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Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

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Developmental Biology

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Summary

Este protocolo demuestra la detección simultánea de especies reactivas de oxígeno (ROS), células vivas y células muertas en cultivos primarios vivos a partir de células de superficie ocular de ratón. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodida, y Hoechst tinción se utilizan para evaluar el ROS, las células muertas y las células vivas, respectivamente, seguido de imágenes y análisis.

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Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

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Abstract

La superficie ocular se somete a un desgaste regular debido a diversos factores ambientales. La exposición a la radiación UV-C constituye un riesgo para la salud en el trabajo. Aquí, demostramos la exposición de las células madre primarias desde la superficie ocular del ratón a la radiación UV-C. La formación reactiva de especies de oxígeno (ROS) es la lectura de la extensión del estrés oxidativo/daño. En un entorno experimental in vitro, también es esencial evaluar el porcentaje de células muertas generadas debido al estrés oxidativo. En este artículo, demostraremos la tinción de 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) de las células madre madre de la superficie ocular primaria del ratón expuestas a UV-C y su cuantificación basada en las imágenes fluorescentes de la tinción DCFDA. La tinción DCFDA corresponde directamente a la generación ROS. También demostramos la cuantificación de células muertas y vivas mediante la tinción simultánea con yoduro de propidium (PI) y Hoechst 3332 respectivamente y el porcentaje de células DCFDA (ROS positivas) e PI positivas.

Introduction

La superficie ocular (OS) es una unidad funcional compuesta principalmente por la capa externa y la epitelia glandular de la córnea, la glándula lacrima, glándula meibomiana, conjuntiva, parte de los márgenes del párpado e inervaciones que transducen las señales1. La capa corneal transparente en forma de cúpula enfoca la luz en la retina. Este tejido avascular se compone de componentes celulares como células epiteliales, queratocitos, y células endoteliales y componentes acelulares como colágeno y glicosaminoglicanos2. El área es drenada por lágrimas que también suministran la mayoría de los nutrientes. La posición anatómica del sistema operativo lo obliga a estar en contacto directo con el entorno externo, a menudo exponiéndolo a varios componentes agresivos como luz brillante, microbios, partículas de polvo y productos químicos. Este factor predispone el sistema operativo a lesiones físicas y lo hace propenso a diversas enfermedades.

El estrés oxidativo se debe al desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos endógenos de defensas antioxidantes3. ROS se clasifican en moléculas reactivas y radicales libres, ambos derivados del oxígeno molecular (O2) a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial4. El primer grupo está compuesto por especies no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2),el oxígeno singlete (1O2) y el segundo incluye especies como aniones de superóxido (O2-), y radicales hidroxilo (OH), entre otras. Estas moléculas son subproductos de los procesos celulares normales y sus funciones se han implicado en funciones fisiológicas importantes como la transducción de señales, la expresión génica y la defensa del huésped5. Se sabe que se genera una mayor producción de ROS en respuesta a factores como la invasión de patógenos, los xenobióticos y la exposición a la radiación ultravioleta (UV)4. Esta sobreproducción de ROS da como resultado estrés oxidativo que conduce al daño de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos6.

La luz solar natural, la fuente más predominante de radiación UV, se compone de UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) y UV-C (290–200 nm)7. Se ha notificado una correlación inversa entre la longitud de onda y las energías espectrales. Aunque las radiaciones UV-C naturales son absorbidas por la atmósfera, las fuentes artificiales como las lámparas de mercurio y los instrumentos de soldadura emiten y, por lo tanto, constituyen un riesgo ocupacional. Los síntomas de la exposición a los ojos incluyen fotoqueratitis y fotoqueratoconjuntivitis8. La producción de ROS es uno de los principales mecanismos para infligir daño celular inducido por rayos UV9. En el estudio actual, demostramos la detección de ROS utilizando el método de tinción de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) de 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein a través de la enfermedad en células de superficie ocular primarias de ratón/células madre expuestas a UV-C. La fluorescencia verde fue capturada mediante microscopía fluorescente. Las células estaban manchadas con dos colorantes, Hoechst 33342 y yoduro de propidium rojo, para manchar las células vivas y muertas, respectivamente.

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Protocol

El experimento se realizó en células oculares primarias/células madre derivadas del ojo de ratón albino suizo. El uso de animales para la cosecha de los ojos para este experimento fue aprobado por el Comité Institucional de Etica Animal, Yenepoya (considerado como Universidad) (número de aprobación del IEAC, 6a/19.10.2016).

1. Preparaciones de reactivos

NOTA: La derivación de células primarias/células madre de la superficie ocular del ratón está fuera del alcance de este protocolo. Por lo tanto, demostramos las dosis de exposición UV-C, la preparación de reactivos para evaluar ROS, células vivas y muertas y su cuantificación. Consulte la Tabla 1 para conocer los volúmenes respectivos de los reactivos (10% suero bovino fetal, DCFDA, Hoechst y soluciones de stock de yoduro propidium que se añadirán para obtener la solución final de tinción).

  1. Preparar una solución de stock de 10 mM DCFDA disolviendo 25 mg de polvo DCFDA en 5.13 mL de DMSO. Aliquot 250 l cada uno en tubos de color ámbar de 1,5 ml y almacenar a -20 oC.
  2. Preparar una solución en stock de 10 mg/ml (solución de 16,23 mM) Hoechst 33342 disolviendo todo el contenido del vial de 25 mg en 2,5 ml de agua desionizada. Hacer alícuotas de 100 ml en tubos de microcentrífuga de color ámbar y almacenar a 2-6 oC durante un máximo de 6 meses. Para un almacenamiento a largo plazo, almacene a -20 oC.
  3. Preparar una solución en stock de 1 mg/ml de yoduro propidium en agua desionizada, alícuota de 1 ml cada uno en tubos de color ámbar de 1,5 ml, y almacenar a 4 oC.

2. El revestimiento celular y el tratamiento de radiación UV-C

  1. Antes del revestimiento, disociar las células de la superficie ocular primaria del ratón aisladas en nuestro laboratorio (resultados inéditos; tales células son una mezcla de epitelial corneal, células estromales y queratocitos) utilizando un agente de disociación celular suave(Tabla de materiales).
  2. Placa 0,2 x 106 células de superficie ocular primaria de ratón en 35 mm 0,2% platos de cultivo celular recubierto de matriz de membrana sótano en 2,5 ml de medios completos. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora deCO2 y humidificada al 5%.
    NOTA: Los medios completos para el cultivo de células primarias de la superficie ocular del ratón se componen de niveles de glucosa alta dMEM que contienen 20% de FBS, 1% de estreptococo, 1% de glutamax, 1% de aminoácido no esencial (NEAA), piruvato sódico al 1% y 0,1% de mercaptoetanol.
  3. Antes de exponer las células a varias dosis de UV-C, deseche el volumen máximo de medios y permita que sólo una capa delgada de medios (500 l) permanezca en contacto con las células, lo suficiente para cubrirlas.
  4. Lleve los platos, uno a la vez a la fuente/cámara UV-C (la cámara inferior de un horno de hibridación/vinculador cruzado UV; Tabla de Materiales). Coloque el plato en la cámara y retire la tapa del plato. La posición de la tapa abierta del plato garantiza que las células reciban la dosis máxima de UV-C durante la exposición UV-C.
  5. Exponga las células a diferentes grados/dosis de UV-C: 1 J/m2, 100J/m2, 1.000 J/m2 y 10.000 J/m2.
  6. Después de la exposición UV-C, reemplace la tapa de cada uno de los platos inmediatamente y retírelos de la cámara de origen UV-C.
  7. Lleve cada uno de los platos a la campana de flujo de aire laminar y rematar cada uno de los platos con 2 ml de medios frescos y completos.
  8. Incubar las células durante 3 h en una incubadora de CO2 de 37oC. Tres horas de incubación después de la exposición a UV-C es óptima para visualizar y cuantificar los efectos tempranos.

3. Preparación de medios de tinción de células vivas

  1. Preparar los medios de tinción frescos durante los últimos 15 minutos de la incubación de células de 3 h después de la exposición a UV-C.
  2. Precalentado 10 mL de los medios de tinción que contienen 10% FBS-DMEM complementado con 1% Pen-Strep a 37 oC.
  3. Añadir 5 sL de 10 mM DCFDA; 5 l de 10 mg/ml de solución de Hoechst y 200 ml de 1 mg/ml de yoduro de propidium. Las concentraciones finales de DCFDA, Hoechst y PI son de 5 m, 5 g/ml y 20 g/ml, respectivamente, en los 10 ml de los medios de tinción.

4. Tinción DCFDA de células oculares primarias de ratón expuestas a UV-C

  1. Después de 3 h de incubación de UV-C expuesto células oculares primarias de ratón a varias dosis, aspirar los medios de los platos de 35 mm.
  2. Reponer con 2 ml de medios de tinción DCFDA recién preparados a cada uno de los platos suavemente desde los lados.
  3. Incubar las células con el medio de tinción durante 15 minutos en la oscuridad en una incubadora de CO2 de 37 oC para la tinción de células vivas.

5. Visualización de células teñidas DCFDA (ROS), Hoechst y PI

  1. Después de la finalización de la incubación, deseche los medios de tinción.
  2. Agregue medios completos frescos a las células y observe las células bajo un microscopio fluorescente invertido / imagen celular (Tabla de materiales). Fotografiar los campos deseados: campo brillante, fluorescencia azul, fluorescencia roja, fluorescencia verde.
    NOTA: Las células azules manchadas fluorescentemente son los núcleos, la fluorescencia verde es para las células generadoras de ROS y la fluorescencia roja indica las células muertas PI positivas.

6. Cuantificación de células manchadas (Hoechst-Blue, PI-Dead y Green-ROS) utilizando técnicas de imagen

  1. Exporte las imágenes capturadas bajo el microscopio fluorescente invertido/imagen celular a ImageJ para la cuantificación.
  2. Abra cada una de las imágenes de una en una, utilizando cada canal (es decir, azul (Nuclei/Hoechst), verde (ROS), rojo (Muerto/PI positivo)) secuencialmente, para contar. Comience desde el control no expuesto y muévase secuencialmente a 1, 100, 1.000 y 10.000 J/m-2.
  3. Cuente las celdas usando la herramienta de recuento de celdas marcada como una cruz en el menú de software para cada uno de los campos [azul positivo (Hoechst positivo; núcleos), rojo positivo (PI positivo; celdas muertas); verde positivo (ROS)] en cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las Tratamientos.
  4. Cuente haciendo clic en cada una de las señales específicas en cada uno de los campos. Por ejemplo, al hacer clic en los núcleos manchados azules/Hoechst se dará el número total de núcleos en un campo determinado.
  5. Calcular los resultados como el porcentaje de muerte celular por daño UV (número de células PI positivas x 100 dividido por el número de células positivas Hoechst) y el porcentaje de producción de ROS por daño UV (número de células positivas DCFDA x 100 dividido por el número de células positivas Hoechst).

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Representative Results

DCFDA es un tinte incoloro que es una forma químicamente reducida de fluoresceína utilizada como indicador para detectar ROS en las células. Este tinte queda atrapado dentro de las células y se oxida fácilmente a la diclorodihidrofluoresceína fluorescente (DCF), que emite una fluorescencia verde. Esta fluorescencia se puede detectar mediante microscopía fluorescente. Las células se pueden visualizar y correlacionar con la acumulación de ROS de la siguiente manera: (i) las células vivas sin ROS emiten fluorescencia azul alta; (ii) células vivas con acumulación de ROS emiten alta fluorescencia azul con baja fluorescencia verde; y (iii) las células muertas con acumulación de ROS emiten baja fluorescencia azul con alta fluorescencia roja y verde alta.

Las células de control y las células expuestas a 1 J/m2 de UV-C no mostraron células DCFDA/ROS y PI positivas. El control no expuesto UV-C mostró tinción nuclear sólo como se indica en la tinción Hoechst(Figura 1). Sin embargo, no se vieron células positivas PI o DCFDA en las células de control no expuestas UV-C(Figura 1).

Las células expuestas a 100 J/m2 de UV-C exhibieron células bajaROS y PI positivas. Las células primarias de la superficie ocular del ratón tras la exposición a UV-C a una dosis de 100 J/m2 mostraron aproximadamente un 5% de co-manchación de DCFDA y PI, lo que indica la formación de ROS y la muerte celular en el 5% de las células (Figura 1).

Las células expuestas a 1.000 J/m2 de UV-C mostraron 60%–70% de células ROS y PI positivas. Las células primarias de la superficie ocular del ratón tras la exposición a UV-C a una dosis de 1.000 J/m2 mostraron aproximadamente un 70% de co-manchación de DCFDA y PI, lo que indica la formación de ROS y muerte celular en el 70% de las células(Figura 1).

Las células expuestas a 10.000 J/m2 de UV-C mostraron 100% células positivas ROS y muerte celular del 100%. La dosis más alta de UV-C (10.000 J/m2) cuando se expone a las células primarias oculares del ratón dio lugar a la muerte celular del 100% (células positivas PI) y la formación de ROS (tinción DCFDA), lo que indica la mayor letalidad de esta dosis UV-C en particular(Figura 1).

Las células tratadas con 1 J/m2 de radiación UV-C no mostraron ninguna acumulación de ROS y el porcentaje de células vivas en esta dosis fue comparable con el de las células de control. Las células demostraron una cantidad significativa de muerte celular y acumulación de ROS a 100 J/m2. La mayor cantidad de acumulación de ROS y muerte celular se observó en células tratadas con 10.000 J/m2 de radiación UV-C.

Los resultados cuantificados (porcentaje de generación de ROS y porcentaje de muerte celular según las fórmulas dadas en la sección 6.3) se trazaron en forma de gráfico de barras(Figura 2). El eje X representa las dosis UV-C, mientras que el eje Y representa el porcentaje de celdas. La barra verde representa el porcentaje de ROS, y las barras rojas representan la muerte celular en diferentes dosis de radiación UV-C (Figura 2). El porcentaje de ROS y células muertas eran del orden de 0%, 0%, 10%, 70% y 100% a las dosis UV-C: control no expuesto, 1 J/m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 y 10.000 J/m2, respectivamente(Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Imágenes compuestas de células vivas de las células primarias de la superficie ocular del ratón expuestas a varias dosis de UV-C (Control no expuesto, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Estas imágenes fueron capturadas bajo diferentes filtros: campo brillante (para morfología celular), azul (mancha nuclear de Hoechst), verde (generación ROS) y rojo (células muertas teñidas de yoduro propidium). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Gráficos de barras que muestran los resultados de cuantificación obtenidos después de calcular el porcentaje de generación de ROS y el porcentaje de células muertas tras la exposición de células de superficie ocular de ratón primario a varias dosis de radiación UV-C. El eje X representa las dosis UV-C, mientras que el eje Y representa el porcentaje de celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente Volumen
10% Suero Bovino Fetal que contiene DMEM 9790 l
Solución bursátil DCFDA 5 l
Solución de stock Hoechst 33342 5 l
Solución de stock de yoduro de Propidium 200 l

Tabla 1: Reactivos necesarios para la preparación de la solución de tinción.

Problema Razones probables Solución de problemas Comentarios
No se tiñen las células ROS o PI positivas o muy muy pocas cuando las células fueron tratadas con dosis UV altas a más altas i. Uso de una solución de tinción antigua. i. Utilice la solución de tinción recién preparada. i. La solución de tinción preparada anteriormente conduce a una tinción incorrecta de las células.
ii. Plato de cultivo sobreconfluente que resulta en el rescate del daño UVC por las células. ii. Placa sólo 0.2 millones de células en cada plato de cultivo celular de 35 mm y nunca permitir que las células crezcan durante más de 12 h antes de exponerlas a dosis UVC. ii. Las células con sobreconfluentes pueden salvar el daño UVC, y por lo tanto no o poco las células ROS y PI positivas serán visualizadas.

Tabla 2: Solución de problemas.

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Discussion

El método de tinción DCFDA descrito aquí permite la visualización de ROS en células vivas oculares primarias de ratón tratadas con radiación UV-C. Una ventaja de este método de tinción es que también permite a los investigadores estudiar los efectos inmediatos de UV-C (3 horas después de la exposición UVC) en las células vivas y su enumeración simultánea para el porcentaje de ROS positivo, así como, las células muertas. Además, a medida que el método de tinción se utiliza en las células vivas, las células se pueden incubar en el mismo medio durante más tiempo (varios días) para el estudio de los efectos retardados de la radiación UV-C. Por lo tanto, este método de tinción permite visualizar la generación ROS (verde) y al mismo tiempo distinguir las poblaciones vivas, apoptoticas y de células muertas en células vivas bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, a pesar de la anticipación de obtener células ROS positivas y PI positivas, la visualización puede fallar. Para tales casos, se sugiere la solución de problemas (Tabla 2).

Este protocolo debe llevarse a cabo con precisión para obtener resultados óptimos. Los resultados óptimos indican una correlación de la señal fluorescente verde emitida/ROS generada como una lectura precisa del daño específico por ADN inducido por la dosis UV-C. En otras palabras, para llevar a cabo este paso, el volumen de medios que está en contacto con las células durante la exposición UV-C no debe ser tanto para que la dosis UV-C no produzca el daño requerido. Por lo tanto, es esencial mantener un volumen mínimo de medios, por ejemplo 500 l por plato de 35 mm, lo suficiente para cubrir las células durante la exposición UV-C en todas las dosis especificadas. En segundo lugar, el volumen de medios no debe ser tan pequeño que las células se sequen durante la exposición UV-C. Finalmente, inmediatamente después de la exposición de las células al UV-C, las células deben ser rematadas con medios frescos al volumen óptimo (por ejemplo, 2 ml), con el fin de evitar más cualquier daño y generación ROS.

Una limitación de esta técnica es el tipo de ROS generado. Se deben realizar otros ensayos adicionales para detectar el tipo específico de ROS en respuesta a los intervalos de dosis UV-C. Tales ensayos incluyen la evaluación del radical hidroxilo intracelular (OH), los radicales de superóxido intracelular, las especies de nitrógeno reactivo intracelular, los radicales hidroxilo mitocondriales, los superóxidos mitocondriales y el peróxido de hidrógeno en células vivas utilizando kits disponibles comercialmente. Otra limitación de esta técnica es la detectabilidad del porcentaje de generación ros a dosis inferiores a 10 J/m2 y superiores a 10.000 J/m2. Aparentemente, no había células POSITIVAs ROS eran visibles cuando las células primarias/células madre de la superficie ocular del ratón estaban expuestas a dosis UV-C inferiores a 10J/m2. Por el contrario, las células positivas 100% ROS eran visibles cuando las células estaban expuestas a la dosis UV-C por encima de 10.000 J/m2. Por lo tanto, otros ensayos (por ejemplo, análisis de enzimas, medición de marcadores de estrés oxidativo como 8-hidroxidesoxigonosina (8-OHdG) (marcador de daño de ADN), y análisis de manchas occidentales de proteínas de daño de ADN a varias dosis) podrían ser útiles para entender la extensión / tipo de daños celulares / moleculares en varios niveles. Una tercera limitación de esta técnica es la correlación de las dosis UV-C con el ROS generado a través de varios tipos de células. Esto debe ser validado.

Actualmente, los kits DCFDA están disponibles comercialmente para la detección ros, ya sea mediante microscopía o citometría de flujo10,11. Sin embargo, estos kits son caros y no pueden ser otorgados por laboratorios de investigación en países con recursos restringidos. Por lo tanto, este protocolo es muy útil con una eficiencia similar a los métodos vendidos comercialmente. En segundo lugar, hemos incorporado la mancha de células muertas de yoduro propidium junto con la generación DCFDA/ROS. Por lo tanto, el monitoreo de células vivas de células positivas y muertas se puede llevar a cabo simultáneamente utilizando este método.

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Disclosures

Los autores recibieron apoyo de financiación de Bio-Rad Laboratories India Private Limited por patrocinar el artículo.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo del Centro de Investigación Yenepoya, Yenepoya (considerada universidad) a las infraestructuras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

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References

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