Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het doel van het protocol is het illustreren van de verschillende assays met betrekking tot virale vermelding die kan worden gebruikt om kandidaat-virale invoer remmers te identificeren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antivirale testen die de virale binnenkomst mechanisch onderzoeken zijn relevant om te onderscheiden in welke stap de geëvalueerde agenten het effectiefst zijn, en zorgen voor de identificatie van kandidaatvirale invoer remmers. Hier presenteren we de experimentele benaderingen voor de identificatie van kleine moleculen die een infectie kunnen blokkeren door de niet-omhulde Coxsackievirus A16 (CVA16) door de virusdeeltjes of specifieke stappen in de vroege virale invoer te targeten. Assays omvatten de tijd-van-drug-optellen analyse, flow cytometrie gebaseerde virale binding Assay, en virale inactivatie assay. We presenteren ook een moleculair docking protocol dat gebruik maakt van virus capside-eiwitten om potentiële residuen te voorspellen die zijn gericht op de antivirale verbindingen. Deze assays moeten helpen bij de identificatie van de kandidaat-antivirale middelen die op virale binnenkomst handelen. Toekomstige richtingen kunnen deze mogelijke remmers verkennen voor verdere ontwikkeling van de drug.

Introduction

Hand-, voet-en mond ziekte (HFMD) is een ziekte die meestal wordt veroorzaakt door Coxsackievirus A16 (CVA16) en enterovirus 71 (EV71) bij jonge kinderen. Onlangs in de regio Azië-Pacific, is er een belangrijke uptick in CVA16-geïnduceerde HFMD. Terwijl de symptomen kunnen mild zijn, ernstige complicaties kunnen optreden die invloed hebben op de hersenen en het hart, met potentiële fataliteit1,2. Op dit moment zijn er geen gelicentieerde antivirale therapieën of vaccinaties beschikbaar voor CVA16, en daarom is er een dringende behoefte om antivirale strategieën te ontwikkelen om toekomstige uitbraken en de bijbehorende complicaties te beteugelen.

CVA16 is een niet-omhuld virus dat een icosahedrale capside heeft samengesteld van pentamers die elk 4 structurele eiwitten bevatten, namelijk VP1, VP2, VP3 en VP4. Het omcirkelen van elke vijf-voudige as in de pentamer is een ' kloof ' regio die toont als een depressie en staat bekend om zijn rol in receptor binding3. Aan de onderkant van deze kloof ligt een hydrofoob zak in de VP1 regio die een natuurlijke vette ligand met de naam sfingosine (SPH) bevat. Cellulaire receptoren, zoals Human P selectin glycoproteïne ligand 1 (PSGL-1) en Scavenger receptor klasse B lid 2 (SCARB2), zijn gesuggereerd om een rol te spelen in virale binding door het verplaatsen van deze ligand die resulteert in conformationele veranderingen aan de capside en de daaropvolgende uitwerpen van virale genoom in de ontvangende cel4,5,6. Identificeren van mogelijke remmers die de opeenvolgende gebeurtenissen in de virale entry proces blokkeren zou kunnen bieden potentiële therapeutische strategieën tegen CVA16 infectie.

De stappen in de levenscyclus van het virus kunnen worden ontleed door middel van experimentele benaderingen als doelen om te helpen identificeren van de modus-specifieke antivirale middelen. Een analyse van de tijd van de drug-aanvulling onderzoekt het effect van de drug behandeling op verschillende tijdstippen tijdens de virale infectie, met inbegrip van pre-entry (toegevoegd voorafgaand aan de virus infectie), binnenkomst (toegevoegd gelijktijdig aan de virus infectie), en post-entry (toegevoegd na de virus infectie)7. De impact kan worden beoordeeld aan de hand van een standaard plaque test door het aantal virale plaques dat in elk van de behandelings condities wordt gevormd te kwantificen. De flow cytometrie gebaseerde virale bindings test bepaalt of het medicijn virale gehechtheid aan cellen voorkomt. Dit wordt bereikt door de temperatuur te verschuiven van 37 °C, waarbij de meerderheid van de menselijke virus infecties optreedt, tot 4 °C, waar de virionen kunnen binden aan het hostceloppervlak, maar niet in staat zijn om de cellen7in te voeren. De celmembraan-gebonden virusdeeltjes worden vervolgens gekwantificeerd door middel van immunokleuring tegen virale antigenen en beoordeeld door flow cytometrie. De virale inactivatie test aan de andere kant helpt bij het beoordelen van mogelijke fysieke interacties van het medicijn met vrije virusdeeltjes, het afschermen of neutraliseren van de virionen, of het veroorzaken van aggregaties of conformationele veranderingen die hen inactief maken voor daaropvolgende interacties met het oppervlak van de host-cel tijdens de infectie8,9. In dit experiment mag het virale entmateriaal eerst met het medicijn worden geïnpost voordat het wordt verdund om het geneesmiddel te titreren voorafgaand aan het infecteren van de monolaag van de host-cel en het uitvoeren van een standaard plaque assay8. Tot slot is moleculair docking een krachtig hulpmiddel om mogelijke geneesmiddelinteractie sites op het virion-oppervlak te voorspellen, waaronder de virale glycoproteïnen van omhulde virussen en de virale capside-eiwitten van niet-omhulde virussen, door gebruik te maken van computationele Algoritmen. Dit helpt bij het mechanistisch lokaliseren van de doelstellingen van de werkingsmodus van de drug en bieden nuttige informatie die verder kan worden gevalideerd door downstream assays.

We hebben onlangs de hierboven beschreven methoden gebruikt om antivirale verbindingen te identificeren die een efficiënte geblokkeerde infectie door de niet-omhulde CVA169. Hierin worden de gebruikte gedetailleerde protocollen beschreven en besproken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Alle celkweek en virus infecties moeten worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheidskappen die geschikt zijn voor het bioveiligheidsniveau van de behandelde monsters. De twee tannine-klasse van kleine moleculen chebulagic zuur (CHLA) en punicalagin (PUG), die werden waargenomen om efficiënt te blokkeren CVA16 infectie9, worden gebruikt als voorbeelden van kandidaat-remmende agenten. Voor de basisbeginselen in virologie technieken, virusvermeerdering, bepaling van de virus titer en concepten van plaquevormende eenheden (PFU) of multipliciteit van infectie (MOI) wordt de lezer verwezen naar referentie10.

1. celkweek, virus voorbereiding, samengestelde bereiding en samengestelde cytotoxiciteit

  1. Humane rabdomyosarcoom (RD) cellen zijn gastheer cellen permissieve CVA16 infectie11. Kweek de RD-cellen in 10 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 U/mL penicillaire G, 200 μg/mL streptomycine en 0,5 μg/mL amfotericine B in T-75 kolven bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator.
  2. Bereid CVA16 door het virus door te propageren in RD-cellen en bepaal virale titer in PFU/mL. Voor een geoptimaliseerd protocol verwijzen wij u naar referentie11.
  3. Bereid de teststoffen en controles met behulp van hun respectieve oplosmiddelen: bijvoorbeeld, los CHLA en PUG in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO). Voor alle infectie stappen bestond het basale medium uit DMEM plus 2% FBS en antibiotica.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DMSO in de test samengestelde behandelingen is gelijk aan of lager dan 0,25% in de experimenten; 0,25% DMSO is opgenomen als een negatieve controle behandeling in de assays ter vergelijking.
  4. Voer cytotoxiciteitstest van de teststoffen op de RD-cellen uit met behulp van een levensvatbaarheid van de cel die de bepaling van het reagens, zoals XTT ((2, 3-bis [2-methoxy-4-Nitro-5-sulfophenyl), 5fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide). Voor een gedetailleerd protocol verwijzen wij u naar referentie12. Bepaal de cytotoxiciteits concentraties van de teststoffen met behulp van een analytische software zoals GraphPad Prism volgens het Protocol van de fabrikant. Voor de rest van de studie worden geneesmiddelconcentraties gebruikt die de levensvatbaarheid van de cel (≥ 95% levensvatbare cellen) niet significant beïnvloeden.

2. time-of-drug-additie test

  1. Om de invloed van geneesmiddelen op gastheer cellen voorafgaand aan virale infectie te evalueren (voor behandeling)
    1. Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.
    2. Behandel RD-cellen met teststoffen bij niet-cytotoxische concentraties (bepaald vanaf stap 1,4) in 1 mL basaal mediavolume gedurende 1 uur of 4 uur.
    3. Was cellen met 1-2 mL PBS voordat u 50 PFU/well van het virus toevoegt in het basale medium (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) gedurende 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.
    4. Na de infectie, was de monolagen opnieuw met PBS en vervolgens met 1 ml basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose voor verdere incubatie bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 .
    5. Na 72 h van incubatie, verwijder de overlay media en was de putten met behulp van 2 mL PBS.
    6. Fixeer de putjes met 0,5 mL 37% formaldehyde gedurende 15 min.
    7. Verwijder de supernatant en spoel opnieuw met PBS.
    8. Beits de putjes met 0,5 mL 0,5% kristalvioletoplossing. Verwijder vervolgens de vlek oplossing binnen 2 minuten en was de putjes met een zachte waterstroom voor het drogen van de lucht.
    9. Tel de virale plaques door de plaat op een wit-lichtbak te plaatsen. Bereken het percentage (%) CVA16 infectie als volgt: (gemiddelde # van plaque virus + drug /mean # van plaque virus + DMSO controle) × 100%.
  2. Om te evalueren van het effect van het toevoegen van de drugs en het virus gelijktijdig (co-toevoeging)
    1. Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.
    2. Behandel RD-cellen met de teststoffen in de juiste concentraties en 50 PFU/well van CVA16 (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) tegelijkertijd gedurende 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.
    3. Was cellen met 1 ml PBS en vervolgens bedekt met 1-2 ml basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose voor verdere incubatie bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 .
    4. Vlek virale plaques met kristalviolet na 72 h na infectie en bepaal de% CVA16 infectie zoals hierboven beschreven.
  3. Om het effect van medicamenteuze behandeling te evalueren na virale binnenkomst (na infectie)
    1. Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.
    2. Beënt de RD-cellen met 50 PFU/well van CVA16 (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) voor 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.
    3. Was de putjes met 1-2 ml PBS en overlay de cellen met basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose en de juiste concentraties van teststoffen.
    4. Vlekken virale plaques met kristalviolet en tellen na 72 h na infectie en bepalen de% CVA16 infectie incubaties hierboven beschreven.
      Opmerking: Voer alle PBS-spoelingen zachtjes uit om te voorkomen dat de cellen worden opgeheven.

3. op flow Cytometrie gebaseerde binding assay

  1. Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te bereiken.
  2. Pre-Chill de celmonolayer bij 4 °C gedurende 1 uur.
  3. Infecteren RD-cellen met CVA16 (MOI = 100) in aanwezigheid en afwezigheid van de teststoffen voor 3 uur bij 4 °C.
    Opmerking: Voer de virale inoculatie op ijs uit en de daaruit voortvloeiende incubatie in een koelkast van 4 °C om de temperatuur bij 4 °C te houden, wat virale binding maar geen toegang toestaat.
  4. Verwijder Virus entmateriaal en was één keer met 1-2 ml ijskoude PBS.
  5. Hef cellen op door 1 mL ijskoude dissociatie buffer toe te voegen aan de putjes op ijs gedurende 3 minuten, voordat de cellen worden verzameld en in ijskoude stromings cytometrie buffer (1x PBS plus 2% FBS) te worden opgesuspencte.
  6. Was cellen tweemaal met behulp van de ijskoude flow cytometrie buffer en fixeer de cellen met 0,5 mL 4% Paraformaldehyde voor 20 min op ijs.
  7. Was de cellen met PBS om niet-afhankelijke of zwak gebonden virussen te verwijderen en beits vervolgens de cellen met 1 mL anti-VP1 antilichaam (1:2000; in PBS met 3% BSA) op ijs gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie met een secundaire Alexa 488-geconjugeerde anti-muis IgG (1:250; verdund in PBS met 3% BSA) op ijs gedurende 1 uur. Voer PBS wast (3 keer) uit na elke behandeling met antilichamen.
  8. Respendeer de cellen in 0,5 mL van de ijskoude flow cytometrie buffer en voer een flow cytometrie analyse uit op een flow cytometer met behulp van standaardprocedures. Presenteer gegevens in histogrammen met behulp van de bijbehorende software en quantitate voor de weergave van staafgrafieken.

4. virale inactivatie assay

  1. Voer de virale inactivatie assay uit zoals eerder beschreven12 aan de hand van de volgende voorwaarden:
    -Een start concentratie van 106 Pfu/ml CVA16.
    -RD Cell monolagen in 12-well platen van een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed.
    -50-voudige verdunning voor het titreren van de geneesmiddel verbindingen, resulterend in een uiteindelijke virusconcentratie van 50 PFU/well.
    -Wash stappen met 1-2 mL PBS.
    -Overlay media met 0,8% methylcellulose.
  2. Voer definitieve uitlezen van virale infectie uit met behulp van de Crystal Violet kleuring van virale plaques procedure zoals hierboven beschreven.

5. moleculaire docking analyse

  1. Download 3D moleculen van teststoffen van PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Als moleculen geen 3D-structuur hebben geüpload, downloadt u de 2D-structuren of gebruikt u de reeks van de SMILES-reeks en transformeert u deze in 3D-moleculen via een moleculair programma (bijv. CORINA).
  2. Download virale biologische assemblage-eenheid van RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) en bereid het virale structuur model met behulp van een biocomputing-programma (bijv. UCSF Chimera). Bijvoorbeeld, in het geval van CVA16 volwassen virion kristalstructuur (PDB: 5C4W)3, verwijder oplosmiddelen uit het PDB-bestand, vervang onvolledige zijketens met behulp van gegevens uit de Dunbrach 2010 Rotamer Library, en voeg hydro genen en ladingen toe aan de structuur als eerder gerapporteerde13. Docking targets kunnen alle relevante virale eiwitten zijn voor de beoogde analyse met een biologische assemblage informatie (Protein Data Bank).
  3. Dock teststoffen op de bereide virus eenheid met bijvoorbeeld UCSF Chimera, en analyseer de uitvoerbestanden met een visualisatiesoftware (bijv. autodock Vina, PyMol):
    1. Upload het test samengestelde bestand in UCSF Chimera als de ' ligand ' en voer blind docking uit door het hele bereide virale eiwit als de ' receptor ' te selecteren. Gebruik de computermuis of het trackpad om het formaat van het zoekvolume te wijzigen in de volledige ' receptor '. Geef in ' Geavanceerde opties ' het aantal bindings modi maximaal op. Docking frames worden automatisch gerangschikt van hoogste naar laagste bindende energie.
    2. Optionele Verder naar blind docking, beperk de docking-site tot het virale eiwit in regio's van belang afgeleid van de blind docking resultaten met behulp van de muis of het trackpad opnieuw om het zoekvolume te verminderen (bijv., 100 Å x 100 Å x 100 Å). Deze stap helpt bij het bevestigen van de blind docking resultaten en verhoogt de specificiteit.
    3. Gebruik een moleculair grafisch systeem (bijv. PyMol) om de posities van de bindings modi te analyseren door het docking-bestand te uploaden. Vind polaire contacten van de compound naar het virale eiwit door de ' ligand ' te selecteren en polaire contacten te identificeren met de optie ' naar een atomen '; Bekijk de resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De tijd-van-drug-additie test is aangegeven in Figuur 1 en toont de invloed van de behandeling met behulp van de kleine moleculen CHLA en Pug op CVA16 infectie ofwel pre-virale binnenkomst (voor behandeling), tijdens virale binnenkomst (co-toevoeging), of post-virale vermelding ( na infectie). Beide kleine moleculen produceerden slechts marginale impact tegen CVA16 infectiviteit, hetzij in de voor behandeling van de gastheer cellen vóór virale infectie (Figuur 1a) of in de behandeling na infectie (figuur 1c). CHLA en PUG hebben daarentegen de CVA16-infectie op efficiënte wijze ingetrokken met > 80% in de co-additie behandeling (Figuur 1b). Deze waarnemingen suggereren daarom dat de twee verbindingen het meest effectief zijn wanneer ze gelijktijdig aanwezig zijn met de virusdeeltjes op het hostceloppervlak tijdens de infectie.

In Figuur 2bevestigt de op flow cytometrie gebaseerde bindings analyse (schematisch geïllustreerd in Figuur 2a) dat de twee TANNINES voorkomen dat CVA16 intrede wordt gegeven door te voorkomen dat de virale deeltjes binden aan de gastheer cellen. Uit de kwantificerings gegevens in Figuur 2b blijkt dat de hoeveelheid virus die op het RD-celoppervlak is gedetecteerd in aanwezigheid van de twee geneesmiddelen, minder dan 10% is, vergelijkbaar met de positieve heparine-controle waarvan bekend is dat deze CVA16 Attachment14voorkomt. Figuur 2c, 2Den 2e beschrijven de bijbehorende Flowcytometrie histogrammen waar de band verschuiving als gevolg van de detectie van CVA16 op het RD-CELOPPERVLAK aanzienlijk wordt verminderd wanneer CHLA en Pug aanwezig zijn.

Afbeelding 3a verbeelden hoe het virale inactivatie experiment werd uitgevoerd. De geneesmiddel verbinding werd gemengd met de CVA16 virusdeeltjes en geïnineerd voor 1 uur (lange termijn) voorafgaand aan de verdunningsstap, of gemengd en onmiddellijk verdund (korte termijn) voorafgaand aan de infectie. Zoals weergegeven in Figuur 3b, leidde een pre-incubatie van de CV16 deeltjes met de testmiddelen gedurende 1 uur tot een volledige bescherming van de RD-cellen tegen de virale infectie in vergelijking met de kortstondige incubatie en de DMSO-controle. De resultaten suggereren daarom dat zowel CHLA als PUG omgaan met de CVA16 deeltjes en in staat zijn om ze inactief te maken in de daaropvolgende infectie.

Omdat onze gegevens aangeven dat de geneesmiddel verbindingen direct CVA16 deeltjes kunnen inactiveren, en daarom de virion zelf als een aannemelijk doelwit van hun antivirale activiteit identificeren, gebruikten we moleculaire docking om de mogelijke interactie (en) te voorspellen tussen deze agenten en de CVA16 capside pentamer. Fig. 4a toont een oppervlakte projectie van de CVA16 pentamer, die de icosahedrale capside van de CVA16 virion vormt. Moleculaire docking van de tannines CHLA (figuur 4b; groen) en Pug (figuur 4c; blauw) geven aan dat beide worden voorspeld om te binden in de CANYON regio van de CVA16 pentamer. Specifiek, beide kleine moleculen gebonden net boven de Pocket ingang (figuur 4b en 4c, ingezoomde panelen), die de Pocket factor en speelt een belangrijke rol voor het bemiddel CVA16 binding en de toegang tot de host cel. Zowel CHLA als PUG lijken daarom de Pocket entrance Region te maskeren, wat in theorie de interacties tussen de virusdeeltjes en de hostcelreceptoren zou belemmeren. Figuur 4D en 4e geven de unieke residuen aan die worden voorspeld door de polaire contacten van CHLA en Pug, respectievelijk, rond de ingang van de zak, met de meeste van deze interacties die zich voordoen met VP1 voor beide verbindingen en de 3 aminozuren ASN85 , Zijn de Lys257en ASN417 gemeenschappelijk tussen de twee tannines.

Figure 1
Figuur 1: time-of-drug-additie effect van CHLA en Pug tegen CVA16 infectiviteit. RD-cellen werden behandeld met CHLA (20 μM) of PUG (25 μM) op verschillende tijdstippen van CVA16-inoculatie (50 PFU/well). DMSO (0,25%) behandeling werd opgenomen als negatieve controle en alle testen werden geanalyseerd door plaque assay met behulp van Crystal Violet kleuring 72 h na incubatie. A) voor de voor behandeling werden cellen met de teststoffen gedurende 1 uur of 4 uur geïnineerd en vervolgens vóór CVA16 infectie gewassen. B) voor co-additie-assays werden cellen gelijktijdig met drugs en virus toegediend gedurende 1 uur en vervolgens gewassen. (C) in post-infectie werden cellen GEÏNFECTEERD met CVA16 voor 1 uur, gewassen en vervolgens behandeld met teststoffen. Getoonde gegevens zijn de gemiddelden ± standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke experimenten. *p < 0,05 in vergelijking met de respectievelijke groep ' alleen virus '. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van eenrichtings analyse van variantie. Dit cijfer is aangepast uit verwijzing9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: CHLA en Pug schaffen CVA16 binding aan de host-cel af. A) Schematische weergave van de op de stroom cytometrie gebaseerde bindings test. B) RD-cellen (2 x 105 cellen/goed) werden GEÏNFECTEERD met CVA16 (MOI = 100) in de aanwezigheid of afwezigheid van CHLA (20 μm), pug (25 μm), oplosbare heparine (500 μg/ml, positieve controle), of DMSO (0,25%, negatieve controle) voor 3 uur bij 4 °c. Inocula van putten werden verzameld in buizen, gewassen met PBS tweemaal, vast, en gekleurd met anti-VP1 antilichaam gevolgd door Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam voor flow cytometrie detectie van oppervlaktegebonden virussen. Gekwantificeerde gegevens van de gedetecteerde fluorescentie signalen werden uitgezet als de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten in staafdiagram als ' virus binding (%) '. *p < 0,05 vergeleken met de ' DMSO ' controle behandeling. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van eenrichtings analyse van variantie. De representatieve Flowcytometrie histogrammen van CHLA (C), pug (D), en heparine (E) behandelingen worden getoond. Dit cijfer is aangepast uit verwijzing9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: CHLA en Pug inactiveren Cell-Free CVA16 virusdeeltjes. A) Schematische voorstelling van de virale inactivatie test. B) CVA16 (106 Pfu/well) werd behandeld met CHLA (20 μm) of pug (25 μm) en onmiddellijk gemengd voor kortdurende inactivatie of geïnincubeerd gedurende 1 uur bij 37 °c voor langdurige inactivatie alvorens te worden verdund 50-fold tot een niet-effectieve concentratie van de test verbindingen vóór het inoculeren op RD-cellen (uiteindelijke virusconcentratie = 50 PFU/well). DMSO (0,25%) werd gebruikt als een negatieve controle. Experimenten werden geanalyseerd door plaque assay met behulp van kristalviolet kleuring 72 h post-infectie. Getoonde gegevens zijn de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten. *p < 0,05 in vergelijking met de respectievelijke groep ' alleen virus '. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van eenrichtings analyse van variantie. Dit cijfer is aangepast uit verwijzing9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: CHLA en Pug richten de CVA16 capside aan bij de ingang van de Pocket. Oppervlakte projectie van de CVA16 virion deeltje met de monomere structurele pentamer afgebakend door rode lijnen (A). Extra pentamers op de virion worden weergegeven in cyaan, magenta, Indigo, brons en groen. Moleculaire docking analyse van CHLA (B, groen) en Pug (C, blauw) op de CVA16 PENTAMER (VOB: 5c4w); ingezoomde panelen worden in het geel afgebakend. VP1 = oranje, VP2 = grijs, VP3 = wit; polaire contacten worden weergegeven als zwarte streepjes. Residuen die make-up Pocket ingang zijn gekleurd rood (Ile94, ASP95, gln207, ontmoette212, ontmoette213, Lys257, thr258). D, E. Close-up zijaanzicht in de kloof waar de Pocket ingang zich bevindt en waar CHLA (D) en Pug (E) aan binden. Unieke residuen die polaire contacten van de verbindingen ' polaire contacten op de pentamer zijn gelabeld in geel (VP1), wit (VP2), en in zwart (VP3) lettertypen. De witte stippellijn geeft de Pocket entrance regio aan. Dit cijfer is aangepast uit verwijzing9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit verslag hebben we de protocollen beschreven die nuttig zijn voor de identificatie van antivirale kandidaten die een virus vermelding targeten, met name tegen de niet-omhulde CVA16. De assays zijn ontworpen op manieren om de vroege gebeurtenissen tijdens virale binnenkomst te ontleden, wat nuttig is om het mechanisme (s) van actie en mogelijke doel (en) van de antivirale activiteit van de test agenten te verduidelijken. De ' time-of-drug-additie assay ' maakt het mogelijk om het potentiële doelwit van de teststoffen in grote lijnen te bepalen, bijvoorbeeld de niet-geïnfecteerde gastheer cellen (voorbehandelings analyse), de virusdeeltjes of de interacties met het hostceloppervlak (co-additie analyse ), of de met virus geïnfecteerde host-cel tijdens de virale replicatieve fase (post-infectie analyse). Deze bepaling alleen kan de methode van interactie van de verbindingen bepalen (bijvoorbeeld co-optellen) die leidt tot de daaropvolgende assays zoals beschreven in dit Protocol (bijv. virale inactivatie assay en bindende analyse). Wasstappen zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de onderzochte behandelingsmethode specifiek is voor de geanalyseerde. Het gebruik van de ' flow cytometrie-gebaseerde binding assay ' helpt bij het beoordelen van de invloed van de verbindingen specifiek op de virus binding met de host-cel. Het handhaven van de temperatuur van het experiment bij 4 °C is belangrijk voor de uiteindelijke opsporing van de virionen op het celoppervlak, omdat deze temperatuur virale binding toestaat, maar geen binnenkomst. De ' virale inactivatie test ' kan helpen om de potentiële fysieke interactie van de geneesmiddel verbindingen met de celvrije virusdeeltjes te bepalen. De kritieke stap is de verdunning voor het titreren van de geneesmiddel verbindingen na incubatie met het virale entmateriaal, omdat dit nodig is om een zinvolle interactie van de geneesmiddelen met het hostceloppervlak in de daaropvolgende infectie te voorkomen stap12.

Aangezien virale toegang een multi-step-gebeurtenis is, kan een virale entry inhibitor klasse van antivirale middelen mogelijk verschillende soorten mechanismen uitoefenen, waaronder: (1) modulerende celoppervlakte ingangs factoren/receptoren of de bijbehorende signalering trajecten; (2) invloed hebben op de vloeibaarheid of integriteit van de celmembraan; (3) gericht op elektrostatische of van der Waals interacties tussen de virusdeeltjes en het hostceloppervlak; 4) het induceren van fysische veranderingen in de virionen zoals deeltjesbreuk of aggregatie; (5) binding aan virale glycoproteïnen of capside-eiwitten en het voorkomen van hun functies of conformationele veranderingen; (6) het blokkeren van fusie-geassocieerde mechanismen; en (7) het vrijkomen van virale genoom in de hostcel voorkomen. De analyses die in dit rapport worden beschreven, kunnen daarom helpen wijzen op de hierboven vermelde potentiële actie modi die verder kunnen worden gevalideerd door aanvullende experimenten. Ten slotte is de hier beschreven ' moleculaire docking analyse ' instrumentaal om potentiële interactie gebieden tussen de geneesmiddel verbindingen en de virusdeeltjes te voorspellen, en als zodanig kan het helpen identificeren van kandidaat virale capside of glycoproteïne bindmiddelen en de beoogde residuen op de virusdeeltjes. Echter, deze voorspellingen zijn afhankelijk van de docking-software, en de resolutie en de nauwkeurigheid van de virale eiwit kristalstructuren. Het is belangrijk op te merken dat de optionele beperkte docking-methode in stap 5.3.2 is toegevoegd omdat vaak bij het gebruik van virale structurele eiwitten als de ' receptor ' molecuul, de ligand kan eventueel binden aan regio's normaal niet toegankelijk of blootgesteld aan het oppervlak ( bijvoorbeeld, onder de oppervlakte van de virion capside tegenover de binnenkant van de virion, transmembraan gebieden van envelop glycoproteïnen, enz.). Als u het zoekvak opmaakt, kunnen alleen toegankelijke regio's van het virale eiwit worden getarget en worden eventuele onrealistische interacties voorkomen. Moleculair docking is afhankelijk van gekristalliseerde structuren, maar recente ontwikkelingen in homologiemodellering hebben de analyse van niet-uitgekristalliseerde structuren mogelijk gemaakt door de aminozuur volgorde op een nauw verwante gekristalliseerde structuur15te monteren. Dit heeft toegestaan dat meer structuren worden geanalyseerd en de verkregen informatie kan nuttig zijn voor verdere studies, met inbegrip van mutationele analyses die kunnen helpen bij het valideren van de voorspelde interacties.

Concluderend, de assays en protocollen die in dit verslag worden beschreven, zijn specifiek gericht op de identificatie van kandidaatantivirale middelen die gericht zijn op virale binnenkomst, en geven informatie over welke stap van de virale invoer de test agent target, of zij Communiceer met gratis virusdeeltjes en het voorspellen van mogelijke drugs interactie sites op de virions. Deze types van assays kunnen worden herhaald op andere niet-omhulde virussen of aangepast aan omhulde virussen als een methode voor het screenen van antivirale geneesmiddelen verbindingen voor mogelijke remmers van virale binnenkomst. Het gebruik van een dergelijke mechanisme-gestuurde benadering om antivirale kandidaten te identificeren kan helpen bij het versnellen van het proces van Geneesmiddelenontwikkeling en de reikwijdte van antivirale therapieën uitbreiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Joshua Beckham aan de Universiteit van Texas in Austin voor technische ondersteuning met moleculaire docking. Deze studie werd deels gesteund door de financiering van het ministerie van Wetenschappen en technologie van Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 naar C.-J.L. en L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 en MOST107-2320-B-038-034-MY3 naar L.-T.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
  10. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. 3rd edn, ASM Press. (2008).
  11. Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
  12. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. e53124 (2015).
  13. Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
  15. Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics