Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье представлен метод изучения глутаматных рецепторов (GluR) в разъединенных первичных гиппокампальных культурах. Используя подход к кормлению антител для маркировки эндогенных или переэкспрессированных рецепторов в сочетании с фармакологическими подходами, этот метод позволяет выявлять молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию поверхности ГлюР путем модулирования процессов интернализации или рециркуляции.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени полагаются на набор рецепторов, выраженных на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, популяция поверхностно выраженных рецепторов постоянно адаптируется и подчиняется строгим механизмам регулирования. Парадигматический пример и один из наиболее изученных событий торговли людьми в биологии является регулируемый контроль синаптической экспрессии рецепторов глутамата (GluRs). GluRs посредничают в подавляющем большинстве возбуждающих нейротрансмиссии в центральной нервной системе и контролируют физиологическую активность-зависимые функциональные и структурные изменения на синаптических и нейрональных уровнях (например, синаптической пластичности). Изменения в количестве, местоположении и составе субъединиц поверхности, выраженные Глюры, глубоко влияют на функцию нейронов и, по сути, изменения в этих факторах связаны с различными невропатиями. Представлено здесь метод для изучения GluR торговли в диссоциированных гиппокампа первичных нейронов. Подход «кормления антител» используется для дифференциализации популяций ГлюР, выраженных на поверхности и внутренних мембранах. Путем маркировки поверхностных рецепторов на живых клетках и фиксируя их на разное время для того чтобы позволить для приемных устройств endocytosis and/or рециркулировать, эти процессы торговли можно оценить и селективно изучить. Это универсальный протокол, который может быть использован в сочетании с фармакологическими подходами или переэкспрессией измененных рецепторов, чтобы получить ценную информацию о стимулах и молекулярных механизмах, влияющих на торговлю GluR. Аналогичным образом, он может быть легко адаптирован для изучения других рецепторов или поверхностных протеинов.

Introduction

Клетки используют активный процесс торговли, чтобы мобилизовать белки к конкретным субклеточным локализациям и осуществлять строгую пространственно-временное регулирование над их функцией1. Этот процесс особенно важен для трансмембранных рецепторов, так как клеточные реакции на различные экологические стимулы опираются на внутриклеточные каскады, вызванные активацией рецепторов. Клетки способны изменять эти реакции, изменяя плотность, локализацию и состав субъединиц рецепторов, выраженных на поверхности клетки через регулирование субклеточного оборота рецепторов2. Вставка вновь синтезированных рецепторов в плазменную мембрану, наряду с эндоцитозом и рециркуляцией существующих рецепторов являются примерами процессов торговли людьми, которые определяют чистый пул поверхностно выраженных рецепторов2. Многие молекулярные механизмы сотрудничают для регулирования торговли белками, включая белково-белковые взаимодействия и постпереводные модификации, такие как фосфорилирование, убиквитинация или пальмитоилация2.

Регулирование оборота рецепторов особенно необходимо в сильно поляризованных клетках с узкоспециализированными структурами. Парадигматический пример является контроль нейронной функции регулируемой торговли рецепторами глутамата (GluRs)3,4. Глутамат, основной возбуждательный нейромедиатор, связывает и активирует поверхностно-выраженные GluRs для управления фундаментальными физиологическими нейрональными функциями, такими как синаптической нейротрансмиссии и синаптической пластичности. Тот факт, что измененный клей торговли наблюдается в широком спектре невропатий, начиная от нейроразвития расстройств нейродегенеративных заболеваний, подчеркивает важность этого процесса5. Таким образом, понимание молекулярных событий, контролирующих торговлю GluR, представляет интерес во многих областях исследований.

В этом протоколе метод кормления антител используется для количественной оценки уровня поверхностных глюров в первичных гиппокампальных нейронах, а также для оценки того, как изменения в интернализации и рециркуляции приводят к наблюдаемому чистому экспрессии поверхности. Использование фармакологии и/или переэкспрессии экзогенных рецепторов, укрывающих специфические мутации, делает этот протокол особенно мощным подходом к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе нейронной адаптации к различным экологическим стимулам. Последним примером полезности этого протокола является изучение того, как многофакторные изменения в окружающей среде (например, в моделях заболеваний) влияют на торговлю GluR путем изучения поверхностного выражения в таких моделях.

Используя конкретные примеры, первоначально показано, как фармакологические манипуляции, имитирующие физиологическую синаптической стимуляции (cLTP) увеличивает поверхностное выражение эндогенного подразделения GluA1 амрац-типа GluRs (AMPARs) 6.Торговля чрезмерно выраженной фосфо-миметической формой подразделения GluN2B NMDA-типа GluRs (NMDARs) также анализируется для примера того, как этот протокол может быть использован для изучения регулирования оборота ГлюР конкретными постпереводами Изменения. Хотя эти конкретные примеры используются, этот протокол может быть легко применен к другим GluRs и других рецепторов и белков, которые обладают антигенными внеклеточными доменами. В случае, если нет антител, доступных для внеклеточных доменов, переэкспрессия внеклеточных эпитопных меток (например, флаг-, Myc-, GFP-тегами и т.д.) белки могут помочь в маркировке белка.

В настоящем протоколе содержатся инструкции по количественной оценке конкретной плотности подтипов GluR и оборота с использованием конкретных антител. Этот протокол может быть использован для изучения 1) общего выражения поверхности GluR, 2) интернализации GluR и 3) переработки GluR. Для изучения каждого процесса индивидуально рекомендуется начинать с разделов 1 и 2 и продолжать либо раздел 3, 4, или 5. Во всех случаях, закончить с разделами 6 и 8(Рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Работа, связанная с подготовкой гиппокампа первичной культуры была рассмотрена и одобрена Северо-Западным университетом по уходу за животными и использованием комитета (протокол #IS00001151).

1. Подготовка перед маркировкой

  1. Подготовка и поддержание первичных гиппокампа культур
    1. Приготовьте первичные гиппокампальные культуры при плотности 150 000 клеток, покрытых поли-D-лизин-покрытием (0,1 мг/мл) 18 мм. Отличные гиды для диссоциированной подготовки нейронной культуры доступны7,8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, культуры могут рассматриваться с цитозин арабиносид (Ара-С, 10 мМ от DIV1), чтобы избежать глиальной пролиферации в подготовке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо поли-Д-лизинможноиспользовать можно использовать альтернативные реагенты, такие как фибронектин (1 мг/мл) или ламинин (5 мг/мл).
    2. Поддержание культур в клеточном инкубаторе при 37 градусах По кв. м и 5% CO2 в 2 мл/колодце нейробазальных носителей, дополненных B27 и 2 мМ L-глютамином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно использовать заменители L-глютамина (например, Glutamax).
    3. На еженедельной основе, удалить половину объема средств массовой информации и заменить с тем же объемом дополненных нейробазальных носителей.
  2. ФАКЦИЯ: Трансфекция мутировавших и/или эпитопных рецепторов
    ПРИМЕЧАНИЕ:
    Нейроны должны быть трансфицировать по крайней мере 3-4 дней до анализа точки времени, чтобы обеспечить экспрессию рецепторов. Использование молодых нейронов «Дни в пробирке 6-9 (DIV6-9)» приводит к лучшей эффективности трансфекции, чем старые (DIV15-20) нейронов, но достаточное количество трансинфицированных клеток (Зgt;20) может быть достигнуто независимо от DIV занятых.
    1. Для каждой скважины из 12-хорошо пластины, разбавить 1,5 мкг плазмиды, содержащей конструкцию интереса в 100 зл и средств массовой информации без B27 или глутамина добавок в микроцентрифуге трубки и смешать путем вихря быстро.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешного трансфекции, очень важно, чтобы нейробазальные средства массовой информации, используемые как свежие, как это возможно, в идеале менее чем через 1 неделю после открытия бутылки.
    2. Во второй микроцентрифуговой трубке смешайте 1 зл и соответствующий липотеционный реагент в 100 л свежих нейробазальных носителей и аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь смеси реагента липотекции. Использование свежих реагентов липотекции может повысить эффективность трансфекции.
    3. Инкубировать трубки в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Добавьте смесь реагента липотекции в смесь ДНК, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут на RT.
    5. Отрегулируйте объем носителей в каждой скважине до 1 мл условных носителей.
    6. Добавьте липотекционный реагент -ДНК смесь dropwise к колодцу.
    7. Вернуть клетки в инкубатор и позволяют по крайней мере 3-4 дней для экспрессии белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей интернализации и переработки протоколов, изложенных ниже, гиппокампа нейроны были трансинфицированы на DIV11-12 с конструкциями, выражающими GluN2B помечены GFP во внеклеточной области (GFP-GluN2B) и изображением на DIV15-16.
  3. ФАКЦИЯ: Инкубация клеток препаратами (хронически или остро) в условных носителях до фиксации.
    ПРИМЕЧАНИЕ:
    Для острого лечения, начать лечение клеток до маркировки. В зависимости от используемого протокола лечения наркомании, клетки могут поддерживаться в наркосодержащих носителях во время раздела 2. В нашем примере, DIV21 клетки были подпадают под протокол cLTP для увеличения поверхности выраженной AMPAR9.
    1. Обмен условных носителей для внеклеточного раствора (ECS).
    2. Лечить клетки с 300 мкм глицином в ECS в течение 3 мин на RT. В качестве контроля, лечить сестру coverslip с ECS (без глицина).
    3. Вымойте клетки 3x с 37 КК ECS и вернуть клетки в ECS (без глицина) в клеточный инкубатор в течение 20 минут до продолжения раздела 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ECS (в мМ): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Глюкоза, 0,001 TTX, 0,01 стрихнин, и 0,03 пикотоксина при рН 7,4.

2. Live Маркировка поверхностных рецепторов

  1. Подготовка крышки для маркировки
    1. Для сохранения реагентов и облегчения манипуляций, передача охватывает крышки ячейки сторону до парафина пленки покрыты лоток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно никогда не позволять образцам высохнуть.
    2. Сохранить и поддерживать кондиционированные носители при 37 градусов по Цельсию для инкубации и стирки шагов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 18-мм крышки рекомендуется инкубация с 75-100 л носителей для маркировки антител и 120-150 л для интернализации/переработки.
  2. Маркировка поверхностных рецепторов первичными антителами
    1. Инкубировать клетки с первичными антителами, разбавленными в условных носителях в течение 15 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для GFP-тегами рецепторов, кролик анти-GFP антитела при разбавлении 1:1000 был использован. Для эндогенного GluA1 использовалась мышь anti-GluA1 при разбавлении 1:200.
    2. Тщательно аспирируйте антитела-содержащие средства с помощью вакуумной пипетки и мыть клетки три раза с условными носителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условные носители недоступны, все стирки могут быть выполнены с помощью PBS »фосфат буферный солевой раствор (PBS), содержащий 1 мМ MgCl2 и 0,1 мМ CaCl2. Ручное стремление с помощью микропайпета может быть выполнено, если нежный вакуума аспирации не доступна.

3. Выражение поверхности(рисунок2)

  1. Вторичная маркировка антител поверхностно-выраженных рецепторов
    1. Вымойте один раз с PBS.
    2. Исправьте клетки путем инкубации с 4% параформальдегидом (PFA) и 4% сахарозой в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других методов фиксации, таких как инкубация метанола, ПФА не проникает в плазменную мембрану и поэтому подходит для анализа поверхностно-экспрессионных выражений. Для достижения оптимальных результатов используйте свежеприготовленный PFA. Краткосрочное хранение ПФЕ при 4 градусах Цельсия или длительное (до 30 дней) хранение при -20 градусов по Цельсию является разрешительным для адекватной фиксации.
      ПРЕДЕКТО: PFA является известным канцерогеном. Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при обращении.
    3. Вымойте клетки три раза с регулярными PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 0,1 М глицин может быть использован для мытья PFA вместо PBS, как глицин будет утолить любые оставшиеся фиксаторы, которые могут увеличить фон в подготовке.
    4. Блок неспецифических связывающих сайтов путем инкубации с 10% нормальной сыворотки козы (NGS) в PBS в течение 30 минут на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время блокировки может быть продлено без побочных эффектов на маркировку.
    5. Инкубировать флуоресцентно помеченными вторичными антителами, разбавленными в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения первичных рецепторов с маркировкой антител (т.е. поверхностно выраженных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах, 1:500 разбавления Alexa 555-конъюгированных вторичных антител: коза анти-кролик для GFP-маркированных рецепторов и коза анти-мышь для GluA1 был использован.
    6. Вымойте клетки с PBS 3x.
  2. Маркировка внутриклеточных рецепторов
    1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, что начальный раунд маркировки антител занимает все поверхностные эпитопы, этот шаг permeabilization можно пропустить в культуре сестры. В этом случае сигнал для внутриклеточных рецепторов получить не следует. Кроме того, чтобы проверить, что никакие внутренние рецепторы не были помечены в предыдущем разделе 2 (т.е. показывая целостность плазменных мембран в культуре), шаг permeabilization можно пропустить в культуре сестры, и первичное антитело против внутриклеточный белок (например, PSD-95 или MAP2) может быть использован в шаге 2.2.1. В этих условиях от этого первичного не следует получать сигнал. В этом случае использовалось антитело кролика против PSD-95 (1:500).
    2. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT.
    3. Этикетка внутриклеточных рецепторов путем инкубации пермяковых клеток с темже первичным антителом, используемым в разделе 2.2 разбавленных в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител для маркировки внутриклеточных рецепторов может отличаться от того, что требуется для маркировки поверхностных рецепторов. В примере GluA1 использовалось то же разбавление антител (1:200).
    4. Вымойте клетки 3x с PBS.
    5. Этикетка со вторым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах, 1:500 разбавления козы анти-мышь Alexa 647-конъюгированных вторичных антител (для GluA1) был использован.
    6. Вымойте клетки 3x с PBS.

4. Интернализация(рисунок3)

  1. Интернализация поверхностных рецепторов, маркированных антителами
    1. После маркировки поверхностных рецепторов и промывки антител (раздел 2.2) поддерживать клетки в условных носителях без антител и возвращать их в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для NMDA рецепторов рекомендуется 30 мин для интернализации. В качестве контроля, сестра культуры могут быть сохранены с условными средствами массовой информации на 4 кВ в процессе интернализации. Минимальная интернализация рецепторов должна происходить в этих условиях.
  2. Маркировка поверхностных рецепторов
    1. Вымойте клетки один раз с ПОМОЩЬю PBS.
    2. Исправьте клетки с 4% PFA и 4% сахарозы в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРЕДЕКТО: Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при работе с PFA.
    3. Вымойте клетки 3x с регулярными PBS.
    4. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT, чтобы предотвратить неспецифические связывания.
    5. Инкубировать образцы с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленного в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения первичных антител помечены рецепторов (т.е. поверхностно выраженных рецепторов, которые не были интернализированы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 555-конъюгированный коза анти-кролик вторичного антитела (1:500) был использован для маркировки.
    6. Вымойте клетки 3x с PBS.
  3. Маркировка интернализированных рецепторов
    1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин.
    2. Блок неспецифическая связывание инкубации с 10% NGS в PBS в течение 30 мин на RT.
    3. Инкубировать образцы с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения интернализированных антител помечены рецепторами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 647-конъюгированный коза анти-кролик вторичного антитела (1:500) используется для маркировки.
    4. Вымойте клетки 3x с PBS.

5. Переработка(рисунок 4)

  1. Интернализация поверхностных рецепторов, маркированных антителами
    1. После маркировки поверхностных рецепторов и промывки антител (раздел 2.2) поддерживать клетки в условных носителях без антител и возвращать их в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для NMDA рецепторов рекомендуется 30 мин для интернализации.
  2. Блокирование стабильных поверхностных выраженных рецепторов
    1. Чтобы блокировать эпитопы на первичных антителах, прикрепленных к поверхностно-выраженным рецепторам, которые не были интернализированы, инкубируют клетки с неконъюгированными фрагментами анти-Игг (H'L) антитела (против первичного, используемого в разделе 2.2) разбавленных в условных носителях ( 20 мкг/мл) в течение 20 мин на RT. Это лечение предотвращает дальнейшее взаимодействие со вторичными антителами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера были использованы фрагменты Коза против кролика Фаба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольный эксперимент: для обеспечения полного блокирования поверхностно выраженных рецепторов произошло, сестра coverslips могут быть инкубированы с и без Fab. Культуры должны быть исправлены сразу после лечения Fab, и обе культуры инкубируются с Alexa 555-конъюгированных вторичных антител. Нет Alexa 555 сигнал агенетвии в Fab-инкубированных клетках указывает на надлежащее блокирование антител.
    2. Вымойте клетки 3x с условными носителями.
    3. Инкубировать клетки с условными носителями, содержащими 80 мкм диназора для предотвращения дальнейшей интернализации и возвращения клеток в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить рециркуляцию интернализированных рецепторов. Dynasore является ингибитором GTPase, который подавляет динамин и, следовательно, предотвращает интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется 45 мин для переработки NMDAR. Обратите внимание, что Dynasore исключительно блокирует процесс интернализации, зависящей от динаминов (например, интернализацию NMDARs). Тем не менее, интернализация другого синаптического белка (динамина-независимого) все еще может произойти в присутствии диназора.
  3. Маркировка переработанных рецепторов
    1. Вымойте клетки один раз с ПОМОЩЬю PBS.
    2. Исправьте клетки с 4% PFA и 4% сахарозы в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРЕДЕКТО: Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при работе с PFA.
    3. Вымойте клетки 3x с PBS.
    4. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT, чтобы предотвратить неспецифические связывания.
    5. Этикетка клетки с первым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 555-конъюгированный коза анти-кролик антитела (1:500) был использован для маркировки.
    6. Вымойте клетки 3x с PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительные смывы с PBS (5-10 мин) может помочь уменьшить фон в подготовке.
  4. Маркировка интернализированных рецепторов
    1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин.
    2. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT.
    3. Этикетка со вторым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 647-конъюгированный коза анти-кролик антитела (1:500) был использован для маркировки.
    4. Вымойте клетки 3x с PBS.

6. Монтаж и визуализация образцов

  1. Монтировать клетки, аккуратно помещая крышки клеток вниз на 12-15 мл соответствующих монтажных носителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стремление к избыточному монтажу носителей улучшит качество изображений.
  2. Изображение клеток на соответствующем конфокальном микроскопе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется изображение z-стек на 60x увеличение с 0,35 мкм шаги, охватывающие всю толщину нейрона.

7. Рассмотрение времени

  1. Это длинный протокол, который может быть остановлен в нескольких точках. При желании выполните блокирующие и первичные инкубации антител на ночь при 4 градусах по Цельсию во влажной камере.
  2. Кроме того, при желании, используйте процессор микроволновой ткани, чтобы значительно ускорить время инкубации после фиксации. Для всех шагов используйте 150 Вт при 30 градусах по Цельсию для настроек "On".
    1. Чтобы заблокировать, запустите процессор на 2 мин "На", 1 мин "Off", и 2 мин "На".
    2. Для первичных и вторичных шагов инкубации антител, запустить процессор на 3 мин "На", 2 мин "Off", и 3 мин "На".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдаем никакой разницы в качестве, внося вышеперечисленные изменения в протокол.

8. Анализ изображений

  1. Рекомендуется использовать FIJI lt;https:///fiji.sc/'gt; для проведения анализа изображений, так как он совместим с несколькими форматами файлов. По нашим данным, были получены изображения в формате файла Nikon ND2.
  2. Макроскрипт предусмотрен для легкой пакетной количественной оценки различных параметров, предварительно отобранных FIJI. Следующие шаги включены в макрос:
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах была измерена "интегрированная интенсивность".
  3. Откройте файлы изображений в FIJI и отдельных каналах.
  4. Проект каждого канала стек в качестве максимальной интенсивности проекции.
  5. Установите нижний порог для каждого канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговые значения должны быть эмпирически определены для каждого экспериментального набора данных. Хотя каждый канал может иметь отдельное низкое значение порога, крайне важно, чтобы значения порога канала постоянно поддерживались для всех изображений одного и того же набора данных.
  6. Выберите от трех до пяти вторичных или третичных дендритов и сохраните их в качестве регионов, представляющих интерес (ROIs).
  7. Измерьте плотность каждой рентабельности инвестиций во поверхностных и внутриклеточных каналах.
  8. Нормализовать сигнал для каждой рентабельности инвестиций путем деления значения плотности поверхностного канала на внутриклеточный канал.
  9. Повторите измерения для всех контрольных и экспериментальных изображений и нормализуйте экспериментальные значения для контроля значений (например, GluN2B WT или условия без глицина).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол для изучения торговли рецепторами глутамата основан на дифференциальной маркировке рецепторов, выраженных на поверхности клетки, и тех, которые выражены во внутренних мембранах. Сегрегация достигается путем маркировки рецепторов до и после мембраны permeabilization, используя те же первичные антитела, но вторичные антитела спряжение к другой фторфор. Как указано в дополнительных шагов, включенных в протокол, это очень универсальный метод для допроса различных процессов оборота рецепторов, таких как интернализация и рециркуляция, и может быть легко адаптирована к потребностям следователя (Рисунок 1) .

Во-первых, предусмотрен метод количественной оценки рецепторов, выраженных на поверхности нейронов. Этот протокол позволяет количественно определить экспрессию базальной поверхности, а также изучать молекулярные механизмы, с помощью которых различные препараты или мутации изменяют базальные уровни поверхностно-выраженных рецепторов. Поверхностные рецепторы были впервые помечены инкубации с первичными и вторичными антителами до пермяки. После пермяков с 0,25% Triton X-100, внутриклеточный пул рецепторов доступен для маркировки антител. Чтобы проиллюстрировать этот протокол, поверхность против внутриклеточного окрашивания рецепторов АМРА (АМРАР) в контрольных культурах и после индукции cLTP была проведена. В частности, живые клетки были помечены с помощью антитела против внеклеточного эпитопа в блоку GluA1 AMPAR, и клетки были зафиксированы затем помечены Alexa 555-конъюгированных вторичных. Клетки были затем permeabilized и помечены с темже анти-AMPAR антитела и инкубируется со вторичными антитела мигированы Alexa 647. Эта двойная маркировка позволяет четко визуализировать две популяции GluA1.

После приобретения конфокальных изображений, флуоресцентный сигнал может быть легко количественно, чтобы показать увеличение экспрессии поверхности, по отношению к внутриклеточной популяции, после cLTP(Рисунок 2A,B). В качестве контроля, пермякового шага был пропущен (инкубация с 0,25% Triton X-100) в сестре coverslip и первичное антитело было использовано против PSD-95, стандартный внутриклеточный маркер для возбуждающие синапсы. Как показано на рисунке 2C,сигнал для PSD-95 не может быть получен в непермилифицированных клетках, демонстрируя целостность плазменной мембраны. Это указывает на то, что сигнал, полученный для "поверхностного GluA1", действительно соответствует поверхностным рецепторам (т.е. сигнал для поверхностно выраженного Глякова не включает внутриклеточные рецепторы). Важно отметить, что минимальный сигнал для "внутреннего GluA1" может наблюдаться в условиях непермилизации, показывая, что все поверхностные эпитопы заняты первоначальным раундом маркировки антител (т.е. сигнал для внутриклеточного GluA1 не включает поверхностно выраженных рецепторов).

Второй процесс, который может быть рассмотрен с использованием этого протокола является интернализация поверхностных рецепторов. В частности, поверхностные рецепторы помечены на живой клетке, и нейроны возвращаются в инкубатор на данный момент времени, чтобы пройти интернализацию рецепторов путем клатрина-опосредованного эндоцитоза. После этого шага клетки фиксируются для сохранения пространственного выражения первичных рецепторов, маркированных антителами (т.е. поверхностных и интернализированных рецепторов). Затем поверхностные рецепторы (т.е. те, которые не были интернализированы в период времени интереса), помечены вторичным антителом до пермяки. После пермяки, рецепторы, которые были интернализированы помечены вторичным антителом с различными флюорофорами.

В этом протоколе было изучено, каким образом конкретный фосфорилирование в пределах лиганда PD' из подразделения NMDARs GluN2B (на S1480) индуцирует интернализацию NMDAR. Для этого первичные культуры были трансфицированы фосфо-миметическим рецептором, в котором серин (S1480) был заменен глутаматом (Е). В результате мутант, GluN2B S1480E, действует как "в обязательном порядке фосфорилированной" форме GluN2B. Чтобы облегчить маркировку GluN2B и определить фосфо-миметический мутант, GFP был использован в качестве эпитопа на внеклеточной стороне GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Поверхностные рецепторы на живых клетках были помечены анти-GFP антитела в течение 15 минут на RT. Затем избыток антител промывали условными носителями и возвращали клетки на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы обеспечить эндоцитоз. Затем клетки были зафиксированы, чтобы заморозить движение рецепторов. Рецепторы, которые остались на поверхности, были затем помечены Alexa 555-конъюгированных вторичных антител до permeabilization.

Для выявления рецепторов, которые были интернализированы в течение 30 мин инкубационного периода, клетки были пронизаны, и интернализированные рецепторы (уже помечены первичным антителом) были затем помечены Alexa 647-конъюгированных антител. Опять же, эта стратегия двойной маркировки позволяет количественно определить долю интернализированных рецепторов. Этот пример подчеркивает, что Фосфорилирование GluN2B на S1480 способствует интернализации рецепторов, так как фосфо-миметический мутант S1480E показал гораздо более высокий коэффициент интернализации по сравнению с рецепторами WT(Рисунок 3A,B). В качестве контроля, сестра культуры на 4 кВ была сохранена в условных средств массовой информации во время интернализации сильно замедлить процесс. Как и ожидалось, сигнала для "интернированных" рецепторов в этих условиях(рисунок 3C)не было получено.

Наконец, этот протокол может быть использован для изучения рециркуляции ранее интернализированных рецепторов. Этот вариант протокола является продолжением протокола интернализации, следуя этим рецепторам обратно на поверхность клетки. Есть два ключевых компонента этого варианта. Во-первых, рецепторы, которые оставались застами, выраженными на поверхности в течение всего протокола (т.е. рецепторы, которые не были интернализированы или переработаны), должны быть "заблокированы", чтобы они не были приняты за переработанные рецепторы. Для этого, прежде чем выполнять этап переработки, живые нейроны инкубируются с высокими концентрациями Fab, которые взаимодействуют с первичными рецепторами, маркированными антителами, выраженными на поверхности, чтобы предотвратить дальнейшее связывание фторфора-конъюгированного вторичного Антитела. Во-вторых, интернализация должна быть предотвращена на этапе переработки, так что переработанные рецепторы не повторяются интернализированы. Это было сделано путем добавления диназора в средствах массовой информации во время переработки, как этот препарат блоков процессов зависит от динамина, таких как clathrin-опосредованного эндоцитоза, таких как интернализация NMDAR. В этом протоколе было проведено изучение оборота фосфо-миметического мутанта GluN2B S1480E, а также поверхностная маркировка GFP-GluN2B на живых клетках, что позволило интернализацию в течение 30 мин периода, как это объяснялось ранее.

После этого, поверхностные рецепторы, которые не были интернализированы в течение этого периода были заблокированы путем инкубации клеток с Fab в течение 20 минут на RT. Далее, клетки были снова инкубированы при 37 градусах По Цельсию в течение 45 минут, чтобы позволить ранее интернализированной GluN2B быть переработаны обратно на поверхность клетки. Dynasore присутствовал в средствах массовой информации во время этапа утилизации. Фиксация клеток после этого шага позволяет идентифицировать переработанные рецепторы (т.е. те, которые разблокированы и выражены на поверхности клетки) и интернализированных рецепторов (т.е. тех, которые являются первичными антителами помечены и внутриклеточные). По 1) маркировки переработанных рецепторов с Alexa 555-конъюгированных вторичных антител до permeabilization и 2) маркировки интернализированы, но не переработаны, рецепторы с Alexa 647-конъюгированных вторичных антител, рециркуляции соотношение было создано, чтобы показать, что GluN2B S1480E не оказывает никакого влияния на переработку NMDAR(рисунок 4A,B). В качестве контроля, было обеспечено, что полное блокирование поверхностно выраженных рецепторов произошло путем инкубации сестра coverslips в присутствии или отсутствии Fab, а затем с фиксацией PFA. Как показано на рисунке 4C, сильный сигнал может наблюдаться для поверхности выраженных GluN2B в отсутствие блокировки Fab. Этот сигнал исчезает в Fab-обработанных культур, демонстрируя, что блокирующий протокол достаточно, чтобы полностью блокировать поверхностно выраженные эпитопы и что поверхностные сигналы, наблюдаемые после переработки, действительно соответствуют рецепторам, перекочанным обратно в плазменной мембраны.

Figure 1
Рисунок 1: Схема вариаций протокола для изучения экспрессии поверхности рецепторов, интернализации рецепторов (эндоцитоз) и рециркуляции рецепторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: cLTP увеличивает выражение поверхности GluA1. Первичные гиппокампальные нейроны в DIV21 подвергались химическому LTP (cLTP) путем инкубации с глицин-содержащей ECS. Отличительная маркировка поверхностно выраженных (красных) по сравнению с внутриклеточными (голубыми) популяциями Глякова показывает ожидаемое увеличение поверхностного выражения AMPAR. (A) Одиночный плоскости и (B) стек (максимальная интенсивность проекции) confocal фотографии. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). График показывает увеличенное выражение поверхности GluA1 после протокола cLTP. Индекс экспрессии поверхности: поверхностные/внутриклеточные рецепторы (n No 3; количество клеток: Con 7; cLTP 7; значения представляют среднее значение SEM; »p slt; 0.0001 с помощью теста Mann-Whitney U). (C) Контрольный эксперимент, в котором был пропущен шаг пермяки. В дополнение к поверхности и внутренней GluA1, внутриклеточный возбуждательный синаптический маркер PSD-95 была оценена. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Фосфорилирование GluN2B на S1480 способствует интернализации NMDAR. Первичные гиппокампальные нейроны были трансфицироваться либо GFP-GluN2B WT или фосфо-миметическим мутантом GFP-GluN2B S1480E на DIV11-12. После 3-4 дней экспрессии белка, поверхностный GFP был помечен на живых клетках с антителами кролика anti-GFP и клетки после этого были возвращены к 37 C для того чтобы позволить для интернационализации приемных устройств endocytosis. Поверхностные экзогенные рецепторы были визуализированы с Alexa 555-конъюгированных вторичных антител, и интернализированной популяции, выявленные после permeabilization с помощью Alexa 647-конъюгированных антител. Для ясности, поверхность GFP-GluN2B псевдоокрашена в зеленый цвет и интернализирована GFP-GluN2B псевдоокрашена в белом цвете. (A) Одиночный плоскости и (B) стек (максимальная интенсивность проекции) confocal фотографии. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). График показывает повышенную интернализацию, отображаемую фосфо-миметическим мутантом GluN2B S1480E. Индекс интернализации: интернализированные рецепторы/поверхностно-выраженные рецепторы (n No 6; количество клеток: WT No 34; S1480E No 28; значения представляют собой среднее значение SEM; р Злт; 0,001 с помощью теста Манн-Уитни U). (C) Контрольный эксперимент, в котором шаг интернализации (Intenaliz.) был выполнен при 4 градусах Цельсия. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Фосфорилирование GluN2B на S1480 не изменяет переработку NMDAR. Первичные гиппокампальные нейроны были трансфицироваться либо GFP-GluN2B WT или фосфо-миметических мутантОв GFP-GluN2B S1480E на DIV11-12, как показано на рисунке 3. После 3-4 дней экспрессии белка, поверхностный GFP был помечен на живых клетках с антителами кролика anti-GFP и клетки после этого были возвращены к 37 C для того чтобы позволить для интернационализации приемных устройств endocytosis. Оставшиеся поверхностно-выраженные рецепторы были заблокированы инкубации Fab и рециркуляции было разрешено в течение 45 мин. Доступные поверхностные выраженные экзогенные рецепторы (рециркулированные) были визуализированы с Alexa 555-конъюгированных вторичных антител, и интернализированные популяции, идентифицированной после пермяки с использованием Alexa 647-конъюгированных антител. Для ясности, поверхность GFP-GluN2B псевдоокрашена в белом и интернализирована GFP-GluN2B псевдоокрашена в зеленый цвет.  (A) Одиночный самолет и (B) - стек (максимальная интенсивность проекции) confocal фотографии. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). График показывает отсутствие эффекта GluN2B S1480 фосфорилирования оказывает на переработку. Индекс переработки: переработанные рецепторы/интернированные рецепторы (n No 5; количество клеток: WT No 27; S1480E No 24; значения представляют собой среднее значение SEM; n.s. - незначительный с помощью теста Mann-Whitney U). (C) Контрольный эксперимент, в котором этап инкубации Fab, чтобы блокировать поверхностно выраженные эпитопы, был пропущен. Шкала баров 50 мкм (целая ячейка) или 5 мкм (дендрит). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Взаимодействие между клеткой и ее окружающей средой (например, общение с другими клетками, реакция на различные раздражители и т.д.), в значительной степени зависит от правильного выражения рецепторов на поверхности клетки. Быстрая и отлаженная регуляция содержания поверхностных рецепторов обеспечивает надлежащую клеточную реакцию на постоянно меняющуюся среду. В конкретном случае нейронов, изменения в количестве, локализации и субъединицы состава синаптично выраженных рецепторов сильно влияет на синаптической коммуникации, синаптической пластичности, синаптогенеза, и синаптической обенки3, 5,10. Таким образом, точный анализ экспрессии поверхности рецепторов и механизма, лежащего в основе его регулирования, является важной темой исследования.

Существует ряд условий, с помощью которых может быть изучено выражение поверхности рецепторов. В целом, они подпадают под три основные категории: i) биохимическая изоляция популяции поверхностных рецепторов, ii) методы визуализации рецепторов на поверхности и (iii) функциональные методы мониторинга последствий рецепторов Активации. Эти подходы дополняют друг друга и могут быть использованы в сочетании с ответом на конкретные вопросы о поверхностном выражении рецепторов.

Примеры биохимической изоляции поверхностных рецепторов включают протоколы биотиниляции в культивированных клетках или мозговых ломтиках и субклеточной фракционации культивированных клеток или ткани11. Поверхностная биоинлиниляция основана на маркировке поверхностно выраженных рецепторов биотином путем инкубации культур эстер-активированным биотином. Группа эфира реагирует с первичными аминокислотными группами (-NH2)для формирования стабильных амиданых облигаций. Поскольку этот реагент является клеточным непроницаемым, только поверхностно-выраженные белки помечены биотином. После клеточного лисиса с использованием моющих средств, помеченные рецепторы могут быть восстановлены путем инкубации клеточного лизата с агарозским бисером, спрягаемым с авиддином или его вариантами, которые имеют сильную сродство к биотину, а затем оценены иммуноблоттингом. Субклеточная фракционация является биохимическим протоколом, который использует несколько шагов центрифугации, чтобы изолировать различные клеточные мембранные отсеки на основе их различной плотности12. Оба метода полезны для количественной оценки изменений в поверхностном выражении эндогенных белков и могут быть использованы в сочетании с фармакологическими подходами (как in vivo, так и в культуре) для определения того, как молекулярные манипуляции влияют на экспрессию поверхности рецепторов. Они особенно полезны, поскольку изменения в нескольких эндогенных рецепторах, по отношению к стандарту, могут быть количественно одновременно. Однако, в отличие от методов визуализации, таких, как описано в этом протоколе, пространственное разрешение теряется в результате биохимической обработки образцов.

Описанный здесь протокол относится к категории методов визуализации. Эта группа подходов (таких как поверхностная маркировка и живая клеточная визуализация флуоресцентно отмеченных протеинов) полезна для прививочного разрешения поверхности экспрессии рецепторов. Например, изучая поверхностное против внутриклеточного выражения AMPAR, как это можно проделать ранее, можно изучить, как изменения в выражении произносятся в дендритах (биологическом отсеке, представляющим интерес для данного конкретного приложения). Как и биохимическая фракционация, препараты могут быть использованы с помощью методов визуализации для определения влияния препарата на экспрессию поверхности. Кроме того, трансфекция нейронов с рецепторами, содержащими модификации (мутации или метки) дополнительно уточняет возможности для визуализации. Трансфекция с мутантными рецепторами может очертить влияние конкретной мутации на выражение поверхности.

Другим полезным подходом для визуализации трафика рецепторов является живая микроскопия изображений после трансфекции первичных культур с флуоресцентно помеченными конструкциями, такими как Superecliptic pHluorin (SEP) - или другие конструкции с флюорофором13. SEP-тегами рецепторы могут быть особенно полезны для изучения поверхностных выраженных рецепторов, так как этот флюорофор будет только флуоресцировать при воздействии на внеклеточной среде. Как и в предыдущих примерах, фармакологические подходы могут быть использованы, или мутации, сделанные на рецепторе, чтобы определить, если они изменяют характеристики выражения поверхности рецептора. В случае снадобья, изображение живо-клетки можно использовать для того чтобы контролировать изменения в выражении поверхности в реальное временя. Ограничением для живой визуализации является отсутствие механистического понимания изменений в выражении поверхности. Например, снижение экспрессии поверхности может быть результатом либо повышенной интернализации рецепторов, снижение рециркуляции рецепторов, или и то, и другое.

Чтобы ответить на этот вопрос, протокол, описанный выше, может быть использован. Другим важным событием, которое может быть мониторинг с помощью живых подходов изображения является боковое распространение рецепторов между различными отсеками в плазменной мембране (например, между синаптических и экстрасинапических сайтов). В этом случае методом выбора является использование одночастицсирующих подходов, при которых флуоресцентный полупроводниковый нанокристалл ,т.е. Квантовая точка (D) прикрепляется к антителу против внеклеточного эпитопа на интересующий белок. КД характеризуется замечательной стабильностью (позволяя гораздо меньше фотоотбелений, чем традиционные флуоресцентные белки), сильная яркость, и чередование между включением / выключением статуса ("мигает"). Используя соответствующие настройки микроскопа, можно отслеживать движение одного ЗД (и, следовательно, одного белка, представляющих интерес) через клеточную плазменную мембрану14.

Текущий протокол предусматривает изучение рецепторов в поверхностной популяции, интернализированной популяции и переработанной популяции, что позволяет при расчете соотношений определить, как эти процессы контролируют полное выражение поверхности. Кроме того, прекращение процессов интернализации или рециркуляции в разных временных точках добавляет временное разрешение. Этот метод, таким образом, позволяет для пространственно-временной поверхности экспрессии исследований. В отличие от других методов визуализации, уровни эндогенного экспрессии поверхности также могут быть изучены (например, AMPAR), при условии, что существует антитело против внеклеточной части рецептора. Однако, поскольку этот метод требует фиксации клеток, он не совместим с живой клеточной визуализацией и, таким образом, не может предоставить информацию в режиме реального времени.

Наконец, функциональные подходы, такие как электрофизиология15 или изображения кальция16 являются мощными, хотя и часто косвенными, манерами для изучения поверхностного выражения рецепторов. Эти методы основаны на количественной оценке функциональных изменений в клетке после активации рецепторов (например, изменения мембранного потенциала или концентрации кальция). Используя фармакологию для изоляции реакции данного рецептора, эти методы позволяют точно, пространственно-временно использовать рецепторы, выраженные на поверхности клетки. Эти методы являются универсальными и позволяют изучать клетки в культуре и в более физиологических условиях ex vivo (например, острые ломтики мозга) и in vivo. Однако, как и в случае с живыми подходами к визуализации, механистическая информация часто упускается при использовании функциональных подходов.

Таким образом, сочетание методов для изучения экспрессии поверхности рецепторов может быть использовано, чтобы полностью понять, как экспрессия поверхности контролируется. Представленный здесь протокол особенно силен, поскольку он обеспечивает механистическое понимание пространственно-временной поверхности экспрессии рецепторов в разъединенных первичных культурах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Северо-Западный центр расширенной микроскопии за использование микроскопа Nikon A1 Confocal и их помощь в планировании и анализе экспериментов. Это исследование было поддержано NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), и NIA (R00AG041225) и ГРАНТом для молодых исследователей NARSAD от Фонда исследований мозга и поведения (#24133) (A. S. -C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics