4 ° c por 5 min e retire o sobrenadante.
  3. Eritrócitos de lyse com um tampão de lise (NH4CL 150 mm, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 ° c) adicionando 1 ml em cada tubo. Misture bem, e combine a solução de todos os tubos em um. Pare a reacção após 2 minutos com 11 mL de DMEMc de gelo frio (4 ° c).
  4. Centrifugador em 460 x g, 4 ° c por 5 minutos, e remova o sobrenadante. Ressuscita o pellet com 15 mL de PBS frio. Centrifugador em 460 x g, 4 ° c por 5 minutos, e remova o sobrenadante.
  5. Ressuscitem o pellet em 1 mL de PBS. Adicionar 3 mL de anticorpos FC-Block (CD16/CD32, Stock 0,5 mg/mL) e incubar no gelo durante 15 min.
  6. Adicionar anticorpos: 10 mL de Ly6G-PE (stock 0,2 mg/mL) e 10 mL de CD11b-APC (stock 0,2 mg/mL). Adicionar 20 mL de 6-Diamidin-2-phenylindol viabilidade corante (DAPI, estoque 5 mg/mL) e incubar no gelo na escuridão por 30 min.
    Nota: pode ser utilizada outra combinação de corantes de viabilidade e conjugados fluorescentes de anticorpos.
  7. Adicione PBS até 15 mL, centrifugue a 460 x g, 4 ° c por 5 min e retire o sobrenadante.
  8. Resuspend a pelota em DMEMc à concentração aproximadamente 10 x 106/ml, e mantenha no gelo.
  9. Ordenar CD11b+ Ly6GHi Alive (DAPI-negativo) neutrófilos com um classificador de células ativado por fluorescência (estratégia de gating ver Figura 2).
    Nota: manter o tubo com suspensão celular e o tubo com DMEMc para células classificadas a 4 ° c. Use as seguintes configurações de classificação ideais: um bocal de 70 mm, uma taxa de limiar de máximo de 22.000 eventos/segundo e uma taxa de fluxo de 1-3.
  10. Verifique a pureza dos neutrófilos classificados usando um citometro para uma pureza recomendada de > 95%.
  11. Centrífuga classificados neutrófilos em 460 x g, 4 ° c por 5 min, e retire o sobrenadante. Ressuscitem as células classificadas em DMEMc para a concentração de 1 x 106/ml.
    Nota: o número esperado de neutrófilos no tumor de 1 14 dias B16F10 (10 mm de diâmetro) é de aproximadamente 3 x 104 células.

4. inibição do NAMPT em TANs in vitro

  1. Prepare o estoque de FK866 (inibidor de NAMPT) em dimetilsulfóxido (DMSO) em uma concentração final de 100 mM.
  2. Sementes classificadas neutrófilos (passo 3,11) em 2 poços de um 96-poço U-placa inferior (1,5 x 105 neutrófilos/bem). Adicione FK866 na intervenção bem (concentração final de 100 nanômetro), e uma quantidade igual de DMEMc com DMSO no poço do controle. Incubar por 2 h a 37 ° c, 5% CO2 em uma incubadora úmida.
  3. Centrifugador em 460 x g, 4 ° c por 5 minutos, e remova o sobrenadante. Resuspend em 200 mL de PBS em cada poço. Repita 2 vezes.
  4. Centrifugador em 460 x g, 4 ° c por 5 minutos, e remova o sobrenadante. Ressuscição em meio comercial de crescimento celular endotelial (suplementado com 4 μL/mL de suplemento de crescimento de células endoteliais, 0,1 ng/mL fator de crescimento epidérmico humano recombinante, 1 ng/mL fator de crescimento básico humano recombinante de fibroblastos, 90 μg/mL de heparina e 1 μg/mL Hidrocortisona) a uma concentração final de 0,2 x 106 células/ml (em 0,75 ml) (para a etapa 5) ou em PBS à concentração final de 0,6 x 106 Cells/mL (em 0,25 ml) (para a etapa 6).

5. estimativa das propriedades angiogênicas de TANs utilizando o ensaio do anel aórtico

  1. Dissecar a aorta torácica de um rato C57BL/6J (WT) masculino. Limpe e corte em anéis da largura de 0,5 milímetros. Coloque todos os anéis em um poço de uma placa de 24 poços com 1 mL de meio de crescimento de células endoteliais suplementados. Incubar durante a noite em 37 ° c, 5% CO2 em uma incubadora úmida.
    Nota: o uso de camundongos machos jovens (menores de 8 semanas) para dissecção da aorta é preferível, uma vez que proporcionam uma resposta angiogênica mais robusta15.
  2. Encha os poços da placa plano-inferior 96-well com 50 μL da matriz solubilizado da membrana do porão, deixe o gel ajustado por 30 minutos em um ° c 37, incubadora úmida de 5% co2 para permitir que a matriz polimerize. Prepare pelo menos 3 poços por condição.
  3. Incorpore os anéis na matriz solubilizada da membrana do porão coloc um anel aórtico na parte superior da camada contínua da matriz, 1 anel no centro de cada poço. Adicione outro 50 μL de matriz de membrana basal solubilizada para cobrir cada anel.
    1. Coloc a placa em um ° c 37, uma incubadora úmida de 5% CO2 por outros 30 minutos para permitir a polimerização da segunda camada da matriz.
  4. Adicionar 150 ml/poço de meio de crescimento de células endoteliais suplementados e 2x104Ifnar1-/- tans (controle e FK866-tratados) (etapa 4,4).
  5. Incubar a placa durante 14 dias a 37 ° c, 5% CO2 numa incubadora húmida.
  6. Imagem utilizando um microscópio de contraste de fase padrão e estimar a ramificação endotelial. A avaliação quantitativa dos parâmetros morfométricos e espaciais dos vasos, incluindo o índice de ramificação, pode ser realizada automaticamente por meio do programa de processamento de imagem projetado para imagens científicas.
    Nota: os resultados representativos são representados na Figura 3.

6. transferência adoptiva de neutrófilos tratados no modelo de tumor alogênico

  1. Prepare células de melanoma B16F10 (passo 1,6) em PBS a uma concentração de 6 x 106 células/ml.
  2. Preparar 2 tipos de neutrófilos: neutrófilos tratados com FK866 e controlar neutrófilos não tratados (passo 4,4) em PBS a uma concentração de 6 x 105 células/ml. Misture neutrófilos com células de melanoma B16F10 (o neutrófilo final à relação de células tumorais 1:10) para ter 2 tipos de misturas de células.
  3. Tome 10 ratos femininos WT 8-12 semanas de idade, 5 em cada grupo. Depilar a pele no flanco com uma máquina de barbear eléctrica e desinfete com 70% de etanol.
  4. Injete 100 μL da suspensão celular (passo 6,2) por via subcutânea com uma seringa de insulina e uma agulha de 0,4 mm de diâmetro, para ambos os grupos de camundongos. Coloque 1-5 camundongos do mesmo grupo em uma gaiola.
  5. No dia 2, prepare 2 tipos de neutrófilos: neutrófilos tratados com FK866 e controle neutrófilos não tratados (etapa 4,4) em PBS em uma concentração 6 x 105 células/ml. Injete 100 μL de suspensão celular (passo 6,4) i.v. na veia cauda com uma seringa de insulina e uma agulha de 0,4 mm de diâmetro, para ambos os grupos de camundongos. Coloque os ratos de volta na gaiola.

7. medição do crescimento tumoral, exame histológico

  1. Monitore o crescimento do tumor todos os dias. Avaliar o tamanho do tumor com pinças e calcular o volume tumoral com a fórmula V = 4/3 * π * (h * w2)/8 (h = altura, w = largura, profundidade = largura).
  2. Sacrifique ratos no dia 14 na câmara de CO2 . Retire os tumores e meça os pesos tumorais.
  3. Congele os tumores no composto de temperatura de corte ideal em nitrogênio líquido e armazene a-80 ° c.
  4. Descongele as amostras a-20 ° c e prepare seções de 5 milímetros usando um cryotome. Deixe os criocuts secos por 30 min a 20 ° c. Fixe as secções em-20 ° c de acetona fria durante 2 min e deixe-as secar durante 30 min a 20 ° c.
  5. Bloco com anticorpos FC-Block (CD16/CD32, estoque 0,5 mg/mL 1:500) em PBS por 1 h a 20 ° c.
  6. Mancha com anti rato do coelho laminin Gamma anticorpo (1:1500 em PBS, 200 μL) para 1 h a 20 ° c. Lave com PBS três vezes.
  7. Mancha com o anticorpo secundário do anti-coelho da cabra (estoque 0,5 mg/mL, 1:400 em PBS,), αSMA do rato (1:500 em PBS) e 2 μL de DAPI (estoque 5 mg/mL, 1:100 em PBS) em um volume final de 200 μL da solução do anticorpo. Incubar por 1 h a 20 ° c na escuridão. Lave com PBS três vezes.
  8. Lâminas secas por 20 minutos a 20 ° c na escuridão. Montagem com meio de montagem anidro para microscopia e cobertura com uma lamínula. Deixe secar 1 h em 37 ° c.
  9. Realizar exame microscópico. Quantificar a vascularização contando o número total (opcionalmente área) de laminin+ vasos e o número (área) de embarcações desenvolvidas pela sma+ .
    Nota: para executar a análise de imagem, tire todas as imagens nas mesmas condições (luz, contraste, ampliação). Nesse caso, os parâmetros de processamento são fixos e o processamento de imagens torna-se completamente automático. Os resultados representativos são representados na Figura 4 e na Figura 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando o procedimento descrito aqui, Ifnar1-/- os neutrófilos foram isolados dos tumores e tratados com o inibidor de NAMPT FK866 para 2 h. Ifnar1-/- neutrófilos não tratados foram usados como um controle. A efetividade do tratamento foi avaliada por meio do ensaio do anel aórtico, que reflete os principais passos envolvidos na angiogênese (degradação matricial, migração, proliferação, reorganização). Pudemos demonstrar que os neutrófilos tratados com FK866 têm uma capacidade significativamente diminuída para estimular a formação do ramo aórtico, em comparação com as células não tratadas (Figura 3a, 3B). Os neutrófilos antiangiogénicos FK866-tratados foram injetados por via subcutânea em ratos tumor-tendo (no flanco do dia 0 e no dia 2 i.v.). Observamos comprometimento significativo do crescimento tumoral, em comparação aos camundongos injetados com Ifnar1-/- neutrófilos não tratados (figura 4a, 4b). A examinação histológica dos tumores extraídos provou a supressão significativa da angiogênese nos tumores isolados dos ratos tratados com os tans FK866-tratados, em comparação àqueles injetados com Ifnar1-/- neutrófilos não tratados ( Figura 5a , B).

Figure 1
Figura 1. O esquema do protocolo. Passo 1. Preparação da linha celular de melanoma B16F10; 2. modelo de tumor alogênico em camundongos; 3. isolamento de TANs dos tumores; 4. inibição da NAMPT em TANs in vitro; 5. estimativa de propriedades angiogênicas de TANs no ensaio do anel aórtico; 6. transferência adoptiva de neutrófilos tratados no modelo de tumor alogênico; 7. monitorização do crescimento tumoral, exame histológico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Estratégia de gating para a classificação de TANs. Os neutrófilos vivos de CD11b+ Ly6G são classificados dos tumores com a pureza ≥ 95%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Supressão de propriedades angiogénicas de TANs após o tratamento de FK866. As propriedades angiogênicas de Ifnar1-/-tans classificadas tratadas com FK866 ou com meio foram estimadas utilizando-se o teste do anel da aorta. A formação de ramo foi monitorada durante 14 dias, os resultados representativos no dia 14 são apresentados (a). O tratamento com FK866 diminuiu significativamente o número de ramos endoteliais (B). Os dados são mostrados como mediana, intervalo interquartil e mín-máx, * p < 0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Retardação do crescimento do tumor após a transferência adoptiva de neutrófilos FK866-tratados. A influência de TANs no crescimento do tumor foi avaliada. Os TANs foram isolados, tratados com o FK866 e injetados em ratos tumor-tendo como descrito acima. No dia 14 camundongos foram sacrificados, tumores removidos e analisados. Ifnar1-/- Os TANs tratados com FK866 versus controles foram comparados. (A) o crescimento tumoral foi medido, (B) a massa tumoral e o tamanho (C) foram estimados. Os dados são mostrados como mediana, intervalo interquartil e mín-máx, * p < 0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Vascularização suprimido do tumor após a transferência adoptiva de neutrófilos FK866-treated. Os tumores foram isolados como descrito acima (Fig. 4). A maturação dos vasos foi avaliada utilizando-se anticorpos anti-SMA (vasos maduros) e laminina antigama (células endoteliais). (A) acoloração representativa dos tumores é mostrada: sma (verde), laminina (vermelha). Barras de escala: 50 μm. (B) quantificação da vascularização tumoral após transferência adotiva de tans cultivadas com FK866 (verde) ou médio (vermelho) os dados são mostrados como mediana, intervalo interquartil e mín-máx, * p < 0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Apesar do progresso no tratamento cirúrgico e farmacológico do cancro, a terapia bem sucedida permanece um desafio. Desde que as pilhas imunes são sabidas para jogar um papel importante na regulação do crescimento do tumor, os métodos novos que inibe o tumorigenicidade de tais pilhas devem ser estabelecidos. Aqui nós demonstramos uma aproximação nova para suprimir o crescimento do tumor através da transferência adoptiva de neutrófilos tumor-associados antiangiogénicos. A segmentação seletiva da sinalização pro-angiogênica de NAMPT em TANs, usando o inibidor de FK866, impede efeitos secundários, que são observados em cima do tratamento FK866 sistemático.

A parte mais crítica do protocolo é a necessidade de usar neutrófilos primários recém-isolados. Os neutrófilos são células de vida curta, submetidas à apoptose ou ativadas durante o procedimento de isolamento. Os neutrófilos murinos devem ser mantidos em suportes de 4 ° c durante todas as etapas de isolamento, incluindo a triagem celular. A isolação dos neutrófilos deve ser executada o mais cedo possível e o experimento não deve ser pausado. O uso do bloco de FC permite reduzir a coloração inespecífica das células com alta expressão do receptor FC, como as células NK. Também recomendamos minimizar o número de anticorpos conjugados fluorescentes para simplificar a estratégia de gating e evitar a ativação de neutrófilos devido à ligação de anticorpos.

A etapa limitante do protocolo é a isolação de neutrófilos vivos dos tumores devido a uma quantidade relativamente baixa destas pilhas nos tumores (não mais de 1% de únicas pilhas vivas no melanoma). Isso só poderia ser possível usando a classificação baseada em citometria de fluxo. Ao mesmo tempo, o uso de neutrófilos sanguíneos para este protocolo deve ser evitado devido à única regulação menor da expressão de NAMPT e sua baixa funcionalidade, que é alterada após a chegada do tecido tumoral16. Possivelmente, a fim de usar neutrófilos sanguíneos, eles devem ser previamente ativados usando fatores de crescimento derivados do tumor.

Para evitar a apoptose do neutrófilo, o tratamento curto com FK866 (2-4 h) é sugerido, porque não tem nenhuma influência na viabilidade de tans, quando o tratamento prolongado induz o apoptose16do neutrófilo. Em suma, o protocolo demonstra o potencial de neutrófilos antiangiogênicos ex-vitro manipulados para suprimir funcionalmente o crescimento tumoral no modelo tumoral de melanoma de camundongo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O nosso trabalho foi apoiado por subvenções da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e do Conselho alemão de investigação (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120, (4), 1151-1164 (2010).
  2. Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
  3. Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
  4. Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
  5. Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
  6. Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
  7. Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
  8. Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
  9. Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
  10. Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
  11. Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9, (4), 325-338 (2010).
  12. Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
  13. Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
  14. von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
  15. De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4, (5), (2013).
  16. Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144, (1), 136-149 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics