コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

Immunology and Infection

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Summary

プロトコルの目的は、候補ウイルスエントリ阻害剤を同定するために使用することができるウイルスエントリに関連する異なるアッセイを説明することです。

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Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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Abstract

機械的にウイルスの入り口を調べる抗ウイルスアッセイは、評価された薬剤が最も効果的であるステップを識別するのに関連し、候補ウイルスエントリー阻害剤の同定を可能にする。ここでは、ウイルス粒子または初期のウイルス侵入における特定のステップを標的にすることにより、非エンベロープコクサッキーウイルスA16(CVA16)による感染を遮断することができる低分子の同定のための実験的アプローチを提示する。アッセイには、薬物添加分析の時間、フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイ、およびウイルス不活性化アッセイが含まれる。また、ウイルスカプシドタンパク質を利用して、抗ウイルス化合物の標的となる潜在的な残留物を予測する分子ドッキングプロトコルを提示する。これらのアッセイは、ウイルスの侵入に作用する候補抗ウイルス剤の同定に役立つはずだ。将来の方向性は、さらなる薬剤開発のためのこれらの可能な阻害剤を探索することができます。

Introduction

手、足、口の病気(HFMD)は、幼児におけるコクサッキーウイルスA16(CVA16)およびエンテロウイルス71(EV71)によって最も一般的に引き起こされる疾患である。最近、アジア太平洋地域では、CVA16誘発HFMDが著しい上昇を見せております。症状は軽度であり、脳と心臓に影響を与える重篤な合併症が起こり、潜在的な死亡事故は1、2である。現在のところ、CVA16に対して認可された抗ウイルス療法やワクチン接種は存在しないため、将来の流行とそれに関連する合併症を抑制するための抗ウイルス戦略を開発する必要があります。

CVA16は、それぞれVP1、VP2、VP3、およびVP4という4つの構造タンパク質を含むペンタマーから組み立てられたイコサヘドラルドカプシドを持つ非エンベロープウイルスです。ペンタマーの各5倍軸を囲むは、うつ病として示す「キャニオン」領域であり、受容体結合3におけるその役割で知られている。この渓谷の底部には、スフィンゴシン(SPH)という名前の天然脂肪リガンドを含むVP1領域に疎水性ポケットがあります。ヒトPセレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)およびスカベンジャー受容体クラスB部材2(SCARB2)などの細胞受容体は、このリガンドを置換することによりウイルス結合の役割を果たさなことが示唆されており、その結果、カプシドおよびコプレジドに対する立体構造変化をもたらす。宿主細胞4、5、6へのウイルスゲノムのその後排出。ウイルス入力プロセスにおける連続的な事象をブロックする可能性のある阻害剤を同定することは、CVA16感染に対する潜在的な治療戦略を提供する可能性がある。

ウイルスライフサイクルのステップは、モード特異的抗ウイルス剤の同定に役立つ標的として実験的アプローチを通じて解剖することができる。薬物添加分析では、ウイルス感染の前に(ウイルス感染前に追加)、エントリー(ウイルス感染に同時に追加)、およびポストエントリー(以下に追加される)を含む、ウイルス感染中の異なる時期における薬物治療効果を調べる。ウイルス感染)7.その影響は、各治療条件で形成されたウイルスプラークの数を定量することにより、標準的なプラークアッセイを用いて評価することができる。フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイは、薬物が宿主細胞へのウイルスの付着を防ぐかどうかを決定する。これは、ヒトウイルス感染の大部分が発生する37°Cから、ウイルスが宿主細胞表面に結合できるが細胞7に入ることができない4°Cに温度をシフトすることによって達成される。細胞膜結合ウイルス粒子は、ウイルス抗原に対する免疫染色を通じて定量化され、フローサイトメトリーによって評価される。一方、ウイルス不活性化アッセイは、遊離ウイルス粒子との薬物の潜在的な物理的相互作用を評価するのに役立ちます, バイリオンを保護または中和, またはそれらのために非アクティブにする集約や立体構造変化を引き起こす感染8、9の間に宿主細胞表面とのその後の相互作用。この実験では、ウイルス接種は、宿主細胞単層に感染し、標準的なプラークアッセイ8を行う前に薬物をチレートする前に、薬物で最初にインキュベートすることを許可する。最後に、分子ドッキングは、計算を使用して、エンベロープされたウイルスからのウイルス糖タンパク質や非エンベロープウイルスからのウイルスカプシドタンパク質を含む、ビリオン表面上の潜在的な薬物相互作用部位を予測するための強力なツールです。アルゴリズム。これは、薬物の作用モードの標的を機械的に特定し、下流アッセイによってさらに検証できる有用な情報を提供するのに役立ちます。

我々は最近、非エンベロープCVA169による感染を効率的にブロックした抗ウイルス化合物を同定するために、上記の方法を採用した。本明細書において、使用された詳細なプロトコルについて説明し、議論する。

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Protocol

注:すべての細胞培養およびウイルス感染は、取り扱うサンプルのバイオセーフティレベルに適した認定バイオセーフティフードで行う必要があります。CVA16感染9を効率的に遮断することが観察された小分子ケブラギン酸(CHLA)とプニカラギン(PUG)の2つのタンニンクラスは、候補阻害剤の例として用いられる。ウイルス学技術における基本原理、ウイルス伝播、ウイルス力確定、およびプラーク形成単位(PFU)または感染の多重性(MOI)の概念について、読者は参照参照10と呼ばれる。

1. 細胞培養、ウイルス製剤、化合物製剤、化合物細胞毒性

  1. ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞は、CVA16感染11に寛容な宿主細胞である。10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の10mLでRD細胞を成長させ、200 U/mLペニシリンG、 200 μg/mLストレプトマイシン、およびT-75フラスコ中の0.5 μg/mLアンポテリシンBを5%CO2インキュベーターで37°Cで使用します。
  2. RD細胞にウイルスを伝播してCVA16を調べ、PFU/mLでウイルスのチターを決定する。最適化されたプロトコルについては、リファレンス11を参照してください。
  3. 各溶媒を使用して試験化合物およびコントロールを調融する:例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)にCHLAおよびPUGを溶解する。すべての感染ステップについて、基底培地はDMEMプラス2%FBSおよび抗生物質からなる。
    注:試験化合物処理におけるDMSOの最終的な濃度は、実験で0.25%以下である。0.25%DMSOは、比較のためのアッセイに陰性対照治療として含まれる。
  4. XTTなどの細胞生存率判定試薬を用いてRD細胞上の試験化合物の細胞毒性アッセイを行う((2,3-bis-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-フェニルアミノ)-カルボニル-2H-テトラゾリウムヒドロキシド)詳細なプロトコルについては、リファレンス12を参照してください。製造元のプロトコルに従って GraphPad プリズムなどの分析ソフトウェアを使用して、試験化合物の細胞毒性濃度を決定します。細胞生存率に有意に影響を与えない薬物濃度(≥95%生存細胞)は、研究の残りの部分に使用される。

2. 薬剤添加アッセイの時間

  1. ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価する(前処理)
    1. 2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
    2. RD細胞を非細胞傷害性濃度(ステップ1.4から決定)で1時間または4時間の基底媒体容積の1mLで治療する。
    3. 1-2 mLのPBSで細胞を洗浄してから、基底媒体に50 PFU/ウェルのウイルスを加え(接種の最終体積は300μL)、1時間ごとにプレートを15分ごとにロックします。
    4. 感染後、PBSを用いて単層を再度洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1mLをオーバーレイし、5%CO2インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行う。
    5. インキュベーションの72時間後、オーバーレイ培温を取り外し、PBSの2 mLを使用してウェルを洗浄します。
    6. 37%ホルムアルデヒドの0.5 mLを使用して15分間ウェルを固定します。
    7. 上清を取り出し、PBSを使用して再び洗浄します。
    8. 0.5%結晶紫色溶液の0.5 mLを使用して井戸を汚します。その後、2分以内に汚れ溶液を除去し、空気乾燥前に水の穏やかな流れで井戸を洗浄します。
    9. ホワイトライトボックスにプレートを置くことによって、ウイルスプラークを数えます。パーセント (%)CVA16感染は以下の通り:(プラークウイルス+薬物の平均#/プラークウイルス+DMSO制御の平均#)×100%。
  2. 薬物とウイルスを同時に添加する効果を評価する(共添加)
    1. 2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
    2. RD細胞を適当な濃度で試験化合物で処理し、CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)を1時間毎にプレートを1時間ロックします。
    3. 1 mLのPBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1-2 mLでオーバーレイし、5%CO2インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行います。
    4. 感染後72時間後に結晶紫色でウイルスプラークを染色し、上述したようにCVA16感染率を決定する。
  3. ウイルス感染後の薬物治療効果を評価する(感染後)
    1. 2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
    2. CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)でRD細胞を1時間毎にプレートをロックします。
    3. PBSの1-2 mLでウェルを洗浄し、0.8%のメチルセルロースと適切な濃度の試験化合物を含む基底媒体で細胞をオーバーレイします。
    4. 結晶バイオレットでウイルスプラークを染色し、72時間後の感染後にカウントし、上記の%CVA16感染インキュベーションを決定する。
      注:細胞を持ち上げないように、すべてのPBS洗いを穏やかに行います。

3. フローサイトメトリーベースのバインディングアッセイ

  1. 2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を達成する。
  2. 細胞単層を4°Cで1時間予冷します。
  3. 4°Cで3時間の試験化合物の有無にCVA16(MOI=100)でRD細胞に感染する。
    注:氷上のウイルス接種と4°C冷蔵庫でのインキュベーションを行い、4°Cの温度を維持し、ウイルス結合を可能にするが、入り口は認めません。
  4. ウイルスの接種を取り除き、1-2 mLの氷冷PBSで一度洗います。
  5. 氷上の井戸に1 mLの氷冷解離バッファーを3分間加えて、細胞を集集め、氷冷流サイトメトリーバッファー(1x PBS+2%FBS)で再懸濁して細胞を持ち上げます。
  6. 氷冷流サイトメトリーバッファーを用いて細胞を2回洗浄し、0.5mLの4%パラホルムアルデヒドで20分間氷上で固定する。
  7. PBSを使用して細胞を洗浄して、結合されていないウイルスまたは弱結合ウイルスを除去し、その後、抗VP1抗体の1 mL(1:2,000;3%BSAを含むPBSで希釈)で細胞を1時間氷上に染色し、続いてセカンダリAlexa 488結合抗マウスIgG(1:250)でインキュベーションを行います。1時間氷上に3%BSAを含むPBSで希釈し、各抗体処理後にPBS洗い(3回)を行う。
  8. 氷冷流サイトメトリーバッファーの0.5 mLで細胞を再中断し、標準的な手順を使用してフローサイトメータ上のフローサイトメトリー分析を実行します。関連するソフトウェアを使用してヒストグラムにデータを表示し、棒グラフ表現の定量を行います。

4. ウイルス不活性化アッセイ

  1. 前述の12のように、次の条件を使用してウイルス不活性化アッセイを実行します。
    - CVA16の開始濃度106 PFU/mL。
    - 2 x 105細胞/ウェルの播種密度から12ウェルプレート中のRD細胞単層。
    - 50倍の希釈を行い、薬物化合物を活性化させ、最終的なウイルス濃度を50PFU/ウェルにする。
    - PBSの1-2 mLを使用してステップを洗浄します。
    - 0.8%のメチルセルロースを含むオーバーレイ培った培養剤。
  2. 上記で詳述したように、ウイルスプラーク手順の結晶紫色染色を用いてウイルス感染の最終読み出しを行う。

5. 分子ドッキング解析

  1. PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)から試験化合物の3D分子をダウンロードします。分子に3D構造がアップロードされていない場合は、2D構造をダウンロードするか、SMILES弦配列を使用して分子プログラム(例えばCORINA)を介して3D分子に変換します。
  2. RCSBタンパク質データバンク(https://www.rcsb.org/)からウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードし、バイオコンピューティングプログラム(例えばUCSFキメラ)を使用してウイルス構造モデルを調作する。例えば、CVA16成熟ビリオン結晶構造(PDB:5C4W)3の場合、PDBファイルから溶媒を削除し、Dunbrach 2010ロタマーライブラリーのデータを使用して不完全なサイドチェーンを置き換え、水素と料金を構造に追加します。以前に報告された13.ドッキングターゲットは、生物学的アセンブリ情報(タンパク質データバンク)を用いた意図された分析に関連する任意のウイルスタンパク質でありうたえられる。
  3. 例えばUCSFキメラを使用して調製されたウイルスユニットに化合物をドッキングし、ビジュアライゼーションソフトウェア(例えば、オートドックVina、PyMol)で出力ファイルを分析します。
    1. 「リガンド」としてUCSFキメラにテスト化合物ファイルをアップロードし、「受容体」として準備されたウイルスタンパク質全体を選択してブラインドドッキングを実行します。コンピュータのマウスまたはトラックパッドを使用して、検索ボリューム全体の「受容体」のサイズを変更します。[詳細オプション] で、バインド モードの数を最大に設定します。ドッキング フレームは、最高から最低の結合エネルギーに自動的にランク付けされます。
    2. (オプション)さらにブラインドドッキングに関して、マウスまたはトラックパッドを再び使用してブラインドドッキング結果に由来する目的の領域のウイルスタンパク質にドッキング部位を閉じ込め、検索量を減らす(例えば、100Å x 100Å x 100Å)。この手順は、ブラインドドッキングの結果を確認するのに役立ち、特異性を高めるのに役立ちます。
    3. 分子グラフィックスシステム(例えば、PyMol)を使用して、ドッキングファイルをアップロードしてバインディングモードの位置を分析します。「リガンド」を選択し、「任意の原子に」オプションで極性接触を識別することにより、化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけます。結果を調べます。

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Representative Results

時間増量アッセイは図1に示され、CVA16感染に対する低分子CHLAおよびPUGを用いた治療からの影響を示す前ウイルス入力(前処理)、ウイルス入力中(共添加)、またはウイルス後のエントリー(感染後)。いずれの低分子も、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理(図1A)または感染後治療(図1C)において、CVA16感染性に対する限界的な影響のみを生じさせた。対照的に、CHLAおよびPUGは、共添加治療においてCVA16感染を>80%によって効率的に損なった(図1B)。したがって、これらの観察は、2つの化合物が感染中に宿主細胞表面にウイルス粒子と同時に存在する場合に最も効果的であることを示唆している。

図2では、フローサイトメトリーベースの結合分析(図2Aに概略的に示す)は、2つのタンニンが宿主細胞へのウイルス粒子結合を防止することによってCVA16の侵入を防ぐことを確認する。図2Bの定量データは、2つの薬剤の存在下でRD細胞表面で検出されたウイルスの量が、10%未満であり、CVA16付属ファイル防止することが知られているヘパリン陽性対照と同様であることを示す。図2C、2D、および2Eは、CHLAおよびPUGが存在する場合にRD細胞表面上のCVA16の検出によるバンドシフトが有意に減少する関連するフローサイトメトリーヒストグラムを示す。

図3Aは、ウイルス不活性化実験がどのように行われたかを示す。薬物化合物をCVA16ウイルス粒子と混合し、希釈工程の前に1時間(長期)インキュベートするか、感染前に混合して直ちに希釈した(短期)。図3Bに示すように、1時間の試験剤を用いたCV16粒子のプリインキュベーションは、短期インキュベーションおよびDMSO制御と比較して、ウイルス感染に対するRD細胞のほぼ完全な保護をもたらした。したがって、この結果は、CHLAとPUGの両方がCVA16粒子と相互作用し、その後の感染で非アクティブにできることを示唆している。

我々のデータは、薬物化合物がCVA16粒子を直接不活性化できることを示しているので、したがって、その抗ウイルス活性のもっともらしい標的としてビリオン自体を同定するので、我々はこれらの間の潜在的な相互作用を予測するために分子ドッキングを使用したエージェントとCVA16キャプシドペンタマー。図4Aは、CVA16ビリオンのイコサヘドラルカプシドを構成するCVA16ペンタマーの表面投影を示す。タンニンCHLA(図4B;緑)およびPUG(図4C;青)の分子ドッキングは、両方ともCVA16ペンタマーの渓谷領域で結合すると予測されていることを示す。具体的には、ポケット入口のすぐ上に結合した小分子(図4Bおよび4C、ズームパネル)は、ポケット因子を保持し、CVA16結合および宿主細胞への侵入を媒次的にする上で重要な役割を果たしている。したがって、CHLAとPUGの両方がポケット入口領域をマスクするように見え、理論的にはウイルス粒子と宿主細胞受容体との相互作用を妨げるだろう。図4Dと4Eは、CHLAとPUGの極性接触から予測される固有の残渣をそれぞれポケット入口の周りに示し、これらの相互作用のほとんどは、化合物と3アミノ酸Asn85の両方に対してVP1と起こっている。、Lys257、およびAsn417は、2つのタンニンの間に共通している。

Figure 1
図1:CVA16感染性に対するCHLAおよびPUGの薬物添加効果の時間RD細胞を、CVA16接種(50 PFU/ウェル)の異なる時間にCHLA(20μM)またはPUG(25μM)で処理した。DMSO (0.25%)治療は陰性対照として含まれ、すべてのアッセイは、インキュベーション後72時間の結晶紫色染色を用いてプラークアッセイによって分析された。(A)前処理のために、細胞を試験化合物で1時間または4時間インキュベートし、次いでCVA16感染前に洗浄した。(B)共添加アッセイのために、細胞を薬物とウイルスを同時に1時間投与し、次いで洗浄した。(C) 感染後、細胞をCVA16に1時間感染させ、洗浄し、試験化合物で処理した。示されているデータは、3つの独立した実験からの平均±標準偏差(SD)である。*p < 0.05 それぞれの「ウイルスのみ」グループと比較した。分散の一方通行分析を用いて統計分析を行った。この図は、参照9から調整されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: CHLA および PUG は、ホスト セルへの CVA16 バインドを廃止します。(A) フローサイトメトリーベースの結合アッセイの概略図。(B) RD細胞(2 x 105細胞/ウェル)は、CHLA(20μM)、PUG(25μM)、可溶性ヘパリン(500μg/mL、陽性対照)、またはDMSO(0.25%、陰性対照)の有無においてCVA16(MOI=100)に感染した。.井戸からイノキュラをチューブに集め、PBSで2回洗浄し、固定し、抗VP1抗体で染色し、続いてAlexa 488-共役二次抗体を用いて表面結合ウイルスのフローサイトメトリー検出を行った。検出された蛍光シグナルからの定量データを、「DMSO」対照処理と比較して、棒グラフにおける3つの独立した実験から「ウイルス結合(%)」*p<0.05として平均±SDとしてプロットした。 分散の一方通行分析を用いて統計分析を行った。CHLA(C)、PUG(D)、およびヘパリン(E)治療の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムが示されている。この図は、参照9から調整されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:CHLAおよびPUGは、無細胞CVA16ウイルス粒子を不活性化する。(A) ウイルス不活性化アッセイの概略図。(B) CVA16 (106 PFU/well) CHLA (20 μM) または PUG (25 μM) を使用して処理し、短期不活性化のために直ちに混合し、37 °Cで1時間インキュベートしてから、50倍の非有効濃度の試験に希釈する前にRD細胞に接種する前の化合物(最終ウイルス濃度=50 PFU/ウェル)。DMSO (0.25%)負のコントロールとして使用されました。実験は、感染後72時間の結晶紫色染色を用いたプラークアッセイにより解析した。示されるデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。*p < 0.05 それぞれの「ウイルスのみ」グループと比較した。分散の一方通行分析を用いて統計分析を行った。この図は、参照9から調整されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: CHLA と PUG は、ポケット入り口付近の CVA16 カプセルシドをターゲットにしています。赤い線で線状に図を書いたモノマー構造ペンタマーを用いたCVA16ビリオン粒子の表面投影(A)。ビリオン上の追加のペンタマーは、シアン、マゼンタ、インディゴ、ブロンズ、および緑で示されています。CVA16ペンタマー上のCHLA(B、緑)およびPUG(C、青)の分子ドッキング解析(PDB:5C4W);。ズームインパネルは黄色で区切られます。VP1 = オレンジ、VP2 = グレー、VP3 = 白;極性接触は黒い破線で表示されます。メイクアップポケット入り口の残渣は赤色(Ile 94、Asp95、Gln207、メット212、メット213、Lys257、Thr258)。D, E.ポケットの入り口がある渓谷にクローズアップサイドビューとCHLA (D)と PUG(E) がバインドする場所。ペンタマー上の化合物の極性接点からの極性接触である固有の残基は、黄色(VP1)、白(VP2)、および黒(VP3)フォントでラベル付けされています。白い破線は、ポケット入り口領域を示します。この図は、参照9から調整されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本報告では、特に非エンベロープCVA16に対して、ウイルスエントリを標的とする抗ウイルス候補の同定に有用なプロトコルについて説明した。アッセイは、ウイルスの侵入中に初期の事象を解剖する方法で設計されており、試験剤の抗ウイルス活性の作用と潜在的な標的のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。「薬物添加アッセイ」は、例えば、未感染の宿主細胞(前処理分析)、ウイルス粒子または宿主細胞表面との相互作用(共添加分析)など、試験化合物の潜在的な標的を広く決定することを可能にする。)、またはウイルス複製段階(感染後分析)中にウイルスに感染した宿主細胞。このアッセイ単独では、このプロトコルに記載された後続のアッセイ(例えば、ウイルス不活性化アッセイおよび結合分析)につながる化合物からの相互作用の方法を決定することができる。洗浄工程は、検査された治療方法が分析された方法に固有であることを確認するために重要です。「フローサイトメトリーベースの結合アッセイ」の使用は、宿主細胞へのウイルス結合に対する化合物の影響を評価するのに役立つ。この温度はウイルス結合を可能にするが、エントリを可能にしないので、4 °Cで実験の温度を維持することは、細胞表面上のビリオンの最終的な検出に重要です。「ウイルス不活性化アッセイ」は、無細胞ウイルス粒子との薬物化合物の潜在的な物理的相互作用を決定するのに役立ちます。重要なステップは、ウイルス接種とのインキュベーション後の薬物化合物を刺激するための希釈であり、これは、その後の感染ステップ12における宿主細胞表面との薬物の有意な相互作用を防止するために必要である。

ウイルスのエントリは多段階のイベントであるため、抗ウイルス剤のウイルスエントリ阻害剤クラスは、(1)細胞表面エントリ因子/受容体または関連するシグナル伝達経路を調節するなど、いくつかのタイプのメカニズムを発揮する可能性があります。(2)細胞膜の流動性または完全性に影響を与える;(3)ウイルス粒子と宿主細胞表面との間の静電またはファンデルワールス相互作用を標的とする。(4) 粒子破損や凝集などのウイルスに物理的な変化を誘発すること。(5)ウイルス糖タンパク質またはカプシドタンパク質に結合し、その機能または立体構造変化を防止する。(6)融合関連メカニズムの遮断(7)宿主細胞内のウイルスゲノムの放出を防ぐ。したがって、このレポートに記載されている分析は、追加の実験によってさらに検証できる、上記の潜在的な作用モードを指し示すのに役立ちます。最後に、ここで説明する「分子ドッキング分析」は、薬物化合物とウイルス粒子との間の潜在的な相互作用領域を予測するのに役立ち、したがって、候補ウイルスカプシドまたは糖タンパク質結合剤および標的体型を同定するのに役立ちます。ウイルス粒子上の残留物。しかし、これらの予測は、ドッキングソフトウェア、およびウイルスタンパク質結晶構造の分解能および精度に依存する。ステップ5.3.2のオプションの限定ドッキング方法が追加されたことに注意することが重要です。例えば、ビリオンの内側に面するビリオンカプシドの表面の下、エンベロープ糖タンパク質の膜領域など)。検索ボックスを閉じ込めると、ウイルスタンパク質のアクセス可能な領域のみを標的にし、非現実的な相互作用を排除できます。分子ドッキングは結晶化構造に依存するが、相同化モデリングの最近の進歩は、そのアミノ酸配列を密接に関連する結晶化構造15に適合させ、非結晶化構造の解析を可能にした。これにより、より多くの構造を分析することができ、取得した情報は、予測された相互作用を検証するのに役立つ変異解析を含むさらなる研究に役立ちます。

結論として、このレポートに記載されているアッセイとプロトコルは、ウイルス入力を標的とする候補抗ウイルス剤を特定し、ウイルス入力プロセスのどのステップに関する情報を提供するのか、それらが標的とするか否かについての情報を提供します。遊び場のウイルス粒子と相互作用し、ウイルス上の可能な薬物相互作用部位を予測する。これらのタイプのアッセイは、他の非エンベロープウイルス上で繰り返し行うことができるか、またはウイルスエントリの可能な阻害剤のための抗ウイルス薬化合物をスクリーニングする方法としてエンベロープウイルスに適応することができる。このようなメカニズム主導のアプローチを使用して抗ウイルス候補を特定することは、薬剤開発プロセスを促進し、抗ウイルス治療薬の範囲を拡大するのに役立ちます。

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Disclosures

著者らは、利益相反がないと宣言している。

Acknowledgments

著者らは、テキサス大学オースティン校のジョシュア・ベッカム博士に、分子ドッキングによる技術サポートに感謝しています。この研究は、台湾科学技術省(MOST107-2320-B-037-002からC.J.L.およびL.T.L.への資金提供によって部分的に支援されました。MOST106-2320-B-021およびMOST107-2320-B-038-034-MY3からL.T.L.へ)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

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References

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