Överföring av manipulerade tumörassocierade neutrofiler till Tumörbärande möss för att studera deras angiogena potential in vivo

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här visar vi terapeutisk potential av anti-angiogena tumör-associerade neutrofiler efter deras överföring till tumör-bärande möss. Detta protokoll kan användas för att manipulera neutrofila aktivitet ex vivo och för att därefter utvärdera deras funktionalitet in vivo i att utveckla tumörer. Det är en lämplig modell för att studera potentiella neutrofila-baserade immunoterapier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bidraget av neutrofiler till regleringen av uppkomst blir ökad uppmärksamhet. Dessa celler är heterogena, och beroende på tumör miljö kan inneha Pro-eller anti-tumör kapacitet. En av de viktiga cytokiner reglerar neutrofila funktioner i en tumör sammanhang är typ I interferoner. I närvaro av interferoner, neutrofiler få anti-tumör egenskaper, inklusive cytotoxicitet eller stimulering av immunförsvaret. Omvänt, avsaknaden av ett interferon signalering resulterar i framstående Pro-tumöraktivitet, kännetecknas med stark stimulering av tumör angiogenes. Nyligen, vi kunde visa att Pro-angiogena egenskaper av neutrofiler beror på aktiveringen av nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalering väg i dessa celler. Hämning av denna väg i tumörassocierade neutrofiler leder till deras potenta antiangiogen fenotyp. Här visar vi vår nyinrättade modell möjliggör in vivo utvärdering av tumörframkallande potential av manipulerade tumör-associerade neutrofiler (TANs). Inom kort kan Pro-angiogena tumörassocierade neutrofiler isoleras från tumör-bärande interferon-bristfällig möss och repolarized till anti-angiogen fenotyp genom blockering av NAMPT-signalering. Den angiogena aktiviteten av dessa celler kan därefter utvärderas med hjälp av en aorta ring assay. Anti-angiogena TANs kan överföras till tumör-bärande Wild typ mottagare och tumörtillväxt bör övervakas för 14 dagar. På dag 14 är möss offras, borttagna tumörer och snitt med deras vaskularisering bedömt. Sammantaget ger vårt protokoll ett nytt verktyg för att in vivo utvärdera angiogen kapacitet av primära celler, såsom tumör-associerade neutrofiler, utan ett behov av att använda konstgjorda neutrofila cell linje modeller. Vc

Introduction

Typ I interferoner (IFNs) spelar en viktig roll i stimulering av värd svar på neoplasias, eftersom avsaknaden av typ I IFN-signalering resulterar i signifikant förhöjd tumörtillväxt1. En av de mekanismer som är involverade i denna process är regleringen av tumörframkallande aktivitet av tumör-associerade neutrofiler, som styrs av kolonin-stimulerande faktor 3-receptorn (CSF3R) nedströms signalering2. Kolonistimulerande faktor 3 (CSF3), eller granulocytkolonistimulerande faktor, visades aktivera signalering som involverar nikotinamid-fosforbosyltransferas (nampt)3,4. NAMPT är en hastighetsbegränsande enzym för nikotinamid adenin dinukleotid syntes, som förbättrar glykolys och reglerar DNA-reparation, genuttryck, och stress svar främja cancerceller överlevnad och proliferation5. Nampt är överuttryckt i flera cancertyper, inklusive kolorektal, äggstockscancer, bröst, mag-, prostata-och gliom6. NAMPT är viktigt inte bara för tumörceller, men också för en mängd andra celltyper som finns i tumörer, såsom myeloida celler-det driver sin differentiering4, hämmar apoptos och stimulera uttrycket av flera cytokiner eller Matrix-nedbrytande enzymer i makrofager7.

Tumör-associerade neutrofiler representerar viktiga modulatorer av tumörtillväxt. TAN funktioner är starkt beroende av typ I IFN tillgänglighet, eftersom dessa cytokiner Prime anti-tumör aktivitet av neutrofiler. Tvärtom, avsaknaden av ifns stöder tumörframkallande aktivering av dessa celler, särskilt deras Pro-angiogena egenskaper. I samförstånd med detta, möss bristfällig i ifns utveckla betydligt större och bättre vaskulariserad tumörer, som är starkt infiltrerade med Pro-tumoral/Pro-angiogena neutrofiler1,2,8, 9,10. Viktigare, sådana Pro-angiogena TANs visar förhöjd aktivitet av NAMPT, vilket tyder på dess väsentliga roll i Pro-tumörpolarisering av neutrofiler.

Utarmning av neutrofiler med Ly6G antikropp eller hämning av deras migration (CXCR2 antikropp) resulterar i minskad tumör angiogenes, tillväxt,och metastaser1,8. Icke desto mindre, genererade monoklonala antikroppar är immunogena, och deras administration är associerad med en rad livshotande biverkningar11. Behandling med små molekyler, såsom NAMPT-hämmare FK866, som modulera neutrofila tumoriogenicitet, kan bidra till att undvika sådana komplikationer. Tyvärr, farmakologisk systemisk hämning av NAMPT, bredvid dess terapeutiska effekt på tumörtillväxt, leder till allvarliga biverkningar inklusive gastrointestinal toxicitet och trombocytopeni. Därför är den systemiska tillämpningen av nampt-hämmare inte möjlig12,13,14.

Av denna anledning föreslår vi här ett protokoll där NAMPT aktivitet blockeras direkt i isolerade TANs. Sådana anti-tumör neutrofiler är sedan adoptiv överföras till en tumör-bärande värd. Detta protokoll kommer att bidra till att undvika systemiska toxiska bieffekter av föreningarna, medan dess effekt på målcellerna kommer att upprätthållas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av tillsynsmyndigheterna: LANUV (Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) och Regierungspräsidium Tübingen, Tyskland. Alla manipulationer bör utföras i sterila förhållanden (under laminärt flöde huva) med hjälp av sterila reagenser och instrument (sprutor, sax, tång, engångsskalpeller, petriskålar).

Obs: protokollets övergripande schema visas i figur 1.

1. beredning av B16F10 melanom cell linje

  1. Förbered Mycoplasma-negativa celler som odlas till en 90% konfluenta enskiktslager (cirka 10 x 106 celler/T75 kolv) i komplett Iscove ' s modifierade Dulbecco ' s medium (imdmc: imdm + 10% fetal Nötkreatur serum (FBS) + 1% penicillin-streptomycin).
  2. Ta bort mediet och skölj cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Applicera 6 mL av en cell avskiljande lösning som innehåller proteolytiska och kollagenolytiska enzymer (se tabellen av material), och inkubera vid 37 ° c i 2 min.
  3. Knacka kolven försiktigt för att mobilisera kvarvarande anhängare celler från botten. Samla upp cellsuspensionen i 15 mL-rör och centrifugera vid 300 x g i 7 min och 20 ° c.
  4. Ta bort supernatanten och Omsuspendera pelleten väl i 1 mL PBS. Tillsätt 14 mL PBS och centrifugera (300 x g och 20 ° c i 7 min).
  5. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1 mL PBS.
  6. Räkna cellerna och Omsuspendera dem till koncentrationen av 3 x 106/ml PBS (för steg 2) eller 6 x 106/ml PBS (för steg 6) för injektion. Håll celler på is i högst 30 min.

2. allogena tumör modell hos möss

  1. Använd 10 kvinnliga Ifnar1-/- möss 8-12 veckor gamla som hålls under specifika-patogen-fria (SPF) villkor.
    Obs: kvinnliga möss är att föredra i en subkutan modell av tumörtillväxt, eftersom män är mer aggressiva och därmed benägna att infraktioner av tumören webbplats, som påverkar tumörtillväxt.
  2. Raka huden på musen på flanken med en elektrisk rakapparat, och desinficera huden med vävnad våt med 70% etanol.
  3. Samla upp de beredda B16F10 melanom cellerna vid en koncentration av 3 x 106/ml PBS (se steg 1) i en 1 ml spruta och 0,4 x 19 mm nål. Injicera 100 mL av suspensionen subkutant.
    1. Blanda cellerna väl före varje injektion. Använd nålar inte mindre än 0,4 mm i diameter för att inte störa tumörceller.
  4. Placera upp till 5 möss i en bur, och kontrollera tumörstorlek (längd, bredd och djup) med en bromskorn i 14 dagar.
    Obs: enligt djur föreskrifter, bör tumörens storlek inte överstiga 15 mm i diameter, möss med större eller nekrotiska/öppna tumörer bör offras i förväg.
  5. Dag 14, offra mössen i CO2 kammare.
  6. Desinficera huden med 70% etanol och ta bort tumörer med sax och pinps i en steril petriskål. Håll tumörer i en 50 mL tub i komplett Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin) på is.

3. TAN isolering

  1. Placera tumörer i sterila 6-well tallrikar, 5 tumörer per brunn. Skär tumörer i 2-3 mm bitar med steril sax.
    1. Smälta med 1 mL av dispase/kollagenase D/DNase i lösning (0,2 mg/0,2 mg/100 mg i 1 mL DMEMc) per tumör. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator och blanda med en 10 ml spruta utan nål var 15: de minut 3 gånger.
  2. För att avlägsna osmälta fibrer, mesh celler genom 100 μm filter i 15 mL rör (en brunn per filter per tub). Tillsätt PBS till 15 mL, Centrifugera rören vid 460 x g, 4 ° c i 5 min, och ta bort supernatanten.
  3. Lyse erytrocyter med en lysis buffert (NH4cl 150 mm, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 ° c) genom att tillsätta 1 ml i varje tub. Blanda väl, och kombinera lösningen från alla rör till en. Stoppa reaktionen efter 2 minuter med 11 mL iskall (4 ° c) DMEMc.
  4. Centrifugera vid 460 x g, 4 ° c i 5 min och ta bort supernatanten. Omsuspendera pelleten med 15 mL kallt PBS. Centrifugera vid 460 x g, 4 ° c i 5 min och ta bort supernatanten.
  5. Omsuspendera pelleten i 1 mL PBS. Tillsätt 3 mL FC-block antikroppar (CD16/CD32, lager 0,5 mg/mL), och inkubera på is i 15 min.
  6. Tillsätt antikroppar: 10 mL Ly6G-PE (lager 0,2 mg/mL) och 10 mL CD11b-APC (lager 0,2 mg/mL). Tillsätt 20 mL 6-diamidin-2-fenylindol livskraft färg (DAPI, lager 5 mg/mL) och inkubera på is i mörker i 30 min.
    Anmärkning: en annan kombination av livskraft färger och fluorescerande konjugat av antikroppar kan användas.
  7. Tillsätt PBS upp till 15 mL, Centrifugera vid 460 x g, 4 ° c i 5 min och ta bort supernatanten.
  8. Omsuspendera pelleten i DMEMc till koncentrationen cirka 10 x 106/ml, och håll på isen.
  9. Sortera CD11b+ Ly6GHi Alive (DAPI-negativ) neutrofiler med en fluorescensaktiverad cell sorterare (gating Strategy se figur 2).
    Obs: Håll röret med cellsuspension och röret med DMEMc för sorterade celler vid 4 ° c. Använd följande optimala sorteringsinställningar: ett 70 mm munstycke, en tröskel frekvens på maximalt 22 000 händelser/sekund och en flödeshastighet på 1-3.
  10. Kontrollera renheten hos de sorterade neutrofilerna med hjälp av en flödescytometerns för en rekommenderad renhetsgrad på > 95%.
  11. Centrifugera sorterade neutrofiler vid 460 x g, 4 ° c i 5 min, och ta bort supernatanten. Omsuspendera de sorterade cellerna i DMEMc till koncentrationen 1 x 106/ml.
    Anmärkning: det förväntade antalet neutrofiler i 1 14-Day B16F10 tumör (10 mm diameter) är cirka 3 x 104 celler.

4. NAMPT-hämning i TANs in vitro

  1. Bered FK866 (NAMPT-hämmare) i dimetylsulfoxid (DMSO) vid en slutkoncentration på 100 mM.
  2. Utsäde sorterade neutrofiler (steg 3,11) i 2 brunnar av en 96-väl U-bottenplattan (1,5 x 105 neutrofiler/brunn). Tillsätt FK866 i interventionen väl (slutlig koncentration av 100 nM), och en lika stor mängd DMEMc med DMSO i kontrollen väl. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
  3. Centrifugera vid 460 x g, 4 ° c i 5 min och ta bort supernatanten. Omsuspenderas i 200 mL PBS i varje brunn. Upprepa 2 gånger.
  4. Centrifugera vid 460 x g, 4 ° c i 5 min och ta bort supernatanten. Omsuspendera i kommersiella endotelceller tillväxtmedium (kompletteras med 4 μL/mL endotelial tillväxt tillägg, 0,1 ng/mL rekombinant human Epidermal tillväxtfaktor, 1 ng/mL rekombinant human grundläggande fibroblasttillväxtfaktor, 90 μg/mL heparin och 1 μg/mL hydrokortison) till en slutlig koncentration av 0,2 x 106 celler/ml (i 0,75 ml) (för steg 5) eller i PBS till den slutliga koncentrationen av 0,6 x 106 celler/mL (i 0,25 ml) (för steg 6).

5. uppskattning av angiogena egenskaper av TANs med hjälp av aorta ringen analysen

  1. Dissekera bröstkorg aorta från en manlig C57BL/6J (WT) mus. Rengör och skär i 0,5 mm bredd ringar. Placera alla ringar i en brunn av en 24-brunn tallrik med 1 ml av kompletterat endotelceller celltillväxt medium. Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
    Obs: användning av unga (yngre än 8 veckor) hanmöss för aortadissektion är att föredra, eftersom de ger en mer robust angiogen respons15.
  2. Fyll brunnarna i 96-väl platt bottenplattan med 50 μL av solubilized basalmembran matris, låt gelen i 30 min i en 37 ° c, 5% CO2 fuktig inkubator att matrisen att polymerisera. Förbered minst 3 brunnar per skick.
  3. Bädda in ringarna i solubilized basalmembran matris genom att placera en aorta ring på toppen av den solida matris skikt, 1 ring i mitten av varje brunn. Tillsätt ytterligare 50 μL solubilized basalmembran matris för att täcka varje ring.
    1. Placera plattan i en 37 ° c, 5% CO2 fuktig inkubator för ytterligare 30 min för att möjliggöra polymerisation av det andra Matrix skiktet.
  4. Tillsätt 150 ml/brunn av kompletterat endotelcell tillväxtmedium och 2x104Ifnar1-/- TANs (kontroll och FK866-behandlad) (steg 4,4).
  5. Inkubera plattan i 14 dagar vid 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
  6. Bild med hjälp av ett standard faskontrastmikroskop och uppskatta endotelial förgrening. Kvantitativ bedömning av fartygs morphometriska och rumsliga parametrar inklusive förgrenade index kan utföras automatiskt med hjälp av bildbehandlings programmet utformat för vetenskapliga bilder.
    Anmärkning: representativa resultat avbildas i figur 3.

6. adoptiv överföring av behandlade neutrofiler i den allogena tumör modellen

  1. Förbered B16F10 melanomceller (steg 1,6) i PBS vid en koncentration av 6 x 106 celler/ml.
  2. Förbered 2 typer av neutrofiler: FK866-behandlade neutrofiler och kontrollera obehandlade neutrofiler (steg 4,4) i PBS vid en koncentration 6 x 105 celler/ml. Blanda neutrofiler med B16F10 melanomceller (den sista neutrofila till tumörceller ratio 1:10) att ha 2 typer av cell blandningar.
  3. Ta 10 kvinnliga WT möss 8-12 veckor gammal, 5 i varje grupp. Raka huden på flanken med en elektrisk rakapparat, och desinficera med 70% etanol.
  4. Injicera 100 μL av cellsuspensionen (steg 6,2) subkutant med en insulinspruta och en nål på 0,4 mm diameter, till båda grupperna av möss. Placera 1-5 möss från samma grupp i en bur.
  5. Vid dag 2, Förbered 2 typer av neutrofiler: FK866-behandlade neutrofiler och kontrollera obehandlade neutrofiler (steg 4,4) i PBS vid en koncentration 6 x 105 celler/ml. Injicera 100 μL cellsuspension (steg 6,4) i.v. i svans venen med en insulinspruta och en nål på 0,4 mm diameter, till båda grupperna av möss. Placera möss tillbaka till buren.

7. tumörtillväxt mätning, Histologisk undersökning

  1. Övervaka tumörtillväxt varannan dag. Utvärdera tumörstorlek med bromsok och beräkna tumör volym med formeln V = 4/3 * π * (h * b2)/8 (h = höjd, w = bredd, djup = bredd).
  2. Offra möss på dag 14 i CO2 -kammaren. Ta bort tumörer och mäta tumör vikter.
  3. Frys tumörer i optimal skärtemperatur förening i flytande kväve, och förvara vid-80 ° c.
  4. Tina proverna till-20 ° c och Förbered 5 mm sektioner med en kryotome. Låt kryocuts torka i 30 min vid 20 ° c. Fixera sektionerna i-20 ° c kallt aceton i 2 min och låt dem torka i 30 min vid 20 ° c.
  5. Block med FC-block antikroppar (CD16/CD32, lager 0,5 mg/mL 1:500) i PBS för 1 h vid 20 ° c.
  6. Fläcken med kanin anti mus laminin gamma antikropp (1:1500 i PBS, 200 μL) för 1 h vid 20 ° c. Tvätta med PBS tre gånger.
  7. Fläcken med sekundär get anti-kanin antikropp (lager 0,5 mg/mL, 1:400 i PBS,), anti-mus αSMA (1:500 i PBS) och 2 μL av DAPI (lager 5 mg/mL, 1:100 i PBS) i en slutlig volym av 200 μL av antikropps lösning. Inkubera i 1 h vid 20 ° c i mörker. Tvätta med PBS tre gånger.
  8. Torra glas i 20 minuter vid 20 ° c i mörker. Montera med vattenfritt monteringsmedium för mikroskopi och täck med en täckslip. Låt den torka 1 h i 37 ° c.
  9. Utföra mikroskopisk undersökning. Kvantifiera vaskularisering genom att räkna det totala antalet (valfritt område) av laminin+ fartyg och antalet (område) av SMA+ utvecklade fartyg.
    Anmärkning: för att utföra bildanalys, ta alla bilder under samma förhållanden (ljus, kontrast, förstoring). I det här fallet är bearbetningsparametrarna fasta och bild bearbetningen blir helt automatisk. Representativa resultat avbildas i figur 4 och figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av det förfarande som beskrivs här, Ifnar1-/- neutrofiler isolerades från tumörer och behandlades med nampt inhibitor FK866 för 2 h. obehandlad Ifnar1-/- neutrofiler användes som kontroll. Effektiviteten av behandlingen utvärderades med hjälp av aorta ringen analysen, som återspeglar de viktigaste stegen i angiogenes (Matrix nedbrytning, migration, proliferation, omorganisation). Vi kan visa att FK866-behandlade neutrofiler har en signifikant minskad kapacitet att stimulera aorta gren bildning, jämfört med obehandlade celler (figur 3a, 3b). FK866-behandlade antiangiogena neutrofiler injicerades subkutant i tumör-bärande möss (dag 0 flank och dag 2 i.v.). Vi kunde konstatera signifikant försämrad tumörtillväxt, jämfört med möss injiceras med obehandlade Ifnar1-/- neutrofiler (figur 4a, 4b). Histologisk undersökning av de extraherade tumörerna visade signifikant dämpning av angiogenes i tumörer isolerade från möss behandlade med FK866-behandlade TANs, jämfört med de som injiceras med obehandlade Ifnar1-/- neutrofiler ( Figur 5a , B).

Figure 1
Figur 1. Systematiken i protokollet. Steg 1. Beredning av B16F10 melanom cell linje; 2. allogena tumör modell hos möss; 3. isolering av TANs från tumörer; 4. hämning av NAMPT i TANs in vitro; 5. uppskattning av angiogena egenskaper av TANs i aorta ringen analysen; 6. adoptiv överföring av behandlade neutrofiler i den allogena tumör modellen. 7. tumörtillväxt övervakning, Histologisk undersökning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Gating strategi för TANs sortering. CD11b+ Ly6GHi Alive neutrofiler sorteras från tumörer med renhet ≥ 95%. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Hämning av angiogena egenskaper hos TANs efter FK866 behandling. Angiogena egenskaper sorterade Ifnar1-/-TANs behandlas med FK866 eller med medium beräknades med hjälp av aorta ring assay. Gren bildning övervakades under 14 dagar, representativa resultat på dag 14 presenteras (a). Behandling med FK866 minskade signifikant antalet endoteliala grenar (B). Data visas som median, interkvartilintervall Range och min-max, * p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Retardation av tumörtillväxt efter adoptiv överföring av FK866-behandlade neutrofiler. Påverkan av TANs på tumörtillväxt bedömdes. TANs isolerades, behandlades med FK866 och injiceras i tumör-bärande möss som beskrivs ovan. På dag 14 möss offrades, tumörer bort och analyseras. Ifnar1-/- Som behandlades med FK866 jämfört med kontrollerna jämfördes. (A) tumörtillväxt mättes, (B) tumör massa och (C) storlek beräknades. Data visas som median, interkvartilintervall Range och min-max, * p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Undertryckt tumör vaskularisering efter adoptiv överföring av FK866-behandlade neutrofiler. Tumörer isolerades enligt beskrivningen ovan (Fig 4). Fartygets mognad bedömdes med anti-SMA antikroppar (mogna fartyg) och anti-gamma laminin (endotelceller). (A) representativ färgning av tumörer visas: SMA (grön), laminin (röd). Skalstreck: 50 μm. (B) kvantifiering av tumör vaskularisering efter adoptiv överföring av TANs odlas med FK866 (grön) eller medel (röd) data visas som median, interkvartilintervall Range och min-max, * p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots framstegen inom kirurgisk och farmakologisk cancerbehandling är framgångsrik behandling en utmaning. Eftersom immunceller är kända för att spela en viktig roll i regleringen av tumörtillväxt, nya metoder som hämmar tumorigenicitet av sådana celler bör fastställas. Här visar vi en ny metod för att undertrycka tumörtillväxt via adoptiv överföring av anti-angiogena tumör-associerade neutrofiler. Selektiv inriktning av Pro-angiogena NAMPT signalering i TANs, med FK866 hämmare, förhindrar biverkningar, som observeras vid systemisk FK866 behandling.

Den mest kritiska delen av protokollet är behovet av att använda nyligen isolerade primära neutrofiler. Neutrofiler är kort levande celler, genomgår apoptos eller aktiveras under förfarandet för isolering. Murina neutrofiler bör förvaras i 4 ° c media under alla steg av isolering, inklusive cell sortering. Isolering av neutrofiler bör utföras så snart som möjligt och försöket bör inte pausas. Användning av FC-block kan minska ospecifik färgning av cellerna med hög FC-receptorn uttryck, som NK-celler. Vi rekommenderar också att minimera antalet fluorescerande-konjugerade antikroppar för att förenkla den gating strategi och för att undvika aktivering av neutrofiler på grund av antikroppsbindning.

Det begränsande steget i protokollet är isoleringen av levande neutrofiler från tumörer på grund av en relativt låg mängd av dessa celler i tumörer (inte mer än 1% av enstaka levande celler i melanom). Detta kan bara vara möjligt med flödescytometri-baserad sortering. Samtidigt bör användningen av blod neutrofiler för detta protokoll undvikas på grund av endast mindre reglering av NAMPT uttryck och deras låga funktionalitet, som ändras vid tumör vävnad ankomst16. Möjligen, för att använda blod neutrofiler, de bör aktiveras tidigare med hjälp av tumör-derived tillväxtfaktorer.

För att undvika neutrofila apoptos, kort behandling med FK866 (2-4 h) föreslås, eftersom det har ingen inverkan på lönsamheten av TANs, medan långvarig behandling inducerar neutrofila apoptos16. Sammanfattningsvis, protokollet visar potentialen av ex vitro-manipulerade antiangiogena neutrofiler till funktionellt undertrycka tumörtillväxt i mus melanom tumör modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vårt arbete stöddes av bidrag från Deutsche Krebshilfe, bidrags nummer: 111647, och tyska forskningsrådet (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120, (4), 1151-1164 (2010).
  2. Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
  3. Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
  4. Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
  5. Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
  6. Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
  7. Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
  8. Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
  9. Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
  10. Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
  11. Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9, (4), 325-338 (2010).
  12. Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
  13. Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
  14. von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
  15. De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4, (5), (2013).
  16. Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144, (1), 136-149 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics