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Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Summary

Questo protocollo dimostra il rilevamento simultaneo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), cellule vive e cellule morte nelle colture primarie vive da cellule superficiali del topo. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, iodio propidio e colorazione Hoechst sono utilizzati per valutare il ROS, le cellule morte e le cellule vive, seguita dall'imaging e dall'analisi.

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Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

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Abstract

La superficie oculare è soggetta a usura regolare a causa di vari fattori ambientali. L'esposizione alle radiazioni UV-C costituisce un rischio per la salute sul lavoro. Qui, dimostriamo l'esposizione delle cellule staminali primarie dalla superficie oculare del topo alla radiazione UV-C. La formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è la lettura dell'entità dello stress ossidativo/danno. In un ambiente sperimentale in vitro, è anche essenziale valutare la percentuale di cellule morte generate a causa dello stress ossidativo. In questo articolo, dimostreremo la colorazione 2'7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) delle cellule staminali staminali staminali oculari primarie esposte al topo UV-C e la loro quantificazione basata sulle immagini fluorescenti della colorazione DCFDA. DCFDA colorazione corrisponde direttamente alla generazione ROS. Dimostriamo anche la quantificazione delle cellule morte e vive colorando simultaneamente con iodide propidio (PI) e Hoechst 3332 rispettivamente e la percentuale di cellule dCFDA (ROS positivo) e PI positive.

Introduction

La superficie oculare (OS) è un'unità funzionale composta principalmente dallo strato esterno e dall'epitelio ghiandolare della cornea, dalla ghiandola lacrimale, dalla ghiandola meibomiana, dalla congiuntiva, parte dei margini del coperchio degli occhi e dalle innervazioni che traducono i segnali1. Lo strato corneale a forma di cupola trasparente concentra la luce sulla retina. Questo tessuto avascolare è composto da componenti cellulari come cellule epiteliali, cherataciti, e cellule endoteliali e componenti acellulari come collagene e glicosaminoglycani2. L'area è prosciugata da lacrime che forniscono anche la maggior parte dei nutrienti. La posizione anatomica dell'OS costringe ad essere a diretto contatto con l'ambiente esterno, spesso esponendolo a vari componenti duri come luce intensa, microbi, particelle di polvere e sostanze chimiche. Questo fattore predispone il sistema operativo alle lesioni fisiche e lo rende incline a varie malattie.

Lo stress ossidativo è causato dallo squilibrio tra la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e i meccanismi di difesa antiossidante endogene3. I ROS sono classificati in molecole reattive e radicali liberi, entrambi derivati dall'ossigeno molecolare (O2)attraverso il fosforilazione ossidativa mitocondriale4. Il primo gruppo è composto da specie non radicali come il perossido di idrogeno (H2O2),l'ossigeno singlet (1O2) e il secondo comprende specie come gli anioni di superossido (O2-), e i radicali idrossili (,OH), tra gli altri. Queste molecole sono sottoprodotti di normali processi cellulari e i loro ruoli sono stati implicati in importanti funzioni fisiologiche come la trasduzione del segnale, l'espressione genica e la difesa ospite5 . Una maggiore produzione di ROS è nota per essere generata in risposta a fattori come l'invasione di agenti patogeni, xenobiotici, e l'esposizione alla radiazione ultravioletta (UV)4. Questa sovrapproduzione di ROS provoca stress ossidativo che porta al danno di molecole come acidi nucleici, proteine e lipidi6.

La luce solare naturale, la fonte più predominante di radiazioni UV, è composta da UV-A (400-320 nm), UV-B (320–290 nm) e UV-C (290-200 nm)7. È stata riportata una correlazione inversa tra la lunghezza d'onda e le energie spettrali. Sebbene le radiazioni UV-C naturali siano assorbite dall'atmosfera, fonti artificiali come lampade a mercurio e strumenti di saldatura emettono e, quindi, costituiscono un pericolo professionale. I sintomi dell'esposizione agli occhi includono fotokeratite e fotokeratoconjunctivitis8. La produzione di ROS è uno dei principali meccanismi di infliggere danni cellulari indotti da UV9. Nello studio attuale, dimostriamo il rilevamento di ROS utilizzando il metodo di colorazione dedace (DCFDA) 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) nelle cellule superficiali del topo/cellule staminali esposte ai raggi UV-C. La fluorescenza verde è stata catturata utilizzando la microscopia fluorescente. Le cellule erano contro-macchiate con due coloranti, Hoechst 33342 e ioodio propidio rosso, per macchiare le cellule vive e morte, rispettivamente.

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Protocol

L'esperimento è stato effettuato su cellule oculari primarie/cellule staminali derivate dall'occhio del topo albino svizzero. L'uso di animali per la raccolta degli occhi per questo esperimento è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali, Yenepoya (considerata Università) (numero di approvazione IEAC, 6a/19.10.2016).

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: la derivazione delle cellule primarie/cellule staminali dalla superficie oculare del topo esula dall'ambito di questo protocollo. Diseguito il dimostrare le dosi di esposizione all'UV-C, la preparazione del reagente per valutare il ROS, le cellule vive e morte e la loro quantificazione. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per i rispettivi volumi dei reagenti (10% siero bovino fetale, DCFDA, Hoechst e propidium iodide soluzioni da aggiungere per ottenere la soluzione di colorazione finale).

  1. Preparare una soluzione stock di 10 mM DCFDA sciogliendo 25 mg di polvere DCFDA in 5,13 mL di DMSO. Aliquote a 250 gradi ciascuno in tubi color ambra tona le 1,5 mL e conservate a -20 gradi centigradi.
  2. Preparare una soluzione di riserva di 10 mg/mL (soluzione 16,23 mM) Hoechst 33342 sciogliendo l'intero contenuto della fiala da 25 mg in 2,5 mL di acqua deionizzata. Fare aliquote di 100 gradi in tubi di microcentrifuga color ambra e conservarli a 2-6 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi. Per l'immagazzinamento a lungo termine, conservare a -20 gradi centigradi.
  3. Preparare una soluzione di riserva di 1 mg/mL di iodio propidium in acqua deionizzata, 1 mL ciascuno in tubi color ambra turalato 1,5 mL, e conservare a 4 gradi centigradi.

2. Placcatura cellulare e trattamento con radiazioni UV-C

  1. Prima della placcatura, dissociare le cellule di superficie oculare primarie del topo isolate nel nostro laboratorio (risultati inediti; tali cellule sono una miscela di epiteliali corneali, cellule stromali e cheratociti) utilizzando un delicato agente di dissociazione cellulare (Tabella dei materiali).
  2. Piastra 0,2 x 106 cellule di superficie oculare primarie del topo in 35 mm 0,2% matrice seminterrato matrice rivestita piastra di coltura cellulare in 2,5 mL di supporti completi. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% e incubatrice umidificata.
    NOTA: il supporto completo per la coltura delle cellule primarie dalla superficie oculare del topo è costituito da dMEM ad alto glucosio contenente 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% di amminoacido non essenziale (NEAA), 1% pyruvate di sodio e 0,1% di mercaptoetanolo.
  3. Prima di esporre le cellule a varie dosi di UV-C, scartare il volume massimo dei supporti e consentire solo a un sottile strato di supporti (500 dollari l) di rimanere in contatto con le cellule, quanto basta per coprirle.
  4. Portate i piatti, uno alla volta alla sorgente/camera UV-C (la camera inferiore di un forno di ibridazione/cross linker UV; Tabella dei materiali). Mettere il piatto nella camera e rimuovere il coperchio del piatto. La posizione del coperchio aperto del piatto assicura che le cellule ricevano la dose massima di UV-C durante l'esposizione UV-C.
  5. Esporre le cellule a diversi gradi/dosi di UV-C: 1 J/m2, 100J/m2, 1.000 J/m2 e 10.000 J/m2.
  6. Dopo l'esposizione all'UV-C, sostituire immediatamente il coperchio di ciascuno dei piatti e rimuoverli dalla camera sorgente UV-C.
  7. Porta ciascuno dei piatti al cofano a flusso d'aria laminare e completa ciascuno dei piatti con 2 mL di supporti completi freschi.
  8. Incubare le cellule per 3 h in un'incubatrice a 37 gradi centigradi. Tre ore di incubazione dopo l'esposizione uv-C è ottimale per visualizzare e quantificare gli effetti iniziali.

3. Preparazione dei mezzi di colorazione delle cellule vive

  1. Preparare i supporti di colorazione freschi durante gli ultimi 15 min dell'incubazione di 3 cellule h dopo l'esposizione UV-C.
  2. Pre-caldo 10 mL del supporto di colorazione contenente 10% FBS-DMEM integrato con 1% Pen-Strep a 37 .
  3. Aggiungere 5 - L di 10 mM DCFDA; 5 luna di 10 mg/mL di Soluzione Hoechst e 200 -L di 1 mg/mL di propidium iodium. Le concentrazioni finali di DCFDA, Hoechst e PI sono rispettivamente di 5 M, 5 g/mL e 20 g/mL nei 10 mL dei supporti di colorazione.

4. Colorazione DCFDA delle cellule oculari primarie esposte al topo UV-C

  1. Dopo 3 h di incubazione di cellule oculari primarie esposte al topo UV-C a varie dosi, aspirano i mezzi dai piatti da 35 mm.
  2. Ricostituire con 2 mL di supporti di colorazione DCFDA appena preparati per ciascuno dei piatti delicatamente dai lati.
  3. Incubare le cellule con il supporto di colorazione per 15 min al buio in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi per la colorazione delle cellule vive.

5. Visualizzazione delle cellule macchiate DCFDA (ROS), Hoechst e PI

  1. Dopo il completamento dell'incubazione, scartare i mezzi di colorazione.
  2. Aggiungere nuovi supporti completi alle cellule e osservare le cellule al microscopio fluorescente invertito / imager cellulare (Tabella dei materiali). Fotografare i campi desiderati: campo luminoso, fluorescenza blu, fluorescenza rossa, fluorescenza verde.
    NOTA: Le cellule colorate fluorescenti blu sono i nuclei, la fluorescenza verde è per le cellule generatrici di ROS e la fluorescenza rossa indica le cellule morte positive PI.

6. Quantificazione delle cellule colorate (Hoechst-Blue, PI-Dead e Green-ROS) utilizzando tecniche di imaging

  1. Esportare le immagini acquisite al microscopio fluorescente invertito/imager cellulare in ImageJ per la quantificazione.
  2. Aprire ciascuna delle immagini una alla volta, utilizzando ogni canale (ad esempio, blu (Nuclei/Hoechst), verde (ROS), rosso (Dead/PI positivo)) in sequenza, per il conteggio. Iniziare dal controllo non esposto e spostarsi in sequenza a 1, 100, 1.000 e 10.000 J/m-2.
  3. Contare le celle utilizzando lo strumento di conteggio delle celle contrassegnato come croce nel menu software per ciascuno dei campi [blu positivo (Hoechst positivo; nuclei), rosso positivo (PI positivo; cellule morte); verde positivo (ROS)] in ciascuna delle immagini corrispondenti a ciascuna delle Trattamenti.
  4. Contare facendo clic su ciascuno dei segnali specifici in ciascuno dei campi. Ad esempio, cliccando sui nuclei macchiati blu/Hoechst darà il numero totale di nuclei in un determinato campo.
  5. Calcolare i risultati come percentuale di morte cellulare per danno UV (numero di cellule PI positive x 100 diviso per il numero di cellule positive di Hoechst) e la percentuale di produzione di ROS da danni UV (numero di cellule positive DCFDA x 100 diviso per il numero di cellule positive di Hoechst).

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Representative Results

DCFDA è un colorante incolore che è una forma chimicamente ridotta di fluoresceina utilizzata come indicatore per rilevare ROS nelle cellule. Questo coloranti rimane intrappolato all'interno delle cellule ed è facilmente ossidato alla diclorodicafluoresceina (DCF), che emette una fluorescenza verde. Questa fluorescenza può essere rilevata utilizzando la microscopia fluorescente. Le cellule possono essere visualizzate e correlate con l'accumulo di ROS come segue: (i) cellule vive senza ROS emettono alta fluorescenza blu; ii) le cellule vive con accumulo di ROS emettono alta fluorescenza blu con bassa fluorescenza verde; e (iii) le cellule morte con accumulo di ROS emettono bassa fluorescenza blu con alta fluorescenza rosso e verde alta.

Le cellule di controllo e le cellule esposte a 1 J/m2 di UV-C non mostravano cellule positive DCFDA/ROS e PI. Il controllo UV-C non esposto mostrava la colorazione nucleare solo come indicato dalla colorazione Hoechst (Figura 1). Tuttavia, nessuna cella positiva PI o DCFDA è stata osservata nelle cellule di controllo UV-C non esposte (Figura 1).

Le cellule esposte a 100 J/m2 di UV-C hanno mostrato basse cellule ROS e PI positive. Le cellule primarie della superficie oculare del topo dopo l'esposizione all'UV-C ad una dose di 100 J/m2 hanno mostrato circa il 5% di co-colorazione di DCFDA e PI, indicando così la formazione di ROS e morte cellulare nel 5% delle cellule (Figura 1).

Le cellule esposte a 1.000 J/m2 di UV-C hanno mostrato 60%-70% di cellule positive ROS e PI. Le cellule primarie della superficie oculare dei topi dopo l'esposizione all'UV-C ad una dose di 1.000 J/m2 hanno mostrato circa il 70% di co-staining di DCFDA e PI, indicando così la formazione di ROS e morte cellulare nel 70% delle cellule(Figura 1).

Le cellule esposte a 10.000 J/m2 di UV-C hanno mostrato cellule positive ROS al 100% e a una morte cellulare del 100%. La dose UV-C più elevata (10.000 J/m2) quando esposta alle cellule primarie del topo oculare ha provocato la morte delle cellule al 100% (cellule positive PI) e la formazione di ROS (colorazione DCFDA), indicando così la massima letalità di questa particolare dose UV-C (Figura 1).

Le cellule trattate con 1 J/m2 di radiazione UV-C non hanno mostrato alcun accumulo di ROS e la percentuale di cellule vive in questa dose era paragonabile a quella delle cellule di controllo. Le cellule hanno dimostrato una quantità significativa di morte cellulare e di accumulo di ROS a 100 J/m2. La più alta quantità di accumulo di ROS e morte cellulare è stata osservata nelle cellule trattate con 10.000 J/m2 di radiazione UV-C.

I risultati quantificati (percentuale di generazione di ROS e percentuale di morte cellulare secondo le formule indicate nella sezione 6.3) sono stati tracciati sotto forma di grafico a barre (Figura 2). L'asse X rappresenta le dosi UV-C, mentre l'asse Y rappresenta la percentuale di cellule. La barra verde rappresenta la percentuale di ROS, e le barre rosse rappresentano la morte cellulare a diverse dosi diradiazioneUV-C ( Figura 2 ). La percentuale di ROS e cellule morte era dell'ordine di 0%, 0%, 10%, 70% e 100% alle dosi UV-C: controllo non esposto, 1 J/m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 e 10.000 J/m2, rispettivamente (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: immagini composte di cellule vive delle cellule primarie della superficie oculare del topo esposte a varie dosi di UV-C (controllo non esposto, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Queste immagini sono state catturate sotto diversi filtri: campo luminoso (per la morfologia cellulare), blu (macchia nucleare di Hoechst), verde (generazione ROS) e rosso (cellule morte macchiate di iodio di propidio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Grafici a barre che mostrano i risultati della quantificazione ottenuti dopo aver calcolato la percentuale di generazione di ROS e la percentuale di cellule morte dopo l'esposizione delle cellule della superficie oculare primaria a varie dosi di radiazioni UV-C. L'asse X rappresenta le dosi UV-C, mentre l'asse Y rappresenta la percentuale di cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente Volume
10% Siero Bovino fetale contenente DMEM 9790 LL
Soluzione stock DCFDA 5 ll
Soluzione stock Hoechst 33342 5 ll
Soluzione di stock di iodio di propidio 200 l

Tabella 1: Reagenti necessari per la preparazione della soluzione di colorazione.

Problema Motivi probabili Risoluzione dei problemi relativi Commenti
Le cellule sono no o molto poco ROS o PI positive colorate quando le cellule sono state trattate con una dose UV da alta a più alta i. Uso di una vecchia soluzione di colorazione. i. Utilizzare una soluzione di colorazione appena preparata. i. La precedente soluzione di colorazione preparata porta a una colorazione impropria delle cellule.
ii. Piatto di coltura sovra-confluente con conseguente recupero di danni UVC da parte delle cellule. ii. Piatto solo 0,2 milioni di cellule in ogni piatto di coltura cellulare 35 mm e non permettere mai alle cellule di crescere per più di 12 h prima di esporle a dosi UVC. ii. Le cellule sovraconfluenti possono recuperare danni UVC, e quindi non verranno visualizzate cellule ROS e PI rotoli o piccole.

Tabella 2: Risoluzione dei problemi.

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Discussion

Il metodo di colorazione DCFDA descritto qui consente la visualizzazione di ROS nelle cellule vive oculari primarie del topo trattate con radiazione UV-C. Un vantaggio di questo metodo di colorazione è che permette anche ai ricercatori di studiare gli effetti immediati dell'UV-C (3 ore dopo l'esposizione ALL'UVC) sulle cellule vive e la loro enumerazione simultanea per la percentuale di ROS positivi, così come le cellule morte. Inoltre, poiché il metodo di colorazione viene utilizzato sulle cellule vive, le cellule possono essere ulteriormente incubate negli stessi supporti per un tempo più lungo (diversi giorni) per lo studio degli effetti ritardati delle radiazioni UV-C. Quindi, questo metodo di colorazione permette di visualizzare la generazione DI ROS (verde) e contemporaneamente distinguere le popolazioni di cellule vive, apoptotiche e morte in cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertita. Tuttavia, in determinate circostanze, nonostante l'aspettativa di ottenere cellule ROS positive e PI positive, la visualizzazione può fallire. Per tali casi, viene suggerita la risoluzione dei problemi(tabella 2).

Questo protocollo deve essere effettuato con precisione per ottenere risultati ottimali. I risultati ottimali indicano una correlazione del segnale fluorescente verde emesso/ROS generato come una lettura accurata del danno specifico del DNA indotto dalla dose UV-C. In altre parole, per eseguire questo passaggio, il volume dei supporti che è in contatto con le cellule durante l'esposizione UV-C non dovrebbe essere tale che la dose UV-C non riesce a suscitare il danno richiesto. Quindi, è essenziale mantenere un volume minimo di supporti, ad esempio 500 l per piatto 35 mm, quanto basta per coprire le cellule durante l'esposizione UV-C a tutte le dosi specificate. In secondo luogo, il volume dei supporti non dovrebbe essere così poco che le cellule si asciughino durante l'esposizione ai raggi UV-C. Infine, subito dopo l'esposizione delle cellule all'UV-C, le cellule devono essere riempite con supporti freschi al volume ottimale (ad esempio 2 mL), al fine di evitare ulteriori danni e generazione di ROS.

Una limitazione di questa tecnica è il tipo di ROS generato. Altri saggi devono essere eseguiti per rilevare il tipo ROS specifico in risposta agli intervalli di dose UV-C. Tali analisi includono la valutazione del radicale idrossile intracellulare(-OH), radicali di superossido intracellulari, specie di azoto reattivo intracellulare, radicali idrossili mitocondriali, superossido mitocondriali e perossido di idrogeno nelle cellule vive utilizzando kit disponibili in commercio. Un'altra limitazione di questa tecnica è la rilevabilità della percentuale di generazione ROS a dosi inferiori a 10 J/m2 e superiore a 10.000 J/m2. Apparentemente, nessuna cellula positiva ROS era visibile quando le cellule primarie / cellule staminali dalla superficie oculare del topo sono state esposte a dosi UV-C inferiori a 10 J/ m2. Al contrario, 100% LE cellule positive ROS erano visibili quando le cellule sono state esposte alla dose UV-C superiore a 10.000 J/m2. Quindi, altri saggi (ad esempio, analisi degli enzimi, misurazione di marcatori di stress ossidativo come 8-idrossideoxyguanosine (8-OHdG) (marcatore di danno del DNA) e analisi delle macchie occidentali delle proteine del danno del DNA a varie dosi) potrebbero essere utili per comprendere l'estensione/tipo di danni cellulari/molecolari a vari livelli. Una terza limitazione di questa tecnica è la correlazione delle dosi UV-C al ROS generato in vari tipi di cellule. Questo deve essere convalidato.

Attualmente, i kit DCFDA sono disponibili commercialmente per il rilevamento ROS utilizzando microscopia o citometria di flusso10,11. Tuttavia, tali kit sono costosi e non possono essere garantiti dai laboratori di ricerca nei paesi con risorse limitate. Quindi, questo protocollo è molto utile con un'efficienza simile ai metodi venduti in commercio. In secondo luogo, abbiamo incorporato la macchia della cellula morta di iodio propidio insieme alla generazione DCFDA/ROS. Quindi, il monitoraggio delle cellule vive delle cellule positive e morte ROS può essere effettuato contemporaneamente utilizzando questo metodo.

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Disclosures

Gli autori hanno ricevuto il finanziamento del finanziamento da Bio-Rad Laboratories India Private Limited per la sponsorizzazione dell'articolo.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il sostegno del Centro di ricerca Yenepoya, Yenepoya (ricercatrice) per le strutture infrastrutturali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

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References

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