Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Harici uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade reseptörleri kümesine güveniyor. Buna göre, yüzey tarafından ifade edilen reseptörlerin nüfusu sürekli uyarlama ve sıkı düzenleme mekanizmalarına tabidir. Paradigma örneği ve biyolojideki en çok araştırılan kaçakçılık olaylarından biri de glutamat reseptörlerinin (GluRs) sinaptik ifadesinin denetlendiği kontrolidir. GluRs, sinaptik ve nöronal düzeylerde (örneğin, sinaptik plastisite), merkezi sinir sisteminde uyarıcı nörotransmisyon büyük çoğunluğu arabulucu ve fizyolojik aktivite bağımlı fonksiyonel ve yapısal değişiklikler kontrol. Yüzeydeki sayı, konum ve alt birim bileşiminde yapılan değişiklikler, GluRs 'un nöronal fonksiyonları derinden etkilediğini ve aslında bu faktörlerde yapılan değişiklikler farklı nöropati ile ilişkilidir. Burada sunulan, disanated hipokampal primer nöronlar GluR ticareti incelemek için bir yöntemdir. "Antikor-besleme" yaklaşımı, yüzey ve iç membranlarda ifade edilen GluR nüfusunun farklılaşarak görselleştirilmesi için kullanılır. Yüzey reseptörlerini canlı hücrelerde etiketleme ve reseptörlere endositoz ve/veya geri dönüşüm için izin vermek için farklı zamanlarda sabitleme, bu kaçakçılık süreçleri değerlendirilebilir ve seçici olarak incelenebilir. Bu, GluR kaçakçılığı etkileyen uyarıcı ve moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler elde etmek için değiştirilmiş reseptörlerin farmakolojik yaklaşımlar veya aşırı ifade edilmesi ile birlikte kullanılabilecek çok yönlü bir protokoldür. Benzer şekilde, diğer reseptörleri veya yüzey ifade proteinleri çalışmak için kolayca adapte edilebilir.

Introduction

Hücreler, proteinleri belirli alt hücresel lokalize olarak seferber etmek ve fonksiyonları1üzerinde sıkı bir mekan düzenlemesi yapmak için aktif ticaretini kullanır. Bu süreç özellikle transmembran reseptörleri için önemlidir, farklı çevresel uyaranlara hücresel tepkiler reseptör aktivasyonu ile tetiklenen hücre içi Cascades güveniyor gibi. Hücreler reseptör hücre altı ticareti düzenleme2ile hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin yoğunluğu, lokalizasyonu ve alt birim bileşimi değiştirerek bu yanıtları değiştirebilir. Yeni sentezlenmiş reseptörlerin plazma membranı içine yerleştirilmesi, endositoz ve mevcut reseptörlerin geri dönüşümünün yanı sıra yüzey-ifade reseptörlerinin net havuzunu belirleyen kaçakçılık süreçlerine örnektir2. Protein kaçakçılığı düzenleyen birçok Moleküler mekanizma işbirliği, proteinli protein etkileşimleri ve fosforilasyon, ubiquitination gibi posttranslasyonel modifikasyonlar, veya palmitoyasyon2.

Reseptör kaçakçılığının düzenlenmesi özellikle çok özel yapılarla güçlü polarize hücrelerde gereklidir. Paradigmatik örnek glutamat reseptörleri (glurs)3,4düzenlenmiş ticareti ile nöronal fonksiyon kontrolü. Glutamat, ana uyarıcı nörotransmitter, bağlar ve yüzey-ifade GluRs sinaptik nörotransmisyon ve sinaptik plastisite gibi temel fizyolojik nöronal fonksiyonları kontrol etmek için etkinleştirir. Nöro-gelişimsel bozukluklardan nörodejeneratif hastalıklara kadar uzanan geniş bir nöropati yelpazesinde GluR kaçakçılığı değiştirildiği gerçeğini bu sürecin5' in önemini vurgulamaktadır. Böylece, GluR kaçakçılığı kontrol eden moleküler olayların anlaşılması araştırma birçok alanda ilgi olduğunu.

Bu protokolde, primer hipokampal nöronların yüzey seviyesinin ölçülmesi için antikor beslemeli bir yöntem kullanılır, aynı zamanda ınterpralization ve geri dönüşümdeki değişikliklerin gözlenen net yüzey ifadesinde nasıl sonuçlanduğunu değerlendirebilirsiniz. Spesifik mutasyonları kullanan eksojen reseptörlerin farmakolojisinin ve/veya aşırı ifadesinin kullanımı, bu protokol, farklı çevresel uyaranlara nöronal adaptasyon temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için özellikle güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu protokolün son örneği, ortamda (örneğin, bir hastalık modelinde), bu tür modellerde yüzey ifadesinin incelenmesi yoluyla GluR kaçakçılığı etkilemesi konusunda ne kadar multifokal değişiklikler yapılacağını okuyor.

Belirli örnekler kullanarak, başlangıçta fizyolojik sinaptik stimülasyon taklit bir farmakolojik manipülasyon nasıl gösterilmiştir [kimyasal LTP (cltp)] AMPA-glurs tipi (ampars) endojen GluA1 altbirim yüzey ifadesi artar 6. NMDA-türü glurs (nmdars) GluN2B altbirim bir aşırı ifade fosho-mimetic formu ticareti de bu protokol belirli posttranslasyonel tarafından Glur kaçakçılığı düzenlenmesi çalışmak için nasıl kullanılabilirler örnek olarak analiz edilir Değişiklik. Bu özel örnekler kullanılsa da, bu protokol diğer GluRs ve diğer reseptörlere ve antijenik hücre dışı alanlara sahip olan proteinler için kolayca uygulanabilir. Hücre dışı alanlar için mevcut antikorlar olmadığı durumda, ekstrelüler epitope etiketli (örn., bayrak-, MYC-, GFP-Tagged, vb.) proteinleri protein etiketlemeye yardımcı olabilir.

Geçerli protokol, spesifik antikorlar kullanarak belirli GluR alt tipi yoğunluğunu ve kaçakçılığı ölçmek için yönergeler sağlar. Bu protokol 1) Toplam GluR yüzey ifadesi, 2) GluR etilleştirme ve 3) GluR geri dönüşümü için kullanılabilir. Her bir işlemi bireysel olarak incelemek için 1 ve 2 bölümlerle başlamak ve 3, 4 veya 5 bölümüne devam etmeniz önerilir. Her durumda, 6 ve 8 bölümlerle bitir (Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hipokampal İlköğretim kültürü hazırlığı ile ilgili çalışmalar Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol #IS00001151) tarafından incelendi ve onaylanmıştır.

1. etiketleme öncesi hazırlık

  1. Primer hipokampal kültürlerin hazırlanması ve Bakımı
    1. Primer hipokampal kültürlerini Poly-D-lizin kaplı (0,1 mg/mL) 18 mm kapak gözlüklerinde kaplama 150.000 hücrelerin yoğunluğunda hazırlayın. Dissosyated nöronal kültür hazırlığı için mükemmel kılavuzlar7,8mevcuttur.
      Not: Gerekirse, kültürler, hazırlıkta glial proliferasyonu önlemek için sitosin arabinozid (ara-C, Div1 kullanılmaktadır den 10 mm) ile tedavi edilebilir.
      Not: Poli-D-lizin yerine fibronektin (1 mg/mL) veya laminin (5 mg/mL) gibi alternatif kaplama reaktifler kullanılabilir.
    2. 37 °C ve 5% CO2 ' de 2 ml/iyi neurobazal medyanın, B27 ve 2 mm L-glutamin ile takviye edilen bir hücre inkükokosu kültürlerini koruyun.
      Not: L-glutamin yerine (örneğin, Glutamax) istenirse kullanılabilir.
    3. Haftalık bazda, ortamın yarı hacmini kaldırın ve aynı hacimli nörobazal medya ile değiştirin.
  2. OPSIYONEL: mutasyona uğramış ve/veya epitope etiketli reseptörlerin transfeksiyon
    Not:
    nöronlar reseptör ifadesi için izin vermek için analiz zaman noktasından en az 3 – 4 gün önce transfitleştirilebilir. Genç nöronların kullanımı [Days In vitro 6 – 9 (DIV6)] daha eski daha iyi transfeksiyon verimliliği sonuçlanır (DIV15 – 20) nöronlar, ama transfekte hücrelerin yeterli sayıda (> 20) ne olursa olsun DIV istihdam elde edilebilir.
    1. Her iyi için bir 12-kuyu plaka, seyreltme 1,5 μg Plasmid ile ilgili yapı içeren 100 μL yeni nörobasal medya içinde B27 veya glutamin takviyesi olmadan bir mikrosantrifüjden tüp ve karışımı ile hızlı bir şekilde vortekslenir.
      Not: Başarılı transfeksiyon için, kullanılan nörobazal medyanın mümkün olduğunca taze, şişe açıldıktan sonra 1 haftadan daha az olması önemlidir.
    2. İkinci bir mikrosantrifüj tüpte, 100 μL 'de uygun bir lipofeksiyon reakajının 1 μL değerini taze nörobazal medya ile karıştırın ve nazikçe karıştırın.
      Not: Lipofeksiyon reakajının karışımına girdap yapmayın. Taze lipofeksiyon reaktiflerin kullanımı transfeksiyon verimliliğini artırabilir.
    3. Tüplerin oda sıcaklığında (RT) 5 dakika süreyle inküytir.
    4. DNA karışımı için lipofection reaktif karışımı dropwise ekleyin, hafifçe karıştırın ve RT 20 dakika boyunca inküye.
    5. Ortamın hacmini her iyi 1 mL 'ye kadar ayarlanabilir medya olarak ayarlayın.
    6. Lipofection reakajı ekleyin-DNA karışımı kuymaya dropwise.
    7. Hücreleri inkükule dönün ve protein ifadesi için en az 3 – 4 gün izin verin.
      Not: Aşağıda özetlenen ınterevalizasyon ve geri dönüşüm protokollerinin amaçları için, hipokampal nöronlar DIV11 – 12 ' de transfidat edildi ve DIV15 – 16 ' da görüntülenmiş, GluN2B ' de GFP ile etiketlenen (GFP-GluN2B)
  3. OPSIYONEL: sabitlenme kadar, şartlý medyada ilaçlar (kronik veya acutely) ile hücrelerin Inkübasyon.
    Not:
    akut tedavi için, etiketleme öncesinde hücreleri tedavi etmeye başlayın. Kullanılan ilaç tedavi protokolüne bağlı olarak, hücreler Bölüm 2 ' de ilaç içeren medyada muhafaza edilebilir. Bizim örneğimizde, DIV21 hücreler yüzey ifade AMPAR9artırmak Için bir cltp protokolüne tabi.
    1. Ekstrellüler çözüm (ECS) için Döviz şartında medya.
    2. RT 'de 3 dakika boyunca ECS 'de 300 μM gcine ile hücreleri tedavi edin. Bir kontrol olarak, ECS ile bir kardeş lamel magazini tedavi (glisiye olmadan).
    3. 37 °C ECS ile hücreleri 3x yıkayın ve Bölüm 2 ile devam etmeden önce 20 dakika boyunca hücre kuluçkan (Glycine olmadan) ECS hücreleri döndürür.
      Not: ECS (mm cinsinden): 150 NaCl, 2 CAcl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 GLIKOZ, 0,001 TTX, 0,01 Strychnine, ve 0,03 picrotoksin pH 7,4.

2. yüzey etiketleme canlı-ifade reseptörleri

  1. Etiketleme için coverfiş hazırlamak
    1. Reaktifler kaydetmek ve manipülasyon kolaylaştırmak için, Transfer Cover, hücre tarafı kadar bir parafin film kaplı tepsi.
      Not: Numunelerin kurumasına asla izin vermek önemlidir.
    2. 37 °C ' de inkübasyon ve yıkama basamakları için şartlama ortamını kaydedin ve koruyun.
      Not: 18 mm 'lik coverslip için, antikor etiketleme için 75 – 100 μL medyaya sahip inkübasyon ve ıntermerasyon/geri dönüşüm için 120 – 150 μL önerilir.
  2. Primer antikor ile yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
    1. RT 'de 15 dakika boyunca, şartların bulunduğu ortamlarda seyreltilmiş primer antikor hücrelerine sahip hücreler.
      Not: GFP-Tagged reseptörleri için, 1:1000 bir seyreltme tavşan Anti-GFP antikor kullanıldı. Endojen GluA1 için, fare Anti-GluA1 bir 1:200 seyreltme kullanılmıştır.
    2. Bir vakum pipet kullanarak antikor içeren medyayı dikkatle Aspire ve hücrelerle üç kez yıkayın.
      Not: Şartlanmış medya kullanılamıyorsa, tüm yıkama adımları 1 mM MgCl2 ve 0,1 mm CAcl2] içeren PBS + [fosfat TAMPONLU tuz (PBS) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Yumuşak vakum aspirasyonu mevcut değilse bir mikropipet kullanarak manuel aspirasyon yapılabilir.

3. yüzey Ifadesi (Şekil 2)

  1. Yüzey-ifade reseptörleri ikincil antikor etiketleme
    1. PBS + ile bir kez yıkayın.
    2. % 4 paraformaldehit (PFA) ve 7 ila 8 dakika PBS 'de% 4 sukroz ile inküperasyon hücreleri düzeltin.
      Not: Metanol inkübasyon gibi diğer sabitleme yöntemlerinin aksine, PFA plazma membranı geçirmez ve bu nedenle yüzey ifade analizi için uygundur. Optimum sonuçlar için taze hazırlanmış PFA kullanın. PFA 'nın 4 °C ' de veya uzun süreli (30 gün kadar) depolama alanı-20 °C ' de kısa süreli depolanması, yeterli sabitleme için uygundur.
      Dikkat: PFA bilinen bir kanserojen olduğunu. Kullanım sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın.
      Not: Alternatif olarak, 0,1 M gcine, PBS yerine PFA yıkamak için kullanılabilir, çünkü glisin hazırlanmasında arka plan artırabilir herhangi bir geri kalan fikfatif giderecek.
    4. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkükleme yaparak nonspesifik bağlayıcı siteleri engelleyin.
      Not: Engelleme süresi etiketleme üzerinde olumsuz etkileri olmadan uzatılabilir.
    5. Primer antikor etiketli reseptörlere (örn. yüzey ifade) etiket eklemek için PBS 'de% 3 NGS 'de% 1 h olarak floresan etiketli ikincil antikor ile inküye yapın.
      Not: Bu örneklerde, Alexa 555-konjuze ikincil antikorların bir 1:500 seyreltme: GFP etiketli reseptörleri için keçi Anti-tavşan ve GluA1 için keçi Anti-Mouse kullanıldı.
    6. Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
  2. Hücre içi reseptörlerin etiketlenmesi
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri RT 'de 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
      Not: Antikor etiketleme ilk turda tüm yüzey epitopes kaplar kontrol etmek için, bu geçirgen adım bir kardeş kültüründe atılabilir. Bu durumda, hücre içi reseptörleri için hiçbir sinyal elde edilmelidir. Ayrıca, önceki bölüm 2 ' de hiçbir iç reseptörlerin etiketlenmemiş olduğunu kontrol etmek için (yani, kültürde plazma membranlarının bütünlüğünü gösteren), bir kardeş kültüründe geçirgen adım atılabilir ve bir ana antikor hücre içi protein (örn., PSD-95 veya MAP2) adım 2.2.1 ' de kullanılabilir. Bu koşullar altında bu birincil gelen sinyal alınamıyor. Bu durumda, bir tavşan Anti-PSD-95 antikor (1:500) kullanıldı.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.
    3. Etiket hücre içi reseptörleri, 1 h RT 'de PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş, Bölüm 2,2 kullanılan aynı primer antikor ile geçirgenleştirilmiş hücreleri inküt ederek.
      Not: Hücre içi reseptörleri etiketleme için antikor seyreltme yüzey ifade reseptörleri etiketleme için gerekli olandan farklı olabilir. GluA1 örneğinde aynı antikor seyreltme (1:200) kullanılmıştır.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    5. İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş.
      Not: Bu örneklerde, keçi Anti-fare Alexa 647-konjudi ikincil antikor (GluA1 için) bir 1:500 seyreltme kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

4. ınterilasyon (Şekil 3)

  1. Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
    1. Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek.
      Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk. Bir kontrol olarak, bir kız kardeş kültürü, staj sürecinde 4 °C ' de şartla medya ile korunabilir. Bu koşullarda minimal reseptör ıntertralization gerçekleşmelidir.
  2. Yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
    1. PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.
    2. PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin.
      Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Normal PBS ile 3x hücreleri yıkayın.
    4. PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.
    5. Primer antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için PBS 'de% 3 NGS 'de 1 h olarak seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri inkük (örn.
      Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
  3. Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile inkübasyon ile nonspesifik bağlayıcılığı engelleyin.
    3. Örneklenmiş antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri kulbin.
      Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanılır.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

5. geri dönüşüm (Şekil 4)

  1. Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
    1. Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek.
      Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk.
  2. İstikrarlı yüzey bloke reseptörleri ifade
    1. Birincil antikor üzerinde epitopları engellemek için yüzey bağlı-inküslenmemiş reseptörleri ifade, bilirubinin fab Anti-IgG (H + L) antikor parçaları ile hücreleri kuluzlar (Bölüm 2,2 kullanılan birincil karşı) şartsız medyada seyreltilmiş ( 20 μg/mL) RT 'de 20 dk. Bu tedavi ikincil antikorlarla gelecekteki etkileşimi önler.
      Not: Bu örnekte, keçi Anti-tavşan fab parçaları kullanıldı.
      Not: Kontrol deneyi: yüzeyi ifade eden reseptörlerin tam olarak engellendiğinden emin olmak için, kardeş coverfları fab olmadan ve birlikte inkübe edilebilir. Kültürler fab tedavisinden hemen sonra düzeltilmelidir ve her iki kültür Alexa 555-konjued ikincil antikor ile inkübe edilir. Hiçbir Alexa 555 fab-inkübe hücrelerinde sinyal uygun antikor engelleme gösterir.
    2. 3x hücreleri, Klima ortamıyla yıkayın.
    3. 80 μM dynasore içeren ve daha fazla inküvatör (37 ° c) ' ye geri dönüşlerini önlemek için, ıntereralize reseptörlerin geri dönüşümüne izin vermek üzere hücreler, Dynasore, Dynamin 'i inhibe eden ve bu nedenle ınferalizasyonu engelleyen bir GTPase inhibitörü.
      Not: 45 MIN NMDAR geri dönüşümü için tavsiye edilir. Dynasore 'un Dynamin 'e bağımlı olan (örneğin, NMDARs) Ancak, diğer sinaptik protein (Dynamin-bağımsız), Disseleştirme hala Dynasore varlığında ortaya çıkabilir.
  3. Geri dönüşümlü reseptörlerin etiketleme
    1. PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.
    2. PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin.
      Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    4. PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.
    5. İlk floresan etiketli ikincil antikor ile etiket hücreleri, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilir.
      Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
      Not: PBS (5 – 10 dk) ile daha uzun yıkanabilir preparat arka plan azaltmak için yardımcı olabilir.
  4. Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.
    3. İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş.
      Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

6. numunelerin montajı ve görüntülenmesi

  1. Cover kuponları hücre tarafını yavaşça 12 – 15 mL 'ye uygun montaj ortamına yerleştirerek hücreleri bağlayın.
    Not: Aşırı montaj ortamının aspirasyonu görüntülerin kalitesini artıracaktır.
  2. Uygun bir Konfokal mikroskop üzerinde görüntü hücreleri.
    Not: 0,35 μm basamaklarla 60x büyümede z-yığını görüntü için tavsiye edilir, nöronun tüm kalınlığını kapsayan.

7. zaman hususlar

  1. Bu, çeşitli noktalarda durdurulabilir uzun bir protokoldür. İstenirse, nemli bir odada bir gecede 4 °C ' de engelleme ve primer antikor inkübasyon adımlarını gerçekleştirin.
  2. Alternatif olarak, istenirse, büyük ölçüde sonrası sabitleme kuluçlan süreleri hızlandırmak için bir mikrodalga doku işlemci kullanın. Tüm adımlar için, "on" ayarları için 30 °C ' de W 150 kullanın.
    1. Engellemek için 2 dk "açık", 1 dk "kapalı" ve 2 dk "açık" işlemciyi çalıştırın.
    2. Primer ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, 3 dk "açık", 2 dk "kapalı" ve 3 dk "on" işlemci çalıştırın.
      Not: Biz protokole yukarıdaki değişiklikleri yaparak kalite hiçbir fark gözlemlemek.

8. görüntü analizi

  1. Birden çok dosya formatı ile uyumlu olduğu için, resim analizi yapmak için FIJI < https:/fıji.SC/> kullanmanız önerilir. Verilerimiz için, Nikon ND2 dosya formatında görüntüler elde edildi.
  2. FIJI tarafından önceden seçilmiş farklı parametrelerin kolay toplu ölçülmesini sağlamak için bir makro komut dosyası sağlanır. Aşağıdaki adımlar makroda yer alır:
    Not: Bu örnekler için "entegre yoğunluk" ölçülmüştür.
  3. FIJI ve ayrı kanallar görüntü dosyalarını açın.
  4. Z-her kanal yığınını maksimum yoğunluk projeksiyon olarak proje.
  5. Her kanal için daha düşük bir eşik ayarlayın.
    Not: Eşikleri her deneysel veri kümesi için ampirik olarak belirlenmelidir. Her kanal ayrı bir alt eşik değerine sahip olsa da, kanal eşik değerlerinin aynı veri kümesinin tüm görüntüleri için tutarlı bir şekilde korunduğu önemlidir.
  6. Üç ila beş ikincil veya üçüncül dendritler seçin ve ilgi bölgeleri (roıs) olarak kaydedin.
  7. Yüzey ve hücre içi kanallarda her YG 'nin entegre yoğunluğunu ölçün.
  8. Yüzey kanalının Tümleşik yoğunluk değerini hücre içi kanalla bölerek her YG için sinyali normalleştirin.
  9. Tüm kontrol ve deneysel görüntüler için ölçümleri tekrarlayın ve değerleri kontrol etmek için deneysel değerleri normalleştirmek (örn. GluN2B WT veya No-Glycine koşulları).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Glutamat reseptör kaçakçılığı incelemek için bu protokol hücre yüzeyinde ifade reseptörleri diferansiyel etiketleme dayanmaktadır ve bu iç membranlarda ifade. Ayrım önce ve membran geçirmezlik sonra reseptörleri etiketleme tarafından elde edilir, aynı primer antikor ancak farklı bir fluorophore konjuate ikincil bir antikor kullanarak. Protokol dahil isteğe bağlı adımlarla özetlendiği gibi, bu, farklı reseptör kaçakçılığı süreçleri sorgulamak için çok yönlü bir yöntemdir, gibi idarlaştırma ve geri dönüşüm gibi, ve kolayca araştırmacı ihtiyaçlarına adapte edilebilir (Şekil 1) .

Öncelikle, nöronal yüzeyde ifade edilen reseptörlerin ölçülmesini sağlamak için bir yöntem sağlanır. Bu protokol, bazal yüzey ifadesinin ölçülmesine ve farklı ilaçların veya mutasyonların yüzey-ifade edilen reseptörlerin bazal seviyelerini değiştirdiği moleküler mekanizmaların incelenmesi için izin verir. Yüzeyde ifade edilen reseptörler ilk olarak hem primer hem de ikincil antikor ile geçirgen olarak işaretlenmiştir. % 0,25 Triton X-100 ile geçirgen sonra reseptörlerin hücre içi havuzu antikor etiketleme için erişilebilir. Bu protokolü göstermek için, kontrol kültürlerinde AMPA reseptörlerinin (AMPARs) hücre içi lekeleme ve cLTP indüksiyonunda yüzey karşılaştırması yapılmıştır. Özellikle, canlı hücreler Ampar GluA1 altbirim bir ekstrellüler epitopu karşı bir antikor kullanılarak etiketli ve hücreler sonra Alexa 555 ile etiketlenmiş sabit-konjued ikincil. Hücreler sonra geçirgen ve aynı anti-AMPAR antikor ile etiketlenmiş ve Alexa 647 için konjudi ikincil bir antikor ile inkübe edildi. Bu çift etiketleme iki GluA1 nüfus net görselleştirme sağlar.

Konfokk görüntüler aldıktan sonra, floresan sinyal kolayca hücre içi nüfus göreli olarak yüzey ifadesinde bir artış göstermek için nicelleşmiş olabilir, cLTP aşağıdaki (Şekil 2a, B). Kontrol olarak, bir kız kardeş lamel magazini içinde geçirgen adım (0,25% Triton X-100 ile kuluçta) atlandı ve PSD-95, uyarıcı sinaps için standart bir hücre içi marker karşı bir primer antikor kullanıldı. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, plazma membranın bütünlüğünü gösteren, geçirgen olmayan HÜCRELERDE PSD-95 için hiçbir sinyal elde edilemez. Bu, "Surface GluA1" için elde edilen sinyalin gerçekten yüzey tarafından ifade edilen reseptörlere karşılık geldiğini gösterir (yani, yüzey için sinyal GluA1 hücre içi reseptörleri içermez). Daha da önemlisi, "GluA1" için minimal bir sinyal, tüm yüzey epitellerinin antikor etiketleme (yani, hücre içi GluA1 için sinyal dahil değildir) ilk turu ile işgal edildiğini gösteren, olmayan-geçirmezlik koşullarında gözlemlenebilir yüzey-ifade reseptörleri).

Bu protokol kullanılarak incelenebilir ikinci bir süreç yüzey-ifade reseptörlerin ınterselleştirme olduğunu. Özellikle, yüzey reseptörleri canlı bir hücreye etiketlenmiştir, ve nöronlar Clathrin-aracılı endositoz tarafından reseptör ıntertralizasyon geçmesi için belirli bir süre için kuluçz döndürülür. Bu adımda, hücreler primer antikor etiketli reseptörlerin uzamsal ifadesini korumak için sabitlenir (örn. Daha sonra, yüzey reseptörleri (yani, ilgi zaman diliminde içselleştirilmemiş olanlar), geçirmezlik öncesinde ikincil bir antikor ile etiketlenmiştir. Geçirgen takip edilen reseptörler, farklı bir fluorophore ile ikincil bir antikor tarafından etiketlenmiştir.

Bu protokolde, nmdars (S1480 at) GluN2B altbirim PDZ ligand içinde belirli bir fosforilasyon NMDAR ınterflation indükler nasıl incelendi. Bunu yapmak için, primer kültürler bir fosho-mimetik reseptör ile nakli yapıldı, hangi serin (S1480) glutamat yerine oldu (E). Sonuç mutant, GluN2B S1480E, bir "kurucu-phosphorylated" formu GluN2B olarak davranır. GluN2B etiketleme kolaylığı ve fosho-mimetic mutant tanımlamak için, Gfp GluN2B (Gfp-GluN2B S1480E) ekstrasellüler tarafında bir epitopu etiketi olarak kullanıldı. Canlı hücrelerdeki yüzey reseptörleri RT 'de 15 dakika boyunca Anti-GFP antikor ile etiketlenmiştir. Daha sonra, aşırı antikor, şartlarla yıkanmış ve endossitoz için 30 dakika boyunca 37 °C ' ye kadar hücreleri geri döndürdü. Sonra, hücreler reseptör hareketini dondurmak için düzeltildi. Yüzeyde kalan reseptörleri sonra Alexa 555 ile etiketlenmiş-konjuli ikincil antikor önce geçirmezleştirme.

30 dk kuluçdak döneminde inkübasyon yapılmış reseptörleri belirlemek için, hücreler,, ve (zaten bir primer antikor ile etiketlenmiş) emdirilmiş reseptörleri daha sonra Alexa 647-konjudi antikor ile etiketlenmiş olarak Yine bu çift etiketleme stratejisi, ınterselleştirilmiş reseptörlerin oranının ölçülmesini sağlar. Bu örnek, GluN2B fosforilasyon S1480 de reseptör etselleştirme teşvik vurgular, fosho-mimetic mutant S1480E olarak WT reseptörlerine göre çok daha yüksek bir atılaştırma oranı gösteriliyor (Şekil 3A, B). Kontrol olarak, 4 °C ' de bir kız kardeş kültürü, süreci şiddetle yavaşlatmak için ınterselleştirme sırasında şartla medyada sürdürülmüştür. Beklendiği gibi, bu koşullar altında "içselleştirilmiş" reseptörleri için sinyal elde edildi (Şekil 3c).

Son olarak, bu protokol daha önce ınterevalize reseptörlerin geri dönüşümü incelemek için kullanılabilir. Bu protokol varyasyonu, bu reseptörleri hücre yüzeyine geri izleyerek, staj protokolünün devamıdır. Bu varyasyonun iki önemli bileşeni vardır. İlk olarak, tüm protokol sırasında yüzeyde stabil olarak ifade edilen reseptörler (yani, içselleştirilmiş veya geri dönüşümlü olmayan reseptörler) geri dönüşümlü reseptörlere yanılmıyorlarsa "engellenmiş" olmalıdır. Bunu yapmak için, geri dönüşüm adımını yapmadan önce, canlı nöronlar, fluorophore-konjuyum ikincil bağlayıcı daha fazla bağlama önlemek için yüzeyde ifade primer antikor etiketli reseptörlerle etkileşim fab yüksek konsantrasyonlarda inkübe edilir Antikor. İkinci olarak, geri dönüşümlü reseptörlerin tekrar idama dönmemelidir, böylece yeniden dönüşüm aşaması sırasında iligalizasyon önlenmelidir. Bu ilaç blokları gibi Clathrin-aracılı endositoz gibi Dynamin, NMDAR dişme gibi dinamin üzerinde güvenir olarak geri dönüşüm sırasında medyaya dynasore ekleyerek yapıldı. Bu protokolde, fosho-mimetic mutant GluN2B S1480E kaçakçılığının yanı sıra, daha önce açıklandığı gibi 30 dakika süre boyunca inilasyon için izin verilen canlı hücrelerde GFP-GluN2B yüzey etiketlemesi de yapıldı.

Bunun ardından, bu dönemde staj olmayan yüzey reseptörleri, RT 'de 20 dakika boyunca fab ile hücreleri inkübe ederek engellendi. Daha sonra, hücreler tekrar hücre yüzeyine geri dönüştürülmesine izin vermek için 45 dakika için 37 °C ' de yeniden inkübe edildi. Dynasore, geri dönüşüm aşamasında medyada bulunuyordu. Bu adımı takiben hücrelerin sabitleme geri dönüşümlü reseptörlerin tanımlanması için izin verir (yani, bu bloke edilmemiş ve hücre yüzeyinde ifade) ve inselleştirilmiş reseptörleri (yani, birincil antikor etiketli ve hücre içi olanlar). 1) bir Alexa 555 ile geri dönüşümlü reseptörleri etiketleme-konjuti ikincil antikor önce geçirmezleştirme ve 2), ancak geri dönüşümlü değil, Alexa 647-konjudi ikincil antikor ile reseptörleri, bir geri dönüşüm oranı göstermek için oluşturuldu GluN2B S1480E NMDAR geri dönüşümü üzerinde herhangi bir etkiye sahip değildir (Şekil 4A, B). Bir kontrol olarak, yüzey ifade reseptörlerinin tam engelleme, Fab varlığı veya yokluğunda kız kardeş Cover, PFA fiktasyonu ile takip tarafından meydana gelen garantiliydi. Şekil 4c'de gösterildiği gibi, Fab engelleme yokluğunda GluN2B ifade edilen yüzey için güçlü bir sinyal gözlenebilir. Bu sinyal fab-tedavi kültürler kaybolur, engelleme protokolünün tamamen yüzey ifade epitopları engellemek için yeterli olduğunu gösteren ve geri dönüşüm sonra gözlenen yüzey sinyalleri gerçekten reseptörlere karşılık geriye karşı trafik plazma membranı.

Figure 1
Şekil 1: reseptör yüzey ifadesi, reseptör ıntertralization (endositoz) ve reseptör geri dönüşümü okumak için protokol varyasyonları şematik. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: cLTP GluA1 yüzey ifadesini artırır. DIV21 'de primer hipokampal nöronlar, glisere içeren ECS ile inkükleyerek kimyasal LTP 'ye (cLTP) tabi tutulmuştur. Farklı yüzey etiketleme-ifade (kırmızı) vs hücre içi (mavi) GluA1 nüfus AMPAR yüzey ifadesinde beklenen artış ortaya çıkarır. (A) tek düzlem ve (B) Z-yığılmış (maksimum yoğunlukta projeksiyon) Konfokal resimler. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Grafik, cLTP protokolünden sonra GluA1 artan yüzey ifadesini gösterir. Yüzey ifade indeksi: yüzey/hücreler arası reseptörler (n = 3; hücre sayısı: con = 7; cLTP = 7; değerler Mean ± SEM; * * * * p < 0,0001 Mann-Whitney U testini kullanarak) gösterir. (C) geçirgen adımının atlandığı kontrol deneyi. Yüzey ve iç GluA1 ek olarak, hücre içi uyarıcı sinaptik Marker PSD-95 değerlendirildi. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: S1480 ' de GluN2B Phosphorylation NMDAR Interpolasyon teşvik eder. Primer hipokampal nöronlar, DIV11-12 üzerinde GFP-GluN2B WT veya phospho-mimetic mutant GFP-GluN2B S1480E ile transfikasyona uğramış. 3-4 sonra protein ifadesi gün, yüzey GFP bir tavşan Anti-GFP antikor ile canlı hücrelerde etiketli ve hücreler daha sonra geri döndü 37 °C endositoz tarafından reseptör ıntertralization için izin. Yüzey-ifade eksojen reseptörleri Alexa 555 ile görselleştirildi-konjudi ikincil antikor, ve Alexa 647-konjudi antikor kullanarak geçirgenlik sonra tanımlanan içselleştirilmiş nüfus. Netlik için, yüzey GFP-GluN2B yeşil ve içselleştirilmiş GFP-GluN2B pseudorenkli beyaz pseudorenkli olduğunu. (A) tek düzlem ve (B) Z-yığılmış (maksimum yoğunlukta projeksiyon) Konfokal resimler. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Grafik fosho-mimetic mutant GluN2B S1480E tarafından görüntülenen yüksek inilasyon gösterir. Internalization endeksi: ınterselleştirilmiş reseptörler/yüzey ifade reseptörleri (n = 6; hücre sayısı: WT = 34; S1480E = 28; değerleri ortalama ± SEM temsil eder; p < 0,001 Mann-Whitney U testini kullanarak). (C) 4 °c ' de (Intenaliz.) atılaşma adımının yapıldığı kontrol deneyi. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: S1480 'de GluN2B Phosphorylation NMDAR geri dönüşümü değiştirmez. Primer hipokampal nöronlar, Şekil 3' te gösterildiği gibi Gfp-GluN2B WT ya da DIV11-12 ' de fosho-mimetic mutant Gfp-GluN2B S1480E ile transfikasyona uğramış. 3-4 sonra protein ifadesi gün, yüzey GFP bir tavşan Anti-GFP antikor ile canlı hücrelerde etiketli ve hücreler daha sonra geri döndü 37 °C endositoz tarafından reseptör ıntertralization için izin. Kalan yüzey-ifade reseptörleri fab inkübasyon tarafından engellendi ve geri dönüşüm için izin verildi 45 dk. kullanılabilir yüzey eksojen reseptörleri (geri dönüştürülmüş) Alexa 555-konjuke ikincil antikor ile görselleştirildi ve inişalize nüfus, Alexa 647-konjuit antikor kullanarak geçirgen sonra tespit edilmiştir. Berraklık için, yüzey GFP-GluN2B beyaz pseudorenkli ve ınterselleştirilmiş GFP-GluN2B yeşil pseudorenkli.  (A) tek düzlem ve (B) Z-yığılmış (Maksimum yoğunluk projeksiyon) konfokk resimler. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Grafik GluN2B S1480 fosforilasyon geri dönüşüm vardır etkisi eksikliği gösterir. Geri dönüşüm endeksi: geri dönüşümlü reseptörler/ınternalized reseptörleri (n = 5; hücre sayısı: WT = 27; S1480E = 24; değerleri ortalama ± SEM temsil eder; NS = Mann-Whitney U testini kullanarak önemli olmayan). (C) yüzey ifade edilen epiteklerin engellendiği fab kuluçku adımının atlandığı kontrol deneyi. Ölçek çubukları = 50 μm (tam hücre) veya 5 μm (dendrite). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir hücre ile çevre arasındaki etkileşim (örn. diğer hücrelerle iletişim, farklı uyaranlara yanıt vb.), hücre yüzeyinde reseptörlerin doğru ifadesine ağır dayanır. Yüzeydeki hızlı ve ince ayarlı düzenleme reseptör içeriği sürekli değişen bir ortama uygun hücresel yanıt sağlar. Nöronlar belirli durumda, sayı, yerelleştirme ve synaptically ifade reseptörlerinin alt bileşiminde değişiklikler ağır sinaptik iletişim etkiler, sinaptik plastisite, synaptogenit, ve sinaptik budama3, 5,10. Bu nedenle reseptör yüzey ifadesinin doğru analizi ve yönetmeliğinin temelindeki mekanizma araştırma önemli bir konudur.

Reseptör yüzeyi ifadesinin inceleneceği bir dizi modaliteler vardır. Genel olarak, bu üç ana kategorinin altında düşüş: (i) yüzeyin biyokimyasal yalıtım ifade reseptör nüfus, (ii) yüzey reseptörleri görselleştirmek için görüntüleme teknikleri, ve (iii) reseptör sonuçlarını izlemek için fonksiyonel teknikler Etkinleştirme. Bu yaklaşımlar tamamlayıcı ve reseptörlerin yüzey ifadesi hakkında belirli sorulara cevap için birlikte kullanılabilir.

Yüzey ifade reseptörlerinin biyokimyasal yalıtım örnekleri, kültürlü hücreler veya beyin dilimleri ve kültürlü hücrelerin veya doku11hücre altı fraksiyonunda biotinylation protokolleri içerir. Yüzey biotinylation Ester-aktif biotin ile kültürlerin inkübasyon tarafından biotin ile yüzey-ifade reseptörlerin etiketleme dayanmaktadır. Ester grubu primer amino gruplar ile tepki verir (-NH2) kararlı aminosit bağları oluşturmak için. Bu reaktif hücre geçirmez olduğundan, sadece yüzey ifade proteinleri biotin ile etiketlenmiştir. Deterjanlar kullanarak hücresel liziz sonra, etiketli reseptör avidin veya biotin için güçlü bir yakınlık var türevleri, daha sonra İmmünoblotting ile değerlendirilen Agarose boncuklar ile hücre lysate inküpasyon tarafından kurtarılabilir. Subcellular fraksiyonlama çeşitli santrifüjleme adımları farklı yoğunlukları12dayalı farklı hücresel membranöz bölmeleri izole etmek için kullanan bir biyokimyasal protokoldür. Her iki teknik de endojen proteinlerin yüzey ifadesinde yapılan değişiklikleri ölçmek için yararlıdır ve moleküler manipülasyonların yüzey ifadesini nasıl etkilediğini belirlemek için farmakolojik yaklaşımlar (hem in vivo hem de kültürün) ile birlikte kullanılabilir reseptörlerin. Özellikle, bir standart göreli olarak birden fazla endojen reseptördeki değişiklikler aynı anda nicelik olabilir çünkü yararlıdır. Ancak, bu protokolde açıklanan gibi Görüntüleme modaliteleri aksine, uzamsal çözünürlük numunelerin biyokimyasal işleme yoluyla kaybolur.

Burada açıklanan protokol görüntüleme teknikleri kategorisine aittir. Bu yaklaşım grubu (yüzey etiketleme ve floresan etiketli aşırı ifade proteinlerinin canlı hücre görüntüleme gibi) reseptörlerin yüzey ifadesi için zamanmekansal çözünürlük vermek için yararlıdır. Örneğin, yüzey vs. Ampar hücre içi ifade inceleyerek, daha önce örnek olarak, bir ifadede değişikliklerin dendritler (Bu özel uygulama için ilgi biyolojik bölme) nasıl telaffuz edilir inceleyebilirsiniz. Biyokimyasal fraksiyonlama gibi, ilaçlar yüzey ifadesinde bir ilacın etkilerini belirlemek için görüntüleme teknikleri ile kullanılabilir. Buna ek olarak, modifikasyon (mutasyonlar veya Etiketler) içeren reseptörlerle nöronların transfeksiyon daha görüntüleme için olasılılar ayrıntılı. Mutant reseptörleriyle transfeksiyon, belirli bir mutasyonun yüzey ifadesinde etkilerini tarif edebilir.

Reseptör kaçakçılığı görselleştirmek için bir diğer yararlı yaklaşım, Superecliptic pHluorin (SEP) gibi floresan etiketli yapıları ile primer kültürlerin transfeksiyon sonra canlı görüntüleme mikroskopisi olduğunu-veya diğer fluorophore etiketli yapıları13. SEP-Tagged reseptörleri özellikle yüzey ifade reseptörleri okumak için yararlı olabilir, bu fluorophore sadece hücre dışı ortama maruz kaldığında floresan gibi. Önceki örnekler gibi, farmakolojik yaklaşımlar kullanılabilir, ya da reseptör üzerinde yapılan mutasyonlar, bu reseptörün yüzey ifade özelliklerini değiştirmek olup olmadığını belirlemek için. İlaçlar durumunda, gerçek zamanlı olarak yüzey ifadesinde değişiklikleri izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanılabilir. Görüntüleme canlı bir sınırlama yüzey ifadesinde değişikliklere mekanik anlayış eksikliği. Örneğin, azalan bir yüzey ifadesi, artan reseptör ıntertralization, azaltılmış reseptör geri dönüşüm veya her ikisi de bir sonucu olabilir.

Bu soruyu yanıtlamak için yukarıda açıklanan protokol kullanılabilir. Canlı görüntüleme yaklaşımlarını kullanarak izlenebilir bir başka önemli ticareti olay reseptörleri plazma membranı farklı bölmeleri arasında lateral difüzyon (örneğin, sinaptik ve extrasynaptic siteler arasında). Bu durumda, seçim tekniği, bir floresan Yarıiletken Nanokristallere [Yani, Quantum dot (QD)] bir antikora karşı bir ekstrellüler epitopu karşı ilgi protein bağlı olan tek parçacık izleme yaklaşımlar kullanımı. QDs olağanüstü stabilite ile karakterize (Geleneksel floresan proteinleri çok daha az fotobleaching izin), güçlü parlaklık, ve açık/kapalı durumu arasında değişim ("yanıp sönen"). Uygun mikroskop ayarlarını kullanarak, hücresel plazma membran14ile tek bir QD (ve bu nedenle, tek bir ilgi proteini) hareketini izlemek mümkündür.

Mevcut protokol, yüzey popülasyonunda reseptörlerin bir muayene sağlar, dışkının nüfus, ve geri dönüşümlü nüfus, bu süreçlerin toplam yüzey ifadesi nasıl kontrol belirlemek için oranlarının hesaplanması için izin. Ayrıca, farklı zaman noktalarında atılaşma veya geri dönüşüm süreçlerini durdurmak temporal çözünürlük ekler. Bu yöntem, bu nedenle, uzamsal yüzey ifade etütler için izin verir. Diğer görüntüleme tekniklerinin aksine, reseptörün ekstrasellüler kısmına karşı bir antikor mevcutsa, endojen yüzey ifadesinin seviyeleri de incelenebilir (örn. AMPAR). Ancak, bu yöntem hücrelerin sabitleme gerektirdiğinden, canlı hücre görüntüleme ile uyumlu değildir ve bu nedenle gerçek zamanlı bilgi sağlamaz.

Son olarak, electrofizyoloji gibi fonksiyonel yaklaşımlar15 veya kalsiyum görüntüleme16 güçlü, rağmen genellikle dolaylı, görgü reseptörlerin yüzey ifadesi çalışması için. Bu yöntemler reseptör aktivasyonunda (örn. membran potansiyeli veya kalsiyum konsantrasyonu değişimi) hücredeki fonksiyonel değişikliklerin ölçülmesini temel alır. Belirli bir reseptörün tepkisini izole etmek için farmakolojinin kullanılması, bu yöntemler, hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin kesin, uzamsal bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Bu yöntemler çok yönlü ve kültürdeki hücrelerin incelenmesi ve daha fizyolojik koşullarda ex vivo (örn. akut beyin dilimleri) ve in vivoiçin izin verir. Ancak, canlı görüntüleme yaklaşımlarının durumunda olduğu gibi, fonksiyonel yaklaşımlar kullanıldığında mekanik bilgiler genellikle cevapsız olur.

Özetle, yüzey ifadesinin nasıl kontrol edildiğini tam olarak anlamak için reseptör yüzeyi ifadesinin çalışması için kullanılan tekniklerin bir kombinasyonu kullanılabilir. Burada sunulan protokol, ayrılmış primer kültürlerde reseptörlerin mekanotemporal yüzey ifadesinin mekanik bir anlayışını sağladığı için özellikle güçlüdür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Nikon a1 Confocal mikroskop ve deneyler planlama ve analiz yardım onların kullanımı için Northwestern gelişmiş Microkopi merkezi teşekkür ederiz. Bu araştırma (T32GM008061) (A. M. C), ve NIA (R00AG041225) ve Brain & davranış Araştırma Vakfı (#24133) (A. S.-C.) bir NARSAD genç araştırmacı Grant tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics