Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Immunology and Infection

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Summary

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

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Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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Abstract

Ensaios antivirais que examinam mecanisticamente a entrada viral são pertinentes para discernir em que etapa os agentes avaliados são mais efetivos e permitem a identificação de inibidores da entrada viral do candidato. Aqui, apresentamos as abordagens experimentais para a identificação de pequenas moléculas capazes de bloquear a infecção pelo coxsackievirus não envelopado A16 (CVA16) através da segmentação das partículas de vírus ou etapas específicas na entrada viral precoce. Os ensaios incluem a análise do tempo de adição de drogas, o ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo e o ensaio de inativação viral. Nós igualmente apresentamos um protocolo de encaixe molecular que utiliza proteínas do capsídeo do vírus para prever os resíduos potenciais alvejados pelos compostos antivirais. Estes ensaios devem ajudar na identificação de agentes antivirais candidatos que atuam na entrada viral. As direções futuras podem explorar esses possíveis inibidores para o desenvolvimento de drogas.

Introduction

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.

CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ' Canyon ' que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor3. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.

As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo--droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)7. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas7. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa8. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.

Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA169. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.

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Protocol

Nota: Todas as infecções da cultura e do vírus de pilha devem ser conduzidas em capas certificadas da Biossegurança que são apropriadas para o nível da biossegurança das amostras que estão sendo tratadas. As duas classes de Tanina de pequenas moléculas de Ácido Chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG), que foram observadas para bloquear eficientemente a infecção por CVA169, são usadas como exemplos de agentes inibitórios candidatos. Para princípios básicos em técnicas de virologia, propagação de vírus, determinação de titer de vírus e conceitos de unidades formadoras de placas (PFU) ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é encaminhado para referência10.

1. cultura da pilha, preparação do vírus, preparação composta, e Cytotoxicity composto

  1. As células de rabdomiossarcoma humano (RD) são células hospedeiras permissivas à infecção por CVA1611. Aumente as células de RD em 10 mL do meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS), 200 U/mL de penicilina G, 200 μg/mL de estreptomicina e 0,5 μg/mL de anfotericina B em frascos T-75 a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2
  2. Prepare CVA16 propagando o vírus em pilhas do RD e determine o Titer viral em PFU/mL. Para o protocolo aperfeiçoado, refira por favor a referência11.
  3. Prepare os compostos e controles de teste usando seus respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHLA e PUG em dimetil sulfóxido (DMSO). Para todas as etapas da infecção, o meio basal consistiu em DMEM mais 2% FBS e antibióticos.
    Nota: A concentração final de DMSO nos tratamentos compostos de teste é igual ou inferior a 0,25% nos experimentos; 0,25% DMSO é incluído como um tratamento de controle negativo nos ensaios para a comparação.
  4. Realizar ensaio de citotoxicidade dos compostos de teste nas células de RD usando uma viabilidade celular determinando reagente como XTT ((2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-phenylamino)-carbonilo]-2H-hidróxido de tetrazólio). Para o protocolo detalhado, refira por favor a referência12. Determine as concentrações de citotoxicidade dos compostos de teste usando um software analítico como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de fármacos que não influenciam significativamente a viabilidade celular (≥ 95% de células viáveis) são utilizadas para o restante do estudo.

2. teste de tempo de adição de drogas

  1. Avaliar a influência de fármacos nas células hospedeiras antes da infecção viral (pré-tratamento)
    1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.
    2. Trate as células de RD com compostos de teste em concentrações não citotóxicas (determinadas a partir da etapa 1,4) em 1 mL de volume de mídia basal por 1 h ou 4 h.
    3. Células de lavagem com 1-2 mL de PBS antes de adicionar 50 PFU/poço de vírus no meio basal (volume final do iníbulo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
    4. Após a infecção, lave as monocamadas novamente usando PBS, em seguida, sobrepor com 1 ml de mídia basal contendo 0,8% metilcelulose para incubação mais a 37 ° c em uma incubadora de co2 de 5%.
    5. Após 72 h de incubação, retire a mídia de sobreposição e lave os poços usando 2 mL de PBS.
    6. Fixar os poços usando 0,5 mL de formaldeído 37% por 15 min.
    7. Retire o sobrenadante e lave novamente usando PBS.
    8. Manchar os poços usando 0,5 mL de 0,5% de solução de cristal violeta. Em seguida, retire a solução de mancha dentro de 2 min e lave os poços com um fluxo suave de água antes da secagem do ar.
    9. Conte as chapas virais colocando a placa em uma caixa de luz branca. Calcule o percentual (%) Infecção CVA16 como segue: (média # de placa Virus + droga /média # de placa Virus + DMSO controle) × 100%.
  2. Para avaliar o efeito da adição dos fármacos e do vírus concomitantemente (coadição)
    1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.
    2. Trate as células de RD com os compostos de teste nas concentrações apropriadas e 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do iníbulo é 300 μL) simultaneamente para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
    3. Lave as células com 1 mL de PBS e, em seguida, sobrepor-se com 1-2 mL de meios basais contendo 0,8% de metilcelulose para posterior incubação a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 .
    4. As chapas virais da mancha com violeta de cristal após a infecção do borne de 72 h e determinam a infecção de% CVA16 como descrita acima.
  3. Avaliar o efeito do tratamento medicamentoso após a entrada viral (pós-infecção)
    1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.
    2. Inocular as células de RD com 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do inátodo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
    3. Lave os poços com 1-2 mL de PBS e sobreponha as células com meios basais contendo 0,8% de metilcelulose e as concentrações apropriadas de compostos de teste.
    4. As chapas virais da mancha com violeta de cristal e contam após a infecção do borne de 72 h e determinam as incubações da infecção de% CVA16 descritas acima.
      Nota: Realize todas as lavas de PBS suavemente para evitar o levantamento das células.

3. ensaio de ligação à base de citometria de fluxo

  1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para conseguir um monocamada.
  2. Pré-Chill a monocamada celular a 4 ° c por 1 h.
  3. Infectar células RD com CVA16 (MOI = 100) na presença e ausência dos compostos de teste por 3 h a 4 ° c.
    Nota: Realize a inoculação viral no gelo e a incubação que se seguiu em um refrigerador de 4 ° c para manter a temperatura a 4 ° c, o que permite a ligação viral, mas não a entrada.
  4. Remova o iníbulo do vírus e lave-o uma vez com 1-2 mL de PBS gelada.
  5. Levante as células adicionando 1 mL de tampão de dissociação gelo-frio aos poços no gelo por 3 min, antes de coletar as células e ressuscita-los em buffer de citometria de fluxo de gelo-frio (1X PBS mais 2% FBS).
  6. Lave as células duas vezes usando o tampão de citometria de fluxo gelado e fixe as células com 0,5 mL de paraformaldeído a 4% por 20 min no gelo.
  7. Lave as células usando PBS para remover quaisquer vírus não acoplados ou fracamente ligados e, em seguida, manchar as células com 1 mL de anticorpo VP1 (1:2000; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo por 1 h, seguido de incubação com um secundário Alexa 488-Conjugado IgG anti-mouse (1:250; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo durante 1 h. realize lavas de PBS (3 vezes) após cada tratamento de anticorpos.
  8. Ressuscita as células em 0,5 mL do tampão de citometria de fluxo de gelo-frio e executa a análise de citometria de fluxo em um citometro de fluxo usando procedimentos padrão. Apresente dados em histogramas usando o software associado e quantificar para representação de gráfico de barras.

4. ensaio de inactivação viral

  1. Realize o ensaio de inactivação viral como descrito anteriormente12 utilizando as seguintes condições:
    -Uma concentração inicial de 106 pfu/ml de CVA16.
    -Monocamadas da pilha do RD em 12 placas do poço de uma densidade de semeadura de 2 x 105 pilhas/poço.
    -50-dobre a diluição para titulating para fora os compostos da droga tendo por resultado uma concentração final do vírus de 50 PFU/poço.
    -Lave as etapas usando 1-2 mL de PBS.
    -Sobreposição de mídia contendo 0,8% metilcelulose.
  2. Realize o leitura final da infecção viral usando a mancha violeta de cristal do procedimento viral das chapas como detalhado acima.

5. análise de ancoragem molecular

  1. Baixar moléculas 3D de compostos de teste de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Se as moléculas não tiverem uma estrutura 3D carregada, faça o download das estruturas 2D ou use a sequência de cordas SMILES e transforme-as em moléculas 3D através de um programa molecular (por exemplo, CORINA).
  2. Baixe a unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) e prepare o modelo de estrutura viral usando um programa de biocomputação (por exemplo, UCSF Chimera). Por exemplo, no caso da estrutura de cristal de virion CVA16 maduro (PDB: 5C4W)3, exclua os solventes do arquivo PDB, substitua cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca Dunbrach 2010 Rotamer e adicione hidrogênios e encargos à estrutura como relatado anteriormente13. As metas de encaixe podem ser quaisquer proteínas virais relevantes para a análise pretendida com uma informação de montagem biológica (Protein Data Bank).
  3. Os compostos de teste de doca para a unidade de vírus preparada usando, por exemplo, UCSF Chimera, e analisar os arquivos de saída com um software de visualização (por exemplo, autodock vina, PyMol):
    1. Carregue o arquivo composto de teste em UCSF Chimera como o ' ligand ' e realize o encaixe cego selecionando toda a proteína viral preparada como o ' receptor '. Use o mouse ou o trackpad do computador para redimensionar o volume de pesquisa para todo o ' receptor '. Em ' Opções avançadas ', permitir que o número de modos de ligação para ser no máximo. Os frames de encaixe serão classificados automaticamente da mais alta à mais baixa energia obrigatória.
    2. Opcional Além do encaixe cego, confinar o local de encaixe na proteína viral em regiões de interesse derivadas dos resultados de encaixe cego usando o mouse ou o trackpad novamente para reduzir o volume de pesquisa (por exemplo, 100 å x 100 å x 100 å). Esta etapa ajuda a confirmar os resultados de encaixe cego e aumenta a especificidade.
    3. Use um sistema gráfico molecular (por exemplo, PyMol) para analisar as posições dos modos de vinculação carregando o arquivo de encaixe. Encontre contatos polares do composto à proteína viral selecionando o ' ligand ' e identificando contatos polares com a opção "a todos os átomos"; examinar os resultados.

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Representative Results

O teste de adição de tempo de fármaco é indicado na Figura 1 e mostra a influência do tratamento usando as pequenas moléculas CHLA e Pug na infecção CVA16 ou entrada pré-viral (pré-tratamento), durante a entrada viral (coadição), ou entrada pós-viral ( pós-infeção). Ambas as pequenas moléculas produziram apenas impacto marginal contra a infectividade do CVA16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral (Figura 1a) ou no tratamento pós-infecção (Figura 1C). Em contrapartida, a CHLA e a PUG abrogaram eficientemente a infecção CVA16 por > 80% no tratamento de coadição (Figura 1b). Estas observações sugerem conseqüentemente que os dois compostos são os mais eficazes quando são simultaneamente atuais com as partículas do vírus na superfície da pilha do anfitrião durante a infecção.

Na Figura 2, a análise de ligação à base de citometria de fluxo (ilustrada esquematicamente na Figura 2a) confirma que os dois taninos impedem a entrada de CVA16 impedindo a ligação das partículas virais às células hospedeiras. Os dados de quantificação na Figura 2b mostram que a quantidade de vírus detectada na superfície da célula RD na presença dos dois fármacos é inferior a 10%, semelhante ao controle positivo da heparina, que é conhecido por prevenir o apego CVA1614. A Figura 2C, 2D, e 2e descrevem os histogramas associados da citometria de fluxo onde o deslocamento da faixa devido à deteção do CVA16 na superfície da pilha do RD é reduzido significativamente quando o chla e o Pug estão atuais.

A Figura 3a retrata como o experimento de inativação viral foi realizado. O composto da droga foi misturado com as partículas do vírus CVA16 e incubadas por 1 h (a longo prazo) antes da etapa da diluição, ou misturado e diluído imediatamente (a curto prazo) antes da infecção. Como mostrado na Figura 3B, uma pré-incubação das partículas CV16 com os agentes de teste para 1 h conduziu a uma proteção quase completa das células de RD contra a infecção viral em comparação com a incubação de curto prazo e o controle DMSO. Os resultados sugerem, portanto, que ambos os CHLA e PUG interagem com as partículas CVA16 e são capazes de torná-los inativos na infecção subsequente.

Uma vez que nossos dados indicam que os compostos de drogas podem inativar diretamente as partículas de CVA16 e, portanto, identificar o próprio virion como um alvo plausível de sua atividade antiviral, utilizamos o encaixe molecular para prever a interação (s) potencial entre esses agentes e o pentamer capsídeo CVA16. A figura 4a mostra uma projeção superficial do pentâmero CVA16 que compõe o capsídeo icosaédrico do virion CVA16. A ancoragem molecular dos taninos CHLA (Figura 4B; verde) e Pug (Figura 4C; azul) indicam que ambos estão previstos para se vincular na região do Cânion do pentamer CVA16. Especificamente, ambas as pequenas moléculas ligadas logo acima da entrada de bolso (Figura 4B e 4C, painéis com zoom), que detém o fator de bolso e desempenha um papel importante para a mediação de ligação CVA16 e entrada na célula hospedeira. Tanto CHLA e PUG, portanto, parecem mascarar a região de entrada de bolso, o que teoricamente obstruiria interações entre as partículas de vírus e os receptores de células hospedeiras. A Figura 4D e 4e indicam os resíduos únicos previstos nos contatos polares de chla e Pug, respectivamente, em torno da entrada do bolso, com a maioria dessas interações ocorrendo com VP1 para ambos os compostos e os 3 aminoácidos ASN85 , Lys257e ASN417 estando em comum entre os dois taninos.

Figure 1
Figura 1: tempo-de-fármaco-efeito de adição de CHLA e Pug contra CVA16 infectividade. As células RD foram tratadas com CHLA (20 μM) ou PUG (25 μM) em diferentes épocas de inoculação CVA16 (50 PFU/poço). DMSO (0,25%) o tratamento foi incluído como o controle negativo e todos os ensaios foram analisados pelo ensaio da chapa usando a coloração violeta de cristal 72 h após a incubação. (A) para o pré-tratamento, as pilhas foram incubadas com os compostos do teste para 1 h ou 4 h e foram lavadas então antes da infecção CVA16. (B) para ensaios de coadição, as células foram administradas com drogas e vírus simultaneamente durante 1 h e depois lavadas. (C) na pós-infecção, as células foram infectadas com CVA16 por 1 h, lavadas e, em seguida, tratadas com compostos de teste. Os dados mostrados são os meios ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. *p < 0, 5 em comparação com o respectivo grupo ' Virus only '. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância unidirecional. Este número foi adaptado da referência9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: chla e Pug abolir CVA16 ligação à célula hospedeira. (A) esquema do ensaio de ligação à base de citometria de fluxo. (B) as células de RD (2 x 105 células/poço) foram infectadas com CVA16 (moi = 100) na presença ou ausência de chla (20 μm), Pug (25 μm), heparina solúvel (500 μg/ml, controle positivo) ou DMSO (0,25%, controle negativo) por 3 h a 4 ° c. Inocula dos poços foi coletado em tubos, lavado com PBS duas vezes, fixado, e corado com anticorpo VP1 seguido de Alexa 488-anticorpo secundário conjugado para detecção de citometria de fluxo de vírus ligados à superfície. Os dados quantificados dos sinais de fluorescência detectados foram plotados como as médias ± DP de três experimentos independentes em gráfico de barras como ' vinculação de vírus (%) '. *p < 0, 5 comparado com o tratamento de controle ' DMSO '. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância unidirecional. Os histogramas representativos de citometria de fluxo dos tratamentos CHLA (C), Pug (D) e heparina (e) são mostrados. Este número foi adaptado da referência9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: CHLA e Pug inativam partículas de vírus CVA16 livres de células. (A) esquema do ensaio de inactivação viral. (B) CVA16 (106 Pfu/poço) foi tratado com Chla (20 μm) ou pug (25 μm) e misturado imediatamente para a inactivação a curto prazo ou incubado por 1 h a 37 ° c para a inactivação a longo prazo antes de ser diluído 50 vezes a uma concentração não-eficaz de teste compostos antes da inocular em células de RD (concentração final de vírus = 50 PFU/poço). DMSO (0,25%) foi utilizado como controle negativo. Os experimentos foram analisados por ensaio de placa bacteriana com coloração violeta cristalina 72 h pós-infecção. Os dados mostrados são os meios ± DP de três experimentos independentes. *p < 0, 5 em comparação com o respectivo grupo ' Virus only '. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância unidirecional. Este número foi adaptado da referência9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: chla e Pug visam o capsídeo CVA16 perto da entrada de bolso. Projeção superficial da partícula do virion CVA16 com o pentâmero estrutural monomérico delineado por linhas vermelhas (a). Pentâmeros adicionais no virion são mostrados em ciano, magenta, Indigo, bronze, e verde. Análise de encaixe molecular de chla (B, verde) e Pug (C, azul) sobre o pentâmero CVA16 (APO: 5c4w); os painéis com zoom são demarcados em amarelo. VP1 = laranja, VP2 = cinza, VP3 = branco; contatos polares são mostrados como traços pretos. Resíduos que a entrada de bolso make-up são de cor vermelha (Ile94, ASP95, gln207, Met212, Met213, Lys257, thr258). D, E. Vista lateral do close-up na garganta onde a entrada do bolso é ficada situada e onde CHLA (D) e Pug (e) ligam a. Os resíduos únicos que são contatos polares dos contatos polares dos compostos no pentâmero são rotulados em amarelo (VP1), branco (VP2) e em fontes pretas (VP3). A linha tracejada branca indica a região de entrada de bolso. Este número foi adaptado da referência9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste relato, foram descritos os protocolos que são úteis para a identificação de candidatos antivirais que visam a entrada viral, em particular contra os não CVA16. Os ensaios são projetados de forma a dissecar os acontecimentos precoces durante a entrada viral, o que é útil para esclarecer o mecanismo (s) de ação e potencial alvo (s) da atividade antiviral dos agentes de teste. O "teste de tempo de adição de drogas" permite determinar amplamente o potencial alvo dos compostos de teste, por exemplo, as células hospedeiras não infectadas (análise de pré-tratamento), as partículas de vírus ou suas interações com a superfície da célula hospedeira (análise de co-adição ), ou a célula hospedeira infectada pelo vírus durante a fase replicativa viral (análise pós-infecção). Este ensaio isoladamente pode determinar o método de interação dos compostos (por exemplo, coadição) que leva aos ensaios subsequentes descritos neste protocolo (por exemplo, ensaio de inativação viral e análise vinculativa). As etapas de lavagem são críticas para garantir que o método de tratamento examinado seja específico ao analisado. O uso do "ensaio de ligação à base de citometria de fluxo" ajuda a avaliar a influência dos compostos especificamente na ligação de vírus à célula hospedeira. Manter a temperatura do experimento a 4 ° c é importante para a detecção final dos virions na superfície celular, pois esta temperatura permite a ligação viral, mas não a entrada. O ' ensaio de inativação viral ' pode ajudar a determinar a interação física potencial dos compostos de drogas com as partículas de vírus livres de células. O passo crítico é a diluição para titular os compostos farmacológicos após incubação com o iníbulo viral, pois isso é necessário para evitar qualquer interação significativa dos fármacos com a superfície celular hospedeira na etapa subsequente da infecção12.

Uma vez que a entrada viral é um evento em várias etapas, uma classe de inibidor de entrada viral de agentes antivirais poderia exercer vários tipos de mecanismos, incluindo: (1) modulando fatores de entrada de superfície celular/receptores ou suas vias de sinalização associadas; (2) afetando a fluidez ou integridade da membrana celular; (3) segmentação eletrostática ou Van der Waals interações entre as partículas de vírus e a superfície da célula hospedeira; (4) induzindo alterações físicas aos virions, tais como ruptura de partículas ou agregação; (5) ligação a glicoproteínas virais ou proteínas de capsídeo e prevenção de suas funções ou alterações conformacionais; (6) bloqueio dos mecanismos associados à fusão; e (7) impedir a liberação do genoma viral dentro da célula hospedeira. As análises descritas neste relatório podem, portanto, ajudar a apontar para os modos de ação potenciais listados acima, que podem ser mais validados por experimentos adicionais. Por último, a ' análise de ancoragem molecular ' descrita aqui é instrumental para prever possíveis regiões de interação entre os compostos de drogas e as partículas de vírus, e como tal pode ajudar a identificar o candidato a capsídeo viral ou aglutinantes de glicoproteína e o alvo resíduos nas partículas de vírus. No entanto, essas previsões dependem do software de encaixe e da resolução e precisão das estruturas de cristais de proteínas virais. É importante notar que o método de encaixe confinado opcional na etapa 5.3.2 foi adicionado porque muitas vezes ao usar proteínas estruturais virais como a molécula do ' receptor ', o ligante pode possivelmente se ligar a regiões normalmente não acessíveis ou expostas na superfície ( por exemplo, a superfície do capsídeo do virion que enfrenta o interior do virion, regiões do transmembrana de glycoproteínas do envelope, etc.). Confinar a caixa de pesquisa permite que apenas as regiões acessíveis da proteína viral a ser alvejado e regras para fora todas as interações irreais. O encaixe molecular é dependente das estruturas cristalizadas, mas os avanços recentes na modelagem da homologia permitiram a análise de estruturas não-cristalizadas ajustando sua seqüência do amino-ácido em uma estrutura cristalizada estreitamente relacionada15. Isso permitiu analisar mais estruturas e as informações adquiridas podem ser úteis para estudos adicionais, incluindo análises mutacionais que podem ajudar a validar as interações previstas.

Em conclusão, os ensaios e protocolos descritos neste relatório são especificamente atendidos para identificar os agentes antivirais candidatos que visam a entrada viral, e fornecer informações sobre qual etapa do processo de entrada viral o agente de teste se destina a, se eles interagir com as partículas de vírus livres, e prever possíveis locais de interação medicamentosa sobre os virions. Esses tipos de ensaios podem ser repetidos em outros vírus não envelopado ou adaptados a vírus envoltos como um método de triagem de compostos antivirais de drogas para possíveis inibidores da entrada viral. Usar essa abordagem orientada por mecanismos para identificar candidatos antivirais poderia ajudar a agilizar o processo de desenvolvimento de drogas e ampliar o escopo da terapêutica antiviral.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Acknowledgments

Os autores são gratos ao Dr. Joshua Beckham na Universidade de Texas em Austin para o apoio técnico com encaixe molecular. Este estudo foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 para C.-JL e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

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References

  1. Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
  10. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. 3rd edn, ASM Press. (2008).
  11. Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
  12. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. e53124 (2015).
  13. Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
  15. Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).

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