Author Produced

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het oculaire oppervlak wordt onderworpen aan regelmatige slijtage als gevolg van verschillende omgevingsfactoren. Blootstelling aan UV-C-straling vormt een gevaar voor de gezondheid op het werk. Hier tonen we de blootstelling van primaire stamcellen van het oogoppervlak van de muis aan UV-C-straling. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming is de uitlezing van de omvang van oxidatieve stress / schade. In een experimentele in vitro omgeving is het ook essentieel om het percentage dode cellen te beoordelen dat wordt gegenereerd als gevolg van oxidatieve stress. In dit artikel zullen we de 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat (DCFDA) kleuring van UV-C blootgestelde muis primaire oculaire oppervlakte stamcellen en hun kwantificering op basis van de fluorescerende beelden van DCFDA vlekken. DCFDA kleuring komt direct overeen met ros generatie. We tonen ook de kwantificering van dode en levende cellen door gelijktijdige kleuring met respectievelijk propidiumjodide (PI) en Hoechst 3332 en het percentage DCFDA (ROS-positieve) en PI-positieve cellen.

Introduction

Het oculaire oppervlak (OS) is een functionele eenheid voornamelijk samengesteld uit de buitenste laag en klierepithelia van hoornvlies, lachrymale klier, meibomian klier, bindvlies, een deel van de ooglid marges en innervations die transduce signalen1. De transparante koepelvormige hoornvlieslaag richt licht op het netvlies. Dit avasculaire weefsel bestaat uit cellulaire componenten zoals epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen en acellulaire componenten zoals collageen en glycosaminoglycans2. Het gebied wordt afgevoerd door tranen die ook de meeste voedingsstoffen leveren. De anatomische positie van het OS dwingt het om in direct contact met de externe omgeving te zijn, vaak bloot stellen aan verschillende harde componenten zoals fel licht, microben, stofdeeltjes en chemicaliën. Deze factor predisponeert het OS voor lichamelijkletsel en maakt het gevoelig voor verschillende ziekten.

Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het gebrek aan evenwicht tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de endogene anti-oxidantafmechanismen3. ROS worden ingedeeld in reactieve moleculen en vrije radicalen, die beide afkomstig zijn van moleculaire zuurstof (O2) door mitochondriale oxidatieve fosforylatie4. De eerste groep bestaat uit niet-radicale soorten zoals waterstofperoxide (H2O2),singlet zuurstof (1O2) en de laatste omvat soorten zoals superoxide anionen (O2-), en hydroxyl radicalen(•OH), onder anderen. Deze moleculen zijn bijproducten van normale cellulaire processen en hun rollen zijn betrokken bij belangrijke fysiologische functies zoals signaaltransductie, genexpressie en hostdefense5. Een verbeterde productie van ROS is bekend te worden gegenereerd in reactie op factoren zoals pathogene invasie, xenobiotica, en blootstelling aan ultraviolette (UV) straling4. Deze overproductie van ROS resulteert in oxidatieve stress die leidt tot de schade van moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en lipiden6.

Natuurlijk zonlicht, de meest overheersende bron van UV-straling, bestaat uit UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) en UV-C (290-200 nm)7. Een omgekeerde correlatie tussen de golflengte en spectrale energieën is gemeld. Hoewel natuurlijke UV-C-straling door de atmosfeer wordt geabsorbeerd, stoten kunstmatige bronnen zoals kwiklampen en lasinstrumenten uit en vormen daarom een beroepsrisico. Symptomen van blootstelling aan de ogen zijn fotokeratitis en photokeratoconjunctivitis8. Productie van ROS is een van de belangrijkste mechanismen van het toebrengen van UV-geïnduceerde cellulaire schade9. In de huidige studie tonen we de detectie van ROS aan met behulp van de 2',7'-Dichloordihydrofluorescelaat (DCFDA) kleuringsmethode in de primaire oculaire oppervlaktecellen/stamcellen van de muis die zijn blootgesteld aan UV-C. De groene fluorescentie werd vastgelegd met behulp van fluorescerende microscopie. Cellen werden tegengekleurd met twee kleurstoffen, Hoechst 33342 en rode propidiumjodide, om de levende en dode cellen te bevlekken, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het experiment werd uitgevoerd op primaire oculaire cellen/ stamcellen afgeleid van het Zwitserse albino muisoog. Het gebruik van dieren voor het oogsten van de ogen voor dit experiment werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor het ethisch onderzoek van dieren, Yenepoya (geacht universiteit) (IEAC-goedkeuringsnummer, 6a/19.10.2016).

1. Voorbereidingen van reagentia

OPMERKING: De afleiding van primaire cellen/stamcellen van het oogoppervlak van de muis valt buiten het bereik van dit protocol. Daarom tonen we de UV-C blootstellingdoses, reagensvoorbereiding voor de beoordeling van ROS, levende en dode cellen en hun kwantificering. Raadpleeg tabel 1 voor de respectieve volumes van de reagentia (10% foetaal runderserum, DCFDA, Hoechst en propidiumjodidestockoplossingen die moeten worden toegevoegd voor het verkrijgen van de uiteindelijke kleuroplossing).

  1. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM DCFDA door 25 mg DCFDA poeder op te lossen in 5,13 mL DMSO. Aliquot 250 μL elk in amberkleurige 1,5 mL buizen en op te slaan op -20 °C.
  2. Bereid een voorraadoplossing van 10 mg/mL (16,23 mM oplossing) Hoechst 33342 door het oplossen van de volledige inhoud van de 25 mg flacon in 2,5 mL gedeïoniseerd water. Maak aliquots van 100 μL in amberkleurige microcentrifugebuizen en bewaar maximaal 6 maanden bij 2-6 °C. Voor opslag op langere termijn, opslaan op -20 °C.
  3. Bereid een voorraadoplossing van 1 mg/mL propidiumjodide in gedeïoniseerd water, aliquot 1 mL elk in amberkleurige 1,5 mL buizen, en op te slaan op 4 °C.

2. Celbeplating en UV-C-bestraling

  1. Voor het platen, scheiden van de muis primaire oculaire oppervlaktecellen geïsoleerd in ons laboratorium (ongepubliceerde resultaten; dergelijke cellen zijn een mengsel van hoornvlies epitheel, stromal cellen en keratocyten) met behulp van een zachte cel dissociatie middel(Tabel van materialen).
  2. Plaat 0,2 x 106 muis primaire oculaire oppervlaktecellen in 35 mm 0,2% kelder membraan matrix gecoate celcultuur gerechten in 2,5 mL van complete media. Incubeer 's nachts bij 37 °C in een 5% CO2 en bevochtigde couveuse.
    OPMERKING: Volledige media voor het kweken van primaire cellen van het oogoppervlak van de muis bestaat uit DMEM hoge glucose met 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% niet-essentieel aminozuur (NEAA), 1% natriumpyruvaat en 0,1% β-mercaptoethanol.
  3. Voordat u de cellen blootstelt aan verschillende doses UV-C, gooi u het maximale mediavolume weg en laat u slechts een dunne laag media (~ 500 μL) in contact met de cellen houden, net genoeg om ze te bedekken.
  4. Neem de gerechten één voor één mee naar de UV-C bron/kamer (de onderste kamer van een hybridisatieoven/UV-kruislinker; Materiaaltabel). Plaats de schotel in de kamer en verwijder het deksel van de schotel. De open dekselpositie van de schotel zorgt ervoor dat de cellen de maximale UV-C-dosis krijgen tijdens de UV-C-blootstelling.
  5. Stel de cellen bloot aan verschillende kwaliteiten/doses UV-C: 1 J/m2, 100J/m2, 1.000 J/m2 en 10.000 J/m2.
  6. Vervang na de UV-C-belichting het deksel van elk van de gerechten onmiddellijk en haal ze uit de UV-C-bronkamer.
  7. Breng elk van de gerechten naar de laminaire luchtstroom kap en vul elk van de gerechten met 2 mL verse complete media.
  8. Incubeer de cellen 3 uur in een 37 °C CO2 incubator. Drie uur incubatie na UV-C blootstelling is optimaal te visualiseren en kwantificeren van de vroege effecten.

3. Voorbereiding van levende celkleuringsmedia

  1. Bereid de vlekken media vers tijdens de laatste 15 min van de 3 uur cel incubatie na UV-C blootstelling.
  2. Verwarm 10 mL van de kleuringsmedia met 10% FBS-DMEM aangevuld met 1% Pen-Strep tot 37 °C.
  3. Voeg 5 μL van 10 mM DCFDA toe; 5 μL van 10 mg/mL Hoechst-oplossing en 200 μL van 1 mg/mL propidiumjodide. De uiteindelijke concentraties van DCFDA, Hoechst en PI zijn respectievelijk 5 μM, 5 μg/mL en 20 μg/mL in de 10 mL aan kleuringsmedia.

4. DCFDA-kleuring van uv-c-blootgestelde primaire oogcellen van de muis

  1. Na 3 uur incubatie van UV-C blootgestelde primaire oogcellen van de muis bij verschillende doses, zuigt de media aan uit de 35 mm gerechten.
  2. Vul met 2 mL vers bereide DCFDA kleuring sing media aan elk van de gerechten zachtjes vanaf de zijkanten.
  3. Incubeer de cellen met de kleuringsmedia gedurende 15 min in het donker in een 37 °C CO2 incubator voor levend-cel vlekken.

5. Bezichtiging van DCFDA (ROS), Hoechst en PI bevlekte cellen

  1. Gooi na de incubatietijd de kleuringsmedia weg.
  2. Voeg verse complete media toe aan de cellen en observeer de cellen onder een omgekeerde fluorescerende microscoop/celimager(Tabel van materialen). Fotografeer de gewenste velden: helderveld, blauwe fluorescentie, rode fluorescentie, groene fluorescentie.
    OPMERKING: De blauwe fluorescerende gekleurde cellen zijn de kernen, de groene fluorescentie is voor ROS genererende cellen en de rode fluorescentie geeft de PI positieve dode cellen aan.

6. Kwantificering van gekleurde cellen (Hoechst-Blue, PI-Dead en Green-ROS) met behulp van beeldvormingstechnieken

  1. Exporteer de beelden die onder de omgekeerde fluorescerende microscoop/celimager zijn vastgelegd naar ImageJ voor kwantificering.
  2. Open elk van de beelden een voor een, met behulp van elk kanaal (dat wil zeggen, blauw (Nuclei / Hoechst), groen (ROS), rood (Dead / PI positief)) achtereenvolgens, voor het tellen. Ga van de onbelichte besturing en ga achtereenvolgens naar 1, 100, 1.000 en 10.000 J/m-2.
  3. Tel de cellen met behulp van de cel teltool gemarkeerd als een kruis in het softwaremenu voor elk van de velden [blauw positief (Hoechst positief; kernen), rood positief (PI positief; dode cellen); groen positief (ROS)] in elk van de beelden die overeenkomen met elk van de Behandelingen.
  4. Tel door op elk van de specifieke signalen in elk van de velden te klikken. Als u bijvoorbeeld op de blauw/Hoechst bevlekte kernen klikt, geeft het totale aantal kernen in een bepaald veld.
  5. Bereken de resultaten als het percentage celsterfte door UV-schade (aantal PI-positieve cellen x 100 gedeeld door het aantal Hoechst positieve cellen) en het percentage ROS-productie door UV-schade (aantal DCFDA-positieve cellen x 100 gedeeld door het aantal Hoechst-positieve cellen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DCFDA is een kleurloze kleurstof die een chemisch gereduceerde vorm van fluorescein gebruikt als een indicator voor het opsporen van ROS in cellen. Deze kleurstof wordt gevangen in cellen en is gemakkelijk geoxideerd tot fluorescerende dichloordihydrofluoresceine (DCF), die een groene fluorescentie uitzendt. Deze fluorescentie kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende microscopie. De cellen kunnen als volgt worden gevisualiseerd en gecorreleerd met ROS-accumulatie: i) levende cellen zonder ROS zenden hoge blauwe fluorescentie uit; ii) levende cellen met ROS-accumulatie een hoog blauw fluorescentie met een laag groen fluorescentie uitzenden; en iii) dode cellen met ROS-accumulatie stoten een laag blauw fluorescentie uit met een hoge rode en hoge groene fluorescentie.

Controlecellen en cellen blootgesteld aan 1 J/m2 uv-C vertoonden geen DCFDA/ROS en PI-positieve cellen. De UV-C onbelichte controle toonde nucleaire vlekken alleen zoals aangegeven door de Hoechst kleuring (Figuur 1). Er werden echter geen PI- of DCFDA-positieve cellen gezien in de uv-C-niet-belichte controlecellen(figuur 1).

Cellen blootgesteld aan 100 J/m2 van UV-C vertoonde lage ROS en PI positieve cellen. Primaire cellen van het oogvormige oppervlak van de muis bij blootstelling aan UV-C bij een dosis van 100 J/m2 vertoonden ongeveer 5% co-kleuring van DCFDA en PI, wat duidt op de vorming van ROS- en celsterfte in 5% van de cellen (figuur 1).

Cellen blootgesteld aan 1.000 J/m2 van UV-C vertoonden 60%–70% ROS en PI positieve cellen. Primaire cellen van het oogvormige oppervlak van de muis bij blootstelling aan UV-C bij een dosis van 1.000 J/m2 vertoonden ongeveer 70% co-kleuring van DCFDA en PI, wat duidt op de vorming van ROS- en celsterfte in 70% van de cellen (figuur 1).

Cellen blootgesteld aan 10.000 J/m2 van UV-C vertoonden 100% ROS positieve cellen en ~ 100% celdood. De hoogste UV-C dosis (10.000 J/m2) bij blootstelling aan de muis oculaire primaire cellen resulteerde in 100% celdood (PI positieve cellen) en ROS-vorming (DCFDA-kleuring), wat de hoogste dodelijkheid van deze specifieke UV-C-dosis(figuur 1 )aangeeft.

Cellen die werden behandeld met 1 J/m2 UV-C-straling toonden geen accumulatie van ROS en het percentage levende cellen in deze dosis was vergelijkbaar met dat van de controlecellen. Cellen toonden een aanzienlijke hoeveelheid celdood en ROS accumulatie op 100 J/m2. De hoogste hoeveelheid ROS-accumulatie en celdood werd waargenomen in cellen die werden behandeld met 10.000 J/m2 UV-C-straling.

De gekwantificeerde resultaten (percentage van de ROS-generatie en het percentage celsterfte volgens de formules in punt 6.3) werden uitgezet in de vorm van een staafgrafiek(figuur 2). De X-as vertegenwoordigt de UV-C-doses, terwijl de Y-as het percentage cellen vertegenwoordigt. De groene balk vertegenwoordigt het percentage ROS, en de rode balken vertegenwoordigen de celdood bij verschillende doses UV-C-straling (figuur 2). Het percentage ROS- en dode cellen bedroeg in de orde van 0%, 0%, 10%, 70% en 100% bij de UV-C-doses: onbelichte controle, 1 J/m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 en 10.000 J/m2, respectievelijk (figuur 2).

Figure 1
Figuur 1: Samengestelde levend-celbeelden van de primaire cellen van het muisoculaire oppervlak blootgesteld aan verschillende doses UV-C (Onbelichte controle, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Deze beelden werden vastgelegd onder verschillende filters: helderveld (voor celmorfologie), blauw (Hoechst nucleaire vlek), groen (ROS-generatie) en rood (propidiumjodide gekleurde dode cellen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Staafgrafieken met de kwantificeringsresultaten die zijn verkregen na berekening van het percentage ROS-generatie en het percentage dode cellen bij blootstelling van primaire oogvormige oppervlaktecellen van de muis aan verschillende doses UV-C-straling. De X-as vertegenwoordigt de UV-C-doses, terwijl de Y-as het percentage cellen vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Component Volume
10% Foetaal Runderserum dat DMEM bevat 9790 μL
DCFDA voorraadoplossing 5 μL
Hoechst 33342 voorraadoplossing 5 μL
Propidium-jodidevoorraadoplossing 200 μL

Tabel 1: Reagentia die nodig zijn voor de bereiding van kleuringsoplossing.

Probleem Waarschijnlijke redenen Probleemoplossing Opmerkingen
Geen of zeer weinig ROS of PI positieve cellen worden gekleurd wanneer de cellen werden behandeld met een hoge tot hoogste UV-dosis i. Gebruik van een oude kleuroplossing. i. Gebruik vers bereide kleuringoplossing. i. Eerder voorbereide kleuring oplossing leidt tot onjuiste vlekken van de cellen.
ii. Overconfluent cultuurschotel resulterend in berging van UVC schade door de cellen. ii. Plaat slechts 0,2 miljoen cellen in elke 35 mm cel kweekschotel en nooit toestaan dat de cellen te groeien voor meer dan 12 uur voordat ze bloot stellen aan UVC doses. ii. Overconfluent cellen kunnen redden van UVC schade, en dus geen of weinig ROS en PI positieve cellen zullen worden gevisualiseerd.

Tabel 2: Probleemoplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De DCFDA kleuring methode hier beschreven maakt de visualisatie van ROS in de muis primaire oculaire levende cellen behandeld met UV-C straling. Een voordeel van deze kleuringsmethode is dat het ook de onderzoekers in staat stelt om de onmiddellijke effecten van UV-C (3 uur na UVC-blootstelling) op de levende cellen en hun gelijktijdige opsomming voor het percentage ROS-positieve, evenals dode cellen te bestuderen. Bovendien, als de kleuring methode wordt gebruikt op de levende cellen, kunnen de cellen verder worden geïncubeerd in dezelfde media voor een langere tijd (enkele dagen) voor de studie van vertraagde effecten van UV-C straling. Vandaar dat deze kleuringsmethode het mogelijk maakt om de ROS-generatie (groen) te visualiseren en tegelijkertijd de levende, apoptotische en dode celpopulaties in levende cellen te onderscheiden onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Echter, onder bepaalde omstandigheden, ondanks de anticipatie van het verkrijgen van ROS positieve en PI positieve cellen, kan de visualisatie mislukken. Voor dergelijke gevallen wordt probleemoplossing voorgesteld (tabel 2).

Dit protocol moet nauwkeurig worden uitgevoerd om optimale resultaten te verkrijgen. Optimale resultaten wijzen op een correlatie van het groene fluorescerende signaal dat wordt gegenereerd als een nauwkeurige uitlezing van de specifieke UV-C dosis geïnduceerde DNA-schade. Met andere woorden, voor het uitvoeren van deze stap, het volume van de media die in contact is met de cellen tijdens de UV-C blootstelling mag niet zozeer, zodat de UV-C dosis niet de vereiste schade uit te lokken. Daarom is het essentieel om een minimaal volume van de media te houden, bijvoorbeeld 500 μL per 35 mm schotel, net genoeg om de cellen te bedekken tijdens de UV-C blootstelling bij alle gespecificeerde doses. Ten tweede moet het volume van de media niet zo weinig zijn dat de cellen opdrogen tijdens uv-c-blootstelling. Ten slotte moeten de cellen onmiddellijk na de blootstelling van de cellen aan de UV-C worden aangevuld met verse media aan het optimale volume (zeg 2 mL), om eventuele schade en ROS-generatie verder te voorkomen.

Een beperking van deze techniek is het type ROS gegenereerd. Andere aanvullende tests moeten worden uitgevoerd om het specifieke ROS-type te detecteren in reactie op de UV-C-dosisbereiken. Dergelijke dergelijke omvatten de beoordeling van de intracellulaire hydroxyl radicaal (OH), intracellulaire superoxide radicalen, intracellulaire reactieve stikstofsoorten, mitochondriale hydroxyl radicalen, mitochondriale superoxiden, en waterstofperoxide in levende cellen met behulp van commercieel beschikbare kits. Een andere beperking van deze techniek is de detecteerbaarheid van het percentage ROS-productie bij doses onder de 10 J/m2 en hoger dan 10.000 J/m2. Blijkbaar waren er geen ROS-positieve cellen zichtbaar toen de primaire cellen/stamcellen van het oogoppervlak van de muis werden blootgesteld aan UV-C-doses van minder dan 10 J/m2. Integendeel, 100% ROS-positieve cellen waren zichtbaar toen de cellen werden blootgesteld aan de UV-C-dosis boven de 10.000 J/m2. Vandaar dat andere tests (bijvoorbeeld enzymanalyse, meting van oxidatieve stressmarkers zoals 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) (DNA-schademarker) en westerse vlekanalyse van DNA-schade-eiwitten bij verschillende doses) nuttig kunnen zijn om de omvang/het type cellulaire/moleculaire schade op verschillende niveaus te begrijpen. Een derde beperking van deze techniek is de correlatie van de UV-C doses met de ROS gegenereerd over verschillende celtypes. Dit moet worden gevalideerd.

Momenteel zijn DCFDA kits commercieel verkrijgbaar voor ROS-detectie, hetzij met behulp van microscopie of flow cytometrie10,11. Dergelijke kits zijn echter duur en kunnen niet worden geboden door onderzoekslaboratoria in landen met beperkte hulpbronnen. Vandaar, dit protocol is zeer nuttig met een efficiëntie die verwant is aan de commercieel verkochte methoden. Ten tweede hebben we opgenomen de propidium jodide dode cel vlek samen met de DCFDA / ROS generatie. Vandaar dat live celmonitoring van ROS-positieve en dode cellen gelijktijdig kan worden uitgevoerd met behulp van deze methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs kregen financiering steun van Bio-Rad Laboratories India Private Limited voor het sponsoren van het artikel.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de steun van het Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Geacht universiteit) voor de infrastructurele faciliteiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48, (10), 4391-4398 (2007).
  2. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66, (2), 190-194 (2018).
  3. Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49, (2), Suppl 1 3-8 (2000).
  4. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24, (5), 981-990 (2012).
  5. Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
  6. Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320, (1), 1-11 (2008).
  7. Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
  8. Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64, (1), 40-46 (2018).
  9. de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
  10. Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
  11. Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics