オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Neuroscience

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Summary

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5 IslMN:GFP胚をアガロースに埋め込み、ビブラートームをスライスし、ステージトップインキュベーターで成長することによって生成されます。軸ゾン誘導経路の役割は、培養培養培養物に阻害剤を添加することによって評価される。

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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Abstract

正確な眼の動きは視力にとって重要であるが、眼運動システム、特に軸ゴンガイダンスを制御する分子経路の開発は完全には解明されていない。これは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイの技術的な制限が原因の一部です。眼球運動神経に影響を与える追加の軸方向ガイダンスキューを同定するために、眼に向かって成長するにつれてリアルタイムで眼球運動神経を画像化するex vivoスライスアッセイが開発された。E10.5 IslMN-GFP胚は、アガロースに埋め込み、ビブラートにスライスし、24-72 hのタイムラプスフォト顕微鏡でそれらを成長させることによって、ex vivoスライスを生成するために使用されます。核から軌道への軸索の成長の生体内のタイミング。低分子阻害剤または組換えタンパク質を培養培養培養剤に添加し、異なる軸子誘導経路の役割を評価することができる。この方法は、成長する軸子を軸視するのではなく、軸が通過する局所的な微小環境の多くを維持し、その軌道に沿った複数のポイントで軸を評価するという利点があります。また、軸ゴンの特定のサブセットに対する影響を識別することもできます。例えば、CXCR4の阻害は、心室ではなく、中脳内の軸ゴンが依然として経体的に成長する原因となるが、既に心内から出ている軸ゴンは影響を受けない。

Introduction

眼モーターシステムは軸の指導メカニズムを調査するための優雅なシステムを提供する。眼を動かす6つの眼外筋肉(EOEM)を抑える3つの頭蓋神経と、まぶたを持ち上げるレベーター・パルペブラー・エクセピアス(LPS)からなる、比較的単純である。オキュロモーター神経は、LPSと4つのEOEMを刺激する - 劣った斜めと中間、劣った、および優れた直腸筋。他の2つの神経は、トロクレアとアブデューセン、それぞれ1つの筋肉、優れた斜めおよび横直腸筋をそれぞれインビナートする。目の動きは、内向きが適切であるか、欠落しているか、または異常であるかどうかを示す、容易な読み出しを提供します。さらに、神経発達または軸次指導の欠損に起因するヒト眼球運動障害があり、総称して先天性頭蓋骨減少障害(CCDDs)1と呼ぶ。

これらの利点にもかかわらず、眼モーターシステムは、アクソンガイダンス研究2、3、4、5、6、7、8ほとんど使用されない9,10、技術的な欠点のため。インビトロ軸ゴンガイダンスアッセイは、多くの欠点を有する 11.共培養アッセイは、ニューロン移植が標的組織12またはトランスフェクト細胞13の移植と共に培養されるもので、移植の対称性と移植組織と標的組織との間の正確な位置決めの両方に依存する。ストライプアッセイ14、15、交互のストライプに2つのキューが置かれ、軸が1つのストライプ上で優遇成長のために評価されるが、一方の基板が他方よりも好ましいことを示すだけで、どちらかが魅力的であるわけではないまたは反発的、または生理学的に関連する。マイクロ流体室は、正確な化学勾配を形成することができますが、被験者は、その成長に影響を与えることができる応力16、17、18をせん断する軸を成長させる。さらに、これらのアプローチのそれぞれにおいて、移植または解離細胞を採取するには、生育軸子が軸化され、したがって、これらのアッセイは、初期軸子の増殖ではなく、実際に軸の再生を調べる必要があります。最後に、これらのインビトロアプローチは、軸が軸に影響を与える微小環境を除去し、そのコースの異なるポイントに沿って手がかりに対する応答を除去し、従来は1つのキューを単独でテストするだけです。これらの欠点を複合化すると、眼モータシステム内の各核のサイズが小さいため、移植または解離培養物の解剖は技術的に困難になります。さらに、眼運動ニューロンの一次培養は、通常、不均一であり、有意な細胞死を有し、密度依存性であり、複数の胚からの細胞のプールを必要とする(藤木良樹、個人的なコミュニケーション)。しかし、ノックアウトマウスモデルを含む生体内法では、必要な時間と費用を考えると、スクリーニングに使用することは不適切です。

胚全体を培養するために開発された方法19は、移動細胞20または特定の分子の遮断の標識を可能にするが、胚培養全体は、標識のリアルタイムイメージングを妨げるローラーボトル内のインキュベーションを必要とする構造。胚の操作を可能にし、その後、子宮または母親の腹部のいずれかのさらなる発達を可能にする外科的技術(胎盤接続を維持する)22も可能であるが、これらはまた、時間経過を可能にしないイメージング。

インビトロアッセイの障害を克服し、シグナル伝達経路の迅速なスクリーニングを可能にするために、exvivo胚スライス培養技術が23を開発し、末梢神経の成長24に関する以前に公表されたプロトコルから適応した。このプロトコルを使用して、発達するオキュロモーター神経は、EOMターゲットを含む軌道に沿った周囲の構造の多くが存在する場合に、時間の経過とともに画像化することができる。培養培地に低分子阻害剤、成長因子、またはガイダンス手がかりを加えることで、軸ゾン軌道に沿った複数の点でガイダンス摂動を評価し、潜在的な成長因子とガイダンス因子をより迅速に評価することができます。

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Protocol

ここに記載されているすべての動物の仕事は、ボストン小児病院機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)プロトコルに従って承認され、実行されました。

1. 時当て交配

  1. 場所ISLMN:GFP (イズレット運動ニューロン緑蛍光タンパク質;MGI: J:132726;Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J ストック No: 017952オスとメスのマウスを一晩一緒に.雌の体重を計量し、交配する前に体重を記録する。
    注:ISL MN:GFPは、細胞傷害性ではない遠内酸GFPを有する運動ニューロンに特異的に標識し、運動ニューロンとその軸線の細胞膜に局所化し、開発25の間に神経を可視化することを可能にする。他の蛍光標識線も用いることができる。
  2. 早朝に膣プラグを確認してください。プラグが識別される日付は E0.5 として指定されます。
  3. E10.5で体重増加および/または超音波を使用して妊娠を確認します。妊娠中のダムは、E10.5で超音波で見ることができる少なくとも1 g.胚を得たはずです。

2. スライス培養用試薬とビブトームの調製

  1. スライスバッファーの500 mLを準備する:Ca2+およびMg2+なしでハンクのバランス塩溶液(HBSS)の500 mLにHEPESの5 mLおよびペニシリン/ストレプトマイシンの5mLを加える。 4 °Cに冷やす。
    注:余分なスライスバッファは4°Cで保存する必要があり、将来のスライス培養実験に使用することができます。
  2. 培養培地の50 mLを準備する:無菌フードで、HBSSの12.5 mL、胎児牛血清の12.5 mL、ブドウ糖の250 μL、L-グルタミンの250 μL、HEPESの125 μLを24.4 mLのフルオロブライトDMEMを追加します。(最終濃度:25%HBSS、25%FBS、0.5%グルコース、1mMグルタミン、および2.5 mM HEPES.を有するフローロブライトDMEM)。 無菌水浴で培養剤を37°Cに温めます。
    注:培養培地は4°Cで最大3週間保存できます。
    1. 無菌フードで、6ウェルプレートの各ウェルに1.5 mLの培養培地を追加します。 各ウェルに細胞培養インサート(材料表)を追加します。 無菌37°Cおよび5%CO2インキュベーターに入れなさい。
  3. 4%低融解温度アガロースを調製する:無菌PBSの50mLで低溶融温度アガロースの2gを溶解します。完全に溶解するまで30〜60秒間隔でマイクロ波。液体を保つために40°Cの水浴に置きます。
    注:余分なアガロースは室温(RT)で保存し、将来のスライス培養実験のために溶かすことができます。
  4. ビブラートームを設定する:ビブラートムに新しいブレードを配置します。チェック設定: 厚さ 400-450 μm. ビブラートステージを事前に冷やします。外側の部屋に氷を入れます。ライブスライス専用のチャンバーとステージを使用してください。残留固定剤がスライスに損傷を与える可能性があるとして、固定組織に同じビブラート室を使用しないでください。
  5. 顕微鏡ステージトップインキュベーターを37°Cおよび5%CO2に調調します。
  6. 解剖の準備:きれいな外科用器具および70%のエタノールとスプレー。HBSSで2つのペトリ皿を満たし、氷の上に置きます。12ウェル組織培養プレートを開き、下側を上にして氷の上に蓋を置きます。6ウェル組織培養プレートを開き、各ウェルに細胞培養膜インサートと1.5mL細胞培養培地を配置します。プレートを37°Cおよび5%CO2インキュベーターで予め温める。

3. E10.5胚の収穫とスライスの準備

注: この時点からのすべてのステップは、できるだけ早く行う必要があります。胚は常に氷の上に置いてください。

  1. CO2室で妊娠中のダム(E10.5)を安楽死させる。頸部脱臼を行う。
  2. 70%のエタノールで腹部をスプレーします。はさみで腹部を切り開き、子宮を取り除き、氷冷HBSSでペトリ皿に入れて、すぐに血液を洗い流します。洗った子宮を皿氷冷HBSSで満たされた第2のペトリに移動します。
  3. 解剖範囲の下で、子宮角および個々の角嚢から胚を取り除く。12ウェルプレートの蓋の下側に胚を置きます。氷の上にいろ
  4. 解剖範囲の下で、フィルターペーパーを使用して、各胚を取り巻く液体を除去する。
    注:胚は触れるとフィルターペーパーに付着します。
  5. アガロースに胚を埋め込む。それをカバーするために、各胚の上に溶かしたアガロースを注ぎます。氷の上にいろアガロースが硬化したら、各胚をひっくり返し、反対側に追加のアガロースを注ぎます。氷の上にいろ
  6. 蛍光解剖スコープを使用して、各胚の周りにアガロをトリミングし、ビブラートステージに接着したときに適切に配向されます。オキュロモータ核および初期軸索の成長は蛍光である。核、伸び軸索、目が線を形成するように胚を整列させ、この線に平行に切られたかみそり刃でアガロースをトリミングする(胚への背面、図1Aを参照)。
    注:これは、ビブラートの段階に接着された側になります(胚は、ビブレーターブレードに最も近い背中に配置されます)。眼球運動核と眼の間の線は、ビブラートムブレードと平行でなければなりません。
  7. 氷冷スライスバッファでビブラート室内を埋めます。胚をビブラート段階に重ね、ブレードが眼核と目と平行になるようにします。スーパーグルーが乾燥したら、胚がブレードから離れて向かるようにビブラートステージを水没させます。
  8. スライス 400 - 450 μm スライス. 生殖不能の転写ピペで各スライスを収集します。コールド スライス バッファに配置します。
  9. 解剖範囲の下で、オキュロモーター核と目を含むスライスを選択します。無菌転写ピペを使用して、6ウェルプレートに細胞培養挿入物に置きます。プレートを37°Cインキュベーターに戻します。または、1 人の人がスライスし、別の人がスライスを配置します。スライスとインキュベーターへの配置までの時間を最小限に抑えます。
    注:スライスは、核および軸索から放出される最大蛍光がイメージング顕微鏡の目的に最も近い方法で方向付けされるべきである。反転顕微鏡では、プレートの下の目的に最も近い核と軸索を持つ膜上にスライスを配置する必要があります。
  10. ビブラート段階から残留アガロースを取り出し、次の胚をステージに接着し、すべての胚がスライスされ、めっきされるまでステップ3.7-3.9を繰り返します。
  11. 各ウェルの培地に選択した阻害剤または組換え分子を追加して、用量応答曲線を作成します。 適切な溶媒で希釈する。
    注:DMSOを使用する場合は、組織培養グレードDMSOのみを使用してください。あるいは、タンパク質溶出ビーズは、スライス上の特定の場所に配置することができる。
  12. 37 °C および 5% CO2チャンバ内の顕微鏡に置きます。 顕微鏡をセットして、各スライスの位相コントラストと蛍光写真を30分毎に撮影します(または必要に応じてより頻繁に)。スライスは48-72時間維持することができる。

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Representative Results

通常の結果:図 1は実験の概略図を提供します。マウスのE9.5の早い段階から始まり、最初の軸索は、オキュロモーター核26から出現し始める。E10.5では、初期の開拓ニューロンを含む筋状のオキュロ運動神経が間葉内で見られる。E10.5の胚間には、神経が軌道に向かってどの程度進歩したか(同じゴミの中でも)に大きなばらつきがあり、数時間の発達差が原因である可能性が高い。子宮発達の正常な間に、最初のGFP陽性眼球軸星は次の18-24時間(E11.5によって)の軌道/目に達し、そして最終的な目標27に分岐を開始する。スライスカルチャでは、このタイミングが要約されます (2,ビデオ1)。スライスは72時間まで(すべての方向に)成長し、拡大し、軸索は、核から目に向かって伸びているのが見えます。我々は、オキュロモーター軸ソンの成長を評価するのに最も有用な最初の36-48時間を発見した。運動ニューロンは時々核内を移動して見ることができます(図示せず)。いくつかのスライスでは、向きに応じて、トロクレア核も存在する。トロクレア軸索はスライス内に横に伸び、しばしば失速します。時折、トロクレア軸ソンは、眼モーター軸王と結合し、眼に向かって回るように見えるので、それらの軸がオキュロモーター軸の導きに二次的な影響を与える可能性があるため、スライスを解釈することが困難になります。

重要な軸ゴン誘導経路を阻害する例:CXCR4シグナル伝達を阻害すると、眼モーター軸ソンの腹部増殖ではなく背部を引き起こす。CXCR428の水溶性低分子阻害剤AMD3100の1 μg/mL(1.26 μM)をスライス培養物に直接加えることで、オキュロモータ開発におけるCXCR4シグナル伝達の役割を評価しました。その後、オキュロモーター軸索が後部にオキュロモータ核を出て軌道から離れて成長するのを見ることができます(「後方」)(図2、ビデオ2)。すでに中脳を離れ、E10.5で軌道に向かう途中の軸線は、その経路を続けています。CXCR4の阻害は、スライスの全体的な成長にも影響を与えます。

スライスの向きは非常に重要です。スライスの方向が正しくなっていない場合、スライスは解釈できません。不適切な方向のスライスの例を図 3に示します。胚が横に傾いている場合、スライス内に1つのオキュロモータ核のみが含まれる(図3A)。 埋め込まれた胚が背中に向かって傾きすぎると、目はスライスに入らず、代わりに上肢と後頭脳または脊髄がスライスに入っている可能性があります(図3B)。 この場合、オキュロモーター軸線の正常軌道は存在せず、ランダムに成長する傾向がある。培養膜上にスライスを配置する際に、折り畳むことができる(図3C)。

溶剤は有毒である可能性があります。有機溶剤中の阻害剤や増殖因子を溶解する場合は注意が必要です。図4は、メディアにエタノールを添加した後に死亡したスライスの例を示す。118 μLを1.5mLの培媒体(最終濃度7.8%)に添加し、この高濃度は毒性を証明した。これを防ぐために、溶媒を可能な限り少ない量で溶解する(溶解度の限界まで)。可能な限り、水に溶解します。DMSOを使用する場合は、無菌の組織培養グレードDMSOであることを確認してください。

Figure 1
図 1: 回路図。E10.5 IslMN-GFP胚(写真、B:概略)は、オキュロモータ核と軌道の両方を含むようにビブラート(400〜450 μmの厚さ)にスライスされます。A と B の平行な破線は、ビブラートメ カットの位置を示します。Aの下の破線は、アガロースをトリミングし、ビブラートステージに接着する必要がある場所を示しています。(C) セクションは、組織培養膜上に平らに置かれ、栄養素とガスの交換を可能にし、タイムラプス顕微鏡検査のためのステージトップインキュベーターに置かれます。この段階では、阻害剤を成長培中に添加することができる。(D)培養物は24〜72時間維持することができ、眼に成長する眼球運動軸車を見ることができます。ホイットマンらの許可を受けて適応al. 201823.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: CXCR4 の阻害は、CN3 の誤ルーティングを引き起こします。0、12、24、および36h培養で画像化されたE10.5 Isl-GFP胚からのスライス培養物。上のパネルは野生型のコントロール胚を示し、CN3(緑)は36時間の間に広範囲に目と枝に向かって成長する。また、ビデオ 1を参照してください。下部パネルには、1 μg/mL AMD3100(CXCR4用の特異的阻害剤)が付加されたスライスが示され、軸索は眼モーター核を後藤に出します。既に心室を出ていたものは、目に向かって続きます。また、ビデオ 2を参照してください。D:背部、V:腹部、E:眼、N:眼球運動核、SMN:脊髄運動ニューロン、矢印:オキュロモータ軸索(白:野生型突起、黄色:異常突起)。スケールバーは200 μmに相当します。また、ビデオ 1ビデオ 2を参照してください。 他の例を示す同様の図がホイットマンなどで発表された。al. 201823.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: スライスの向きが重要です。代表的な間違ったスライスの初期画像(時間0時間)。Aは、CN3軸を突き出す軸が軸化されたような胚が側面に傾いたスライスを示す。投影軸線は、スライスの右側(矢印)にのみ存在します。 Bは胚が後ろに傾いたスライスを示し、軸索(矢印)を突き出したCN3核が両側に見えるが、目はスライスに存在しない。代わりに、脊髄運動ニューロン(SMN)と四肢への運動ニューロン突起が見られます。Cは、膜上の配置中に折りたたまれたスライスを示す。ここに示すようなスライスは破棄する必要があります。スケールバーは、各パネルで500 μmを表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:溶剤は有毒である可能性があります。E10.5 Isl-GFP胚からのスライス培養のタイムラプスイメージングを0および12h培養中に撮影した。添加物(A-B)を含む培地で培養されたスライスは、CN3軸が目に向かって突出して12時間正常に成長します。エタノール濃度の高い培養スライス(7.8%)(C-D)は正常に成長しない。12時間で、CN3は成長しておらず、ほとんど目に見えません、そして、組織は崩壊し始めました。スケールバーは、各パネルで500 μmを表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Video 1
ビデオ1:スライス培養におけるCN3の成長。E10.5 Isl-GFP胚からの対照スライス培養のタイムラプスイメージング。培養中18時間毎に30分毎に撮影された画像。CN3(緑色)は、核(上)から目に向かって成長し、分岐を開始します。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

Video 2
ビデオ 2: CXCR4 シグナリングの阻害による CN3 の誤ターゲティング。E10.5 Isl-GFP胚からのスライス培養物のタイムラプスイメージングは、培養中48時間を超える。1 μg/mL AMD3100(CXCR4に対する特異的阻害剤)をメディアに直接添加すると、まだ周囲にないCN3軸索が心室ではなく眼球運動核(左)を出る(右)。ホイットマンらの許可を受けて転載。al. 201823.このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

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Discussion

このex vivoスライス培養プロトコルは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイ23に対して大きな利点を提供します。各頭蓋運動核の大きさは制限因子ではなく、困難な解剖は必要ありません。軸が移動する内因性微小環境は維持され、他のシグナル伝達経路を維持しながら1つのシグナル伝達経路の修正を可能にする。さらに、効果は軸ゴン軌道に沿って異なるポイントで評価することができます。軸ゴンガイダンスは複数の手掛かりと、パス29に沿った手掛かりの組み合わせを必要とするため、これは大きな利点を提供します。解離または植生培養とは異なり、この調製物では軸ゴンの成長は切断されないため、軸ゾン再生ではなく初期軸ゾンの成長を評価することができます。他のほとんどのガイダンスアッセイでは、アクソン再生は初期軸ゾンの成長ではなく、実際に評価されています。軸筋を避けることもニューロンが損傷していないか、ストレスの下でないため、重要な潜在的な交絡因子を回避します。

2つの最も重要なステップは、母親の安楽死とインキュベーター内のスライスの配置の間の時間をスライスし、最小化するための胚の向きです。胚は常に氷の上に保管しなければなりません。オリエンテーションに関しては、いくつかの異なる金型を試してみましたが、この年齢で胚間のばらつきのために、解剖顕微鏡下の蛍光に基づく手での向きが最も効果的であることがわかりました。しかし、手で向きを合うことで、研究できる胚の時間枠が制限されます。E10.0より早く、目が見えにくく、CN3軸が見えにくいため、スライスの向きが正しく行きにくいです。しかし、この方法を使用して最も早いパイオニアの軸ゾンの成長を研究することはできないということです。

オキュロモータスライス培養製剤にはいくつかの制限があります。これは、端末分岐の決定ではなく、早期および中間のガイダンスの決定を研究する場合に最も役立ちます。E10.5 では、EOEM は筋肉アナージュとしてのみ存在します。後の時点でも、現在のイメージング技術では、個々のターゲットEOEMをスライス内で区別することはできません。したがって、オキュロモータ軸線の特定の末端分岐決定は、現在の状況で評価することはできません。スライスは多孔質組織培養膜上で成長するため、膜からの培養後分離は困難であり、しばしば組織損傷を引き起こし、抗体の染色と再マウントを行い、追加のイメージングに失敗します。軸は切断されないが、それによって神経損傷を最小限に抑え、周囲の組織が切断され、したがって損傷を受け、シグナルキュー発現または放出に影響を与える可能性がある。理想的な時間枠も限られています。前述のように、スライスのE10.0より早い方向は難しく、E11.5以降は多くの軸が既に軌道に到達しているので、中間ガイダンスの決定はすでに行われています。

準備はステージトップのインキュベーター、自動段階およびタイムラプス機能が付いている顕微鏡を要求する。目的とカメラは、クリアリングのない厚い標本のイメージング用に最適化する必要があります。一つの成長コーンのレベルでの分解能は、いくつかの培養製剤で可能と同様に、現在のイメージングセットアップでは不可能である。しかし、イメージングパラメータは、各スライスの小さな領域に焦点を当てて、共焦点または2光子顕微鏡で、より高い解像度を可能にするために適応される可能性があります(軸が成長するにつれてスライスを調整する可能性があります)。現在のエピ蛍光顕微鏡を使用し、30分ごとにイメージングを行い、光漂白は見られていない。共焦点顕微鏡検査とより頻繁なイメージングを使用することができますが、光漂白は潜在的な問題になります。

小分子阻害剤は、スライスの全体的な成長と健康を含むオフターゲット効果を有する可能性があるため、このアッセイはスクリーニングツールとして最も有用である。結果は、ノックアウト マウス モデルなどの他の方法で検証する必要があります。例えば、CXCR4阻害では、CXCR4の複数の機能と一致して、スライスの全体的な成長が軽度に減少します(図2を参照)。しかし、マウスモデルでは、スライスに見られる軸ゾン表現型を23を要約した。

このプロトコルは、他の頭蓋神経集団を研究するために変更することができますが、それぞれに、スライスとタイミングの適切な向きを経験的に決定する必要があります。さらに、異なる蛍光標識を持つマウスは、ニューロンの異なるサブセットをマークしたり、早期またはそれ以降の胚の年齢でオンにするマウスを使用することができます。

スライス カルチャは、複数の方法で操作できます。ここでは、低分子阻害剤による受容体シグナル伝達を遮断する例を示す。あるいは、抗体(受容体遮断または受容体活性化のいずれか)または組換えタンパク質(軸ゾンガイダンスキューまたは成長因子など)を培法に添加することができる。軸方向ガイダンスに対する方向効果を評価するために、リガンド分泌ビーズを特定の場所のスライスに配置できます。これらの方法のいずれかを使用して、他の多くの軸子誘導経路を同定し、眼モーターシステムで研究することができる。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

国立眼科研究所[5K08EY027850]、国立小児保健開発研究所[U54HD090255]、ハーバードビジョン臨床科学者開発プログラム[5K12EY016335]、ナイツテンプラーアイ財団[キャリアスターター]グラント」と小児病院眼科財団[教員発見賞]。ECEはハワード・ヒューズ医学研究所の調査員です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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