סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

Developmental Biology
 

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התפתחות של מקורות מתחדשים של רקמת הכבד נדרשת כדי לשפר את העיצוב המבוסס על תאים, ולפתח רקמות האדם להשתלה. האדם תאים גזע עובריים (hESCs) ותאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (hiPSCs) מייצגים מקורות מבטיחים של כדורי כבד אנושיים. פיתחנו סרום חינם ומוגדר שיטה של בידול הסלולר כדי ליצור כדורים תלת מימדי הכבד האנושי הנוצר מתאי גזע האדם pluriפוטנטי. מגבלה פוטנציאלית של הטכנולוגיה היא הפקת כדורים צפופים עם חומר מת בפנים. כדי לעקוף את זה, העסקנו את טכנולוגיית המיקרוגל בצפיפות תא מוגדרת כדי לשלוט בגודל הספירות התלת-ממדית, מניעת הדור של ליבות האפוטוטיות ו/או נמק.  בעיקר, הספירות שנוצרו על ידי הגישה שלנו להציג את תפקוד הכבד ואת פנוטיפ יציבה, המייצג משאב יקר עבור מחקר בסיסי ומיושם מדעי. אנו מאמינים כי הגישה שלנו יכול לשמש כטכנולוגיה פלטפורמה כדי לפתח רקמות נוספות למודל ולטפל במחלות אנושיות ובעתיד יכול לאפשר את הדור של רקמת האדם עם אדריכלות רקמה מורכבת.

Introduction

היכולת של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לחידוש עצמי, תוך שמירה על גמישות, מספקת הזדמנות לייצר סוגי תאים אנושיים ורקמות על פי דרישה. hPSCs הובלו ביעילות לתאים של הפאציט (hlcs) באמצעות מערכות תרבות דו ממדיות (2d),1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10 מערכות אלה נעשה שימוש בהצלחה מודל מונוגניים מחלה, מחזור חיים של וירוס, התרופה הנגרמת פגיעה בכבד (dili), חשיפה העובר רעלים ומחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (nafld)11,12,13 ,14,15. עם זאת, מודלים אלה בעלי מספר חסרונות, אשר מגבילים את השימוש השגרתי שלהם. אלה כוללים ביטוי מסמן העובר, פנוטיפ לא יציב ואדריכלות הרקמה המסכנה16,17,18,19, אשר יכול גם להגביל את הפונקציה לתפקוד איברים ב vivo.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, תלת מימדי (3D) פלטפורמות בידול פותחו לחקות באדריכלות רקמה vivo. למרות הפיכתה, גישות אלה להסתמך על השימוש של מוצרים נגזר בעלי חיים ומטריצות כדי לכונן רקמת בראשית20,21,22, הגבלת בהיקף ויישום נרחב.

כאן, אנו פירוט הליכים כדי ליצור כמויות גדולות של 3D hepatospheres מ hPSCs באמצעות חומרים מוגדרים הרכבה עצמית תא. בעיקר, את רקמת שנוצר על ידי ההליך שלנו נשאר פונקציונלי במשך יותר משנה אחת בתרבות התא והוא מסוגל לתמוך בתפקוד הכבד ב vivo23.

לסיכום, שלנו גישה בידול מוגדר מאפשר את הדור של הגוף האנושי יציבה האדם מתאי גזע האדם העובריים (hESCs) ו המושרה תאים גזע pluripotent (iPSCs). אנו מאמינים כי ההליך המתואר מייצג פריצת דרך משמעותית בדור של 3D hepatospheres עבור מחקר מדעי בסיסי ומיושם.

Protocol

1. הכנת תבניות מיקרופלייט

הערה: התקשורת המשמשת לניסויים אלה חייבת להיות סטרילית ובטמפרטורת החדר (RT) עבור תרבות התא.

  1. הכינו 2% תבניות.
    1. התמוססות 2 גרם של טמפרטורת ההיתוך נמוכה agarose לתוך 100 mL של מים מזוקקים מעוקר. חום בזהירות במיקרוגל עם מרווח רועד להתמוסס לחלוטין.
    2. הוסף 520 μL של מומס נמס לתבנית 256-היטב פורמט ולעזוב כדי לגבש.
    3. העבר כל מיקרוצלחת הצמח לתוך באר אחת של 12-היטב צלחת.
    4. הוסף 1.5 mL של מלוחים באגירה של 1 x דולפי (DPBS) עם Ca2 +/Mg2 + כל טוב ולהסיר את בועות האוויר מן המיקרוגל על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות קצה P1000. הדבר מבוצע כדי להבטיח שזריעת תאים אחידה.
      הערה: ניתן לאחסן מיקרופלטות בנפח של עד 6 חודשים ב -4 ° c ב-1x DPBS.

2. זריעת האדם בתאי גזע רב עוצמה לתוך לוחות למיקרוגל

  1. הכנת השעיית תאים
    1. מנושף את המדיום מתרבות מובחן של hPSCs כפי שתוארה בעבר8.
      הערה: hPSCs הם מתורבתים ב-in-521 ב mTeSR1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, ו החוצה באופן סדיר פעם התאים להגיע 75% כדי 85% השטף כמתואר בעבר8.
    2. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של RT 1x DPBS ללא Ca2 +/Mg2 + ולהסיר את המאגר.
    3. הוסף 5 מ ל של 1x מגיב דיסוציאציה של תא 1 (טבלת חומרים) לתאים ולאפשר הדיסוציאציה של התא על ידי מריטינג תאים ב 37 ° c עבור 6-8 דקות.
      הערה: , כדי לעצור את התגובה. בדוק ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ התאים צריכים להיות מנותקים חלקית מלוחית. הארך את הדגירה עבור 1-2 דקות נוספות אם נדרש זמן רב יותר.
    4. להפסיק את התגובה על ידי הסרת מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוסיף 5 מ ל mTeSR1 בינונית טריים בתוספת עם 10 μM Rho-הקשורים בY27632 קינאז (רוק) מעכב מדכא לתאים. הנתק תאים על-ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות טיפ P1000.
    5. לספור את התאים הקיימא באמצעות מחלת הומוציטוטומטר וטריקון כחול מכתים. לאחר מכן, הכן את התא הבולם בריכוז הנדרש.
    6. חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים. עבור 3d hepatosphere בידול, הזרע 3.84 x 105 תאים לכל agarose מיקרוצלחת לייצר spheroids עם 100-150 יקרומטר קוטר.
    7. להעביר את המספר הרצוי של תאים לתוך סטרילי 15 מ"ל או 50 mL צנטריפוגה שפופרת צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות ב RT כדי גלולה התאים.
    8. מרוב ולמחוק את supernatant ולהשעות את התאים מחדש ב mTeSR1 בינונית ועוד 10 μM סלע מעכבי Y27632. לדלל את הגלולה תא בנפח המתאים של בינוני לריכוז הסופי של 2.1 x 106 תאים/mL.
  2. זריעת התאים למיקרו-צלחות מוכנות
    הערה:
    אם נעשה שימוש במקרר מאוחסן מיקרולוחות מיקרו, למקם אותם בחממה תא ב 37 ° c לפחות שעה לפני השימוש ומכה את DPBS 1x מן הבאר לפני זריעת התאים.
    1. הוסף 190 μL של השעיית התא לתוך המיקרוגל.
    2. לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות לחממה התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h כדי לאפשר לתאים להתיישב.
    3. לאחר 2 h, להוסיף 1 מ ל של טרי וחמים mTeSR1 בינוני בתוספת עם 10 μM סלע מעכב Y27632 כל טוב.
    4. החזר את הלוחות לאינקובטור התא ב-37 ° c ו-5% CO2 עבור 24 שעות ובדוק את היווצרות הספירות ביום שלמחרת כדי לאפשר לתאים להתחבר.

3. הבחנה בין hPSCs ל-3D הפטלוספירות על הצמח

  1. הכנת בארות מצופות פולי 2-הידרוטקסיל (פולי-HEMA)
    1. התמוססות 2 גרם של פולי HEMA ב 100 mL של 95% אתנול. מערבבים את התמיסה בלילה באמצעות פלטה חמה ב-55 ° c. הוסף 250 μL של הפתרון פולי-HEMA לבאר של 24-באר ויבש בן לילה ב-60 ° צ' באמצעות תנור.
  2. הכנת מדיום בידול
    1. הכנת פתרון מניות 1, 000x של הפעילות האנושית על ידי המסת הפעילות האנושית חלבון ליאופה1 ב סטרילי 0.2% סרום שור (BSA)/dpbs לריכוז הסופי של 100 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    2. להכין 1, 000x פתרון מלאי של Wnt3a על ידי המסת העכבר Wnt3a ליאופ, חלבון סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. . השתמש ב-1:200
    3. הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם הגדילה האנושי hepatocyte (HGF) על ידי המסת חלבון HGF האדם ליאופפיהיפיהילי ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    4. להכין 1, 000x פתרון מלאי של אונסטטין M (OSM) על ידי המסת OSM סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 20 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    5. הכינו פתרון מניות של 1000x של מקדם האפיתל (EGF) על ידי המסת החלבון ליאופהולן ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    6. הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם גדילה בסיסית הפיצוץ בסיסי (bFGF) על ידי המסת החלבון הלינו, ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    7. להכין פתרון מניות 1, 000x של כלי הדם גורם מקדם גידול (באמצעות) על ידי המסת החלבון ליאופה1 ב 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.
    8. להפוך בינוני אנדועור בינונית המורכבת פארק רוזוול הזיכרון המכון 1640 (RPMI 1640) בינונית בתוספת עם 2% B27 תוספת (50x, ללא אינסולין), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים: 100 IU/mL ו100 μg/mL, בהתאמה). אלא אם צוין, בכל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם Wnt3a והפעלות A בריכוז סופי של 50 ng/mL ו 100 ng/mL, בהתאמה.
      הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.
    9. הפוך hepatoblast חוז בידול בינוני המורכב של מדיום שונה של Dulbecco הנשר (KO-DMEM) עם 20% החלפת סרום (KOSR) ושיושלם עם 0.5% של תוסף חלופי ל-L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1 מ"מ ביתא-mercaptoethanol, 1% diמתיל סולפוקסיד (DMSO), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). מסנן תחת ואקום.
      הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.
    10. הפוך hepatocyte התבגרות בינונית המורכבת של hepatocyte בינונית בתוספת עם 1% של תוסף חלופי ל-גלוטמין, 10 μM הידרוקורטיזון מלחים מלח נתרן (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם OSM ו HGF (ריכוזי הסופי ב 20 ng/mL ו-10 ng/mL, בהתאמה).
      הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.
    11. להפוך hepatocyte תחזוקה בינונית המורכבת של E בינונית של ויליאם השלימה עם 10% החלפת סרום, המורכב 1% של תוספת חלופית L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים סופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, הוסף את העוצמה הנדרשת עם HGF, EGF, bFGF ו-וורף (הריכוז הסופי של כל גורם גדילה ב-10 ng/mL).
      הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.
  3. בדוק את מערך ה-hepatosphere 24 שעות שלאחר זריעה והתחל בבידול. בזהירות להסיר את המדיום mTeSR1 ולהחליף אותו עם 1 מ ל של בינוני חדש בידול עור בתוספת עם 100 ng/mL הפעילות A ו 50 ng/mL Wnt3a.
  4. שינוי בינונית לטרמה בתוספת עור כל 24 שעות עבור 3 ימים עבור hESCs. בעבודה עם hiPSCs, הארך את השלב במשך יומיים נוספים הכוללים את המדיה באמצעות הפעילות (100ng/mL) בלבד.
  5. בעקבות האינדוקציה האנדופאתית הסופית, לעבור לתוך מחוז hepatoblast ידול בינוני עבור מפרט hepatoblast חוז עבור 5 ימים החלפת המדיום כל 2 ימים ולבצע את השינוי האחרון ביום האחרון של המפרט hepatoblast חוז.
  6. העבר את הספירות לתוך הבארות הצופות בפולי-HEMA.
    1. שטוף את התאים פעם אחת עם התבגרות ההבשלה בינונית ללא תוספי מזון לאחר הסרת KSR/DMSO בינונית ולהוסיף 1 מ ל של התבגרות ההבשלה של hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM.
    2. תוך שימוש בפיפטה P1000, הרם את הספירות מתוך המיקרו-ליטוף של התמיסה מספר פעמים.
    3. העבר את המדיום המכיל את הספירות לבאר מצופה פולי HEMA.
    4. לשטוף את מיקרוצלחת הצמח באמצעות 1 מ ל של התבגרות ההבשלה בינונית בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM ולהעביר את המדיום כדי פולי HEMA מצופה היטב.
    5. חזור על השלב 3.6.4 פעמים רבות ככל האפשר על מנת להעביר את כל כדורי hepatospheres המיקרו לוחית.
      הערה: זה קריטי לפיפטה בזהירות למעלה ולמטה את הפתרון המכיל את כדורי hepatospheres להימנע מפגיעה בהם.
  7. הקפדה בזהירות על המדיום עודף מבלי להסיר hepatospheres באמצעות מP100 בצנרת עד ~ 1 מ ל של בינוני המכיל את הספירות האלה נשאר ב פולי-HEMA מצופה היטב.
  8. לשנות את המדיום כל 48 h עבור 12 ימים.
  9. ביום 20 כאשר עובדים עם hESCs או יום 22 אם עובדים עם hiPSCs, העבר את המדיום למדיום תחזוקה hepatocyte.
    1. הסרת hepatocyte התבגרות בינונית ולשטוף את התאים פעם אחת עם מדיום תחזוקה hepatocyte ללא תוספי. להוסיף 1 מ ל של מדיום תחזוקה hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL של HGF, EGF, FGF ו-ואגף.
  10. לשנות את המדיום עבור תחזוקה מדיום טרי החציט כל 48 h.

4. ניתוח פונקציונלי של מתורבת לטווח ארוך תלת-ממד כדורים החפאאלים

  1. עבור אל hepatocyte התבגרות בינונית בתוספת עם 10 μM HCC, L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה) ו 10 ng/mL HGF 48 h לפני ביצוע ניתוח פונקציונלי.
  2. ניתוח של הפונקציה המטבולית של hepatocyte באמצעות ציטוכרום (CYP) P450 assays.
    1. להחליף בינוני עם 1 מ ל של ההבשלה התבגרות טריים בינונית בתוספת עם 50 μM לluciferin-6'-פנטטאורו-בנזיל אתר (לוציפראב-PFBE) מצע לזיהוי פעילות CYP3A בסיס או 100 μM לוציפראב-מתיל אתר (לוציפראב-ME) מצע לזהות CYP1A2 פעילות בסיס (מספר המשכפלת = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית.
      הערה: כדי למנוע הצלבה, מומלץ לא להשתמש באותם בארות המכילים 3D hepatospheres כדי לבדוק פעילויות שונות CYP P450 אלא לבצע אותם בבארות נפרדות.
    2. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C.
    3. לאסוף את הסופרנטנים על-ידי טיפ P100 מתוך ולבצע את השיטה לפי הוראות היצרן.
    4. למדוד את הרמות היחסיות של פעילות בסיס ולנרמל ל-mg חלבון כפי שנקבע על ידי שיטת החומצה הבינותית (BCA).
  3. סרום לבדיקת חלבון משתמש בשיטת חיסוני מקושרת אנזימים (אליסה).
    1. החלף בינוני עם 1 מ ל של התבגרות החלציט טרי מדיום בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM (מספר משכפל = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית.
    2. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C.
    3. לאסוף את supernatant באמצעות עצה P100 tte ולמדוד את הרמות היחסיות של ייצור חלבון הסרום לפי הוראות היצרן.
    4. הנורמליזציה לחלבון mg לפי הקביעה שנקבעה על-ידי שיטת BCA.

5. אימונוציטוכימיה

  1. הכנת חתכי פרפין המכילים כדורים.
    1. שטוף את הכדורים שלוש פעמים. עם כדורי הרנטגן
    2. תקן את הכדורים עם מתנול קר קרח במשך 30 דקות.
    3. שטוף שלוש פעמים עם 1x DPBS.
    4. הטמע the hepatospheres ב 300 μL של פתרון מחוסמת של 2% agarose מומס H2O באמצעות באר ריקה של צלחת 24-היטב כתבנית ולהשאיר אותו לגבש עבור 30 דקות.
    5. הטמע את הצמח המכיל את הספירות בפרפין.
    6. סעיף בלוק פרפין המכיל hepatospheres קבוע ב 4 יקרומטר סעיפים עבים באמצעות microtome.
  2. דה-שעווה והסבה של הסעיפים.
    הערה: השתמש
    בפתרונות רעננים בכל פעם שניתן. אין להשתמש בפתרונות שהיו על שוקת הצביעת במשך יותר משבוע.
    1. מקם מקטעים במדף שקופיות.
    2. לטבול מתלה שקופיות המכיל סעיפים באבוס מכתים המכיל 300 mL של קסילן עבור 5 דקות.
    3. חזור על שלב ה5.2.2.
    4. לטבול באתנול מוחלט עבור 20 s.
    5. לטבול ב 95% אתנול עבור 20 s.
    6. לטבול ב 90% אתנול עבור 20 s.
    7. לטבול ב 80% אתנול עבור 20 s.
    8. לטבול ב 70% אתנול עבור 20 s.
    9. להשקות מחדש את הסעיפים עם מים עבור 5 דקות.
      הערה: שמור על השקופיות באותו מדף שקופיות והעבר אותה מאבוס כתמים אחד לשני. הנפח המשמש (בדרך כלל ~ 300 mL) תלוי בגודל של שוקת הצביעת.
  3. לאחזור אנטיגן של מקטעי פרפין המכילים כדורי hepatospheres
    1. חום דה-שעווה מקטעים מחדש ב-1x טריס-EDTA (TE) pH 9.0 מאגר פתרון עבור 15 דקות במיקרוגל ב 800 W.
    2. לצנן את דגימות על ידי האישר אותם במי ברז עבור 5 דקות.
  4. כתמים חיסוני.
    1. דגירה שקופיות עם פתרון חסימה העשוי PBS עם 0.1% polysorbate 20 (PBS/T)/10% BSA עבור 1 h בשעה RT.
    2. החלפת פתרון חסימת עם הנוגדן העיקרי המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה ב 4 ° צ' עם עצבנות עדינה בן לילה.
    3. שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים.
    4. דגירה עם הנוגדן המשני המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה בחושך ב-RT במשך 1 h עם עצבנות עדינה.
      הערה: הנוגדנים העיקריים והמשניים הממוטבים מפורטים ברשימת החומרים.
    5. שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים.
    6. להוסיף 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) לתאים לפי הוראות היצרן והמקום שמיכות זכוכית בעדינות כדי להפחית בועות אוויר. שמרו על תאים קבועים ב -4 ° c בחשכה. שימו לב לצביעת תחת מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורה פלואורסצנטית.
      הערה: הצלחות מאחסנות ב -4 ° c בחשכה עד להדמיה.

Representative Results

אגרגטים תלת מימדיים מתוך קו הגזע העובריים (H9) או קו הגזע המושרה החזק pluripotent P106) הובלו לקראת שושלת היוחסין של hepatocyte באמצעות ההליך המוגדר שלנו (איור 1). בתאי גזע פלאוריטי היו ראשונים מוכן לכיוון האנדופתית הסופית לפני מפרט hepatoblast חוז. בעקבות זאת, הבשיל הבשילו לתוך שלושה יח ' הפטאודורים שיכלו להישמר בתרבות עד לשנה23.

כדי ללמוד את המבנה של כדורים תלת-ממדיים, הספירות של hESC-or iPSC, שנות היום, הינן קבועות ומוכתמות כדי לזהות את הנוכחות של חלבונים המתבטאים בתאי הפטוציטים ובתאים mesenchymal. הפטציט גורם גרעיני 4 אלפא (HNF4α) ו הסמן mesenchymal היתה מועסקים, חשיפת נוכחות של שכבה חיצונית המורכבת החרופציט כמו תאים המקיפים ליבה של תאי mesenchymal (איור 2). עקבנו אחר הניסויים הללו באמצעות ניתוח ביטוי החלבונים המובטאים בהיפטציטים: אלבומין, CYP3A ו-E-קדהרין. המונח "חיסוני" חשף שהביטוי של חלבונים אלה הוגבל לרובד החיצוני של התחומים (איור 3).

ניתוחים פונקציונליים של כדורי hepatospheres וצעו ביום 30 תרבויות. CYP1A2 ו CYP3A הם אנזימים חשובים בתוך hepatocytes פונקציונלי. הפעילות שלהם הוערך באמצעות assays הוקמה. H9-כדורי hepatospheres הציגו CYP3A פעילות של 220,375 ± 74514 RLU/mL/mg חלבון ו CYP1A2 פעילות של 732,440 ± 33,330 RLU/mL/mg חלבון (איור 4א). פעילות CYP3A ב-P106 hepatospheres היה 132117 ± 43,391 RLU/mL/mg חלבון ו CYP1A2 פעילות היתה 409,907 ± 121,723 RLU/mL/mg חלבון (איור 4ב). בהשוואה לשתי קבוצות של hepatocytes הראשי האדם, כדורי הכבד 3D הציג רמות מכובד של פעילות CYP10.

ניתוח סינתזה והפרשת אלבומין ו-alpha-fetoprotein (AFP) חשף כי H9-נגזר hepatospheres מופרש 683.9 ± 84 ו 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg חלבון של אלבומין ו-alpha-fetoprotein, בהתאמה (איור 5א). בעוד P106-hepatospheres נגזר מופרש 497 ± 41 ו 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg חלבון של אלבומין ו-alpha-fetoprotein, בהתאמה (איור 5B).

Figure 1
איור 1 : הליך בידול סטפני ליצור 3d hepatospheres מ hESCs. הסוגריים הכחולים מייצגים ימים של בידול עבור hiPSCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : התארגנות מבנית של כדורי תלת-ממד. תמונות מייצגות של הביטוי של הגורם הגרעיני של hepatocyte 4 אלפא (HNF4α-green) ו-vimentin (אדום) ב-(א) H9-d הנגזרות תלת-ממד ו-(ב) P106-נגזרות תלת-ממד כדורים ובקרות החיסוני המקביל שלהם G (igg) . סרגלי קנה מידה מייצגים 60 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הערכה של ביטוי סמן הכבד בתוך 3D hepatospheres. תמונות מייצגות של הביטוי של הפטציט סמנים-אלבומין, CYP3A, E-קדהרין ושולטת הigg המקבילה שלהם ב (א) H9-ו (ב) P106-3d הנגזרים כדורים. קנה מידה של סרגלים = 60 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : ציטוכרום P450 פונקציה ב-3D hepatospheres. מדידה של ציטוכרום P450 1A2 ו-3A הפעילות ב (A) H9-3a הנגזרים ספירות ו (ב) P106-הנגזרת 3a hepatospheres. הנתונים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל ביולוגי, וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). הפעילות מצוטטים כיחידות אור יחסיות (RLU) לכל מ ל לחלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : ניתוח הפרשת החלבון של hepatosphere. הפרשת אלבומין ואלפא פטופפרוטאין (AFP) נותחו ב-(א) H9-d-האפיכדורים תלת-ממדיים ו-(ב) P106-הנגזרים התלת-ממדיים. הנתונים מייצגים שלושה משכפל ביולוגי, ושורות השגיאה מייצגות את ה-SD. החלבון המופרש מצוטט כ-ננוגרם של חלבון ל-mL לכל מ ל 24 שעות לכל מ ג של חלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההתפתחות של מערכות xeno-free לייצר האדם hepatospheres בתלת-ממד נדרש הן בתחום החוץ והן בvivo מאמצים. בשלב הנוכחי רוב ההפטציט גישות מתאי גזע בעלי עוצמה מעשית בשתי תרבויות ממדיות. סביבות אלה חסרות הרבה רמזים סביבתיים המעורבים רקמות בראשית הומאוסטזיס הכוללים; אינטראקציות תא הטרוטיפקס, ייצור מטריקס ושיפוץ, וכתוצאה מכך תרגום עני ל vivo ביולוגיה18,19.

כתוצאה מכך, המחקר התמקד גישות חלופיות להפקת hepatospheres מתאי גזע פלאוריטי. מספר מחקרים תלת-ממדיים התקדמו לאורך המגרש, אך אלה נשענים על מוצרים בעלי חיים20,22,24 לספק תמיכה ו/או דורשים שימוש ברקמת האדם21,22 אשר מסבך טכנולוגיה היקף ופשרות היישום הנסיוני והאפליקציה.

הנוהל המתואר במאמר שלנו (איור 1) מוגדר, יעיל, מאוד מועיל וחסכוני, ומאפשר הפקת כדורי כבד פונקציונליים, אשר נשארים פונקציונליים לאורך שנה בתחום החוץ, ומספקים תמיכה קריטית בכבד ב . vivo14 חשוב, פלטפורמה זו מאפשרת למשתמש לשלוט בגודל של כדורי הכבד 3D, הגבלת היווצרות של מרכזים נקרופטיים צפוף ואובדן של פנוטיפים.

העברת הספירות התלת-ממדית ללוחות הציפוי של פולי-HEMA מייצגת שלב קריטי בפרוטוקול זה. חשוב לפיפטה בעדינות בשלב זה בהליך כדי להימנע מפגיעה בכדור. בנוסף, יש לבצע בקפידה שינויי מדיה כדי למנוע הטיית מתח ועיוות של מבנה הספירה.

במחקרים אלה, 3D hepatospheres הציגו מבנה מאורגן (איור 2 ואיור 3), ציטוכרום P450 פונקציה (איור 4) ו חלבונים בכבד המופרש, כולל אלבומין ו אלפא פטוטופרוטאין (איור 5). הליך זה כבר בוצע בהצלחה בארבעה שורות בתאי גזע החזקים עם תוצאות דומות. במבט קדימה, טכנולוגיה זו יכולה להיות מועסק כפלטפורמה לפתח רקמות שורש נוסף, mesenchymal עם ארכיטקטורות מורכבות.

Disclosures

דוד ס. חי הוא מייסד ובעל בעלי מניות של סטנובאט בע מ והיירסטייקים בע מ. שאר המחברים מאשרים כי אין להם ניגודי אינטרסים בנושא או בחומרים הנדונים במאמר זה.

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך עם פרסים של פלטפורמת הרפואה הרגנרטיבית בבריטניה (MRC MR/L022974/1) ואת משרד המדען הראשי (TCS/16/37).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9, (1), 51-62 (2007).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26, (4), 894-902 (2008).
  4. Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8, (2), 430-437 (2013).
  5. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, (2), 237-252 (2014).
  6. Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51, (1), 329-335 (2010).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51, (1), 297-305 (2010).
  8. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5, (6), 1250-1262 (2015).
  11. Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3, (1), 204-214 (2014).
  12. Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (1750), 20170362 (2018).
  13. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5, (6), 764-772 (2016).
  14. Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91, (11), 3633-3643 (2017).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120, (9), 3127-3136 (2010).
  16. Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63, (4), 934-942 (2015).
  17. Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4, (20), 3433-3442 (2016).
  18. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22, (5), 456-472 (2017).
  19. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  20. Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9, (1), (2014).
  21. Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9, (2), 396-409 (2014).
  22. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  23. Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92, (10), 3117-3129 (2018).
  24. Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21, (10), 2661-2670 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics