Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellulaire reacties op externe stimuli sterk vertrouwen op de set van receptoren uitgedrukt in het celoppervlak op een bepaald moment. Dienovereenkomstig, de populatie van oppervlakte-uitgedrukte receptoren is voortdurend aan te passen en onderworpen aan strenge mechanismen van regulering. Het paradigmatische voorbeeld en een van de meest bestudeerde evenementen in de biologie is de gereguleerde controle van de synaptische expressie van glutamaat receptoren (GluRs). GluRs bemiddelen de overgrote meerderheid van de excitatory transmissie in het centrale zenuwstelsel en controle fysiologische activiteit-afhankelijke functionele en structurele veranderingen op de synaptische en neuronale niveaus (bijv., synaptische plasticiteit). Wijzigingen in het aantal, de locatie en de subeenheid samenstelling van het oppervlak uitgedrukt glurs diep beïnvloeden neuronale functie en, in feite, wijzigingen in deze factoren worden geassocieerd met verschillende neuropathieën. Hier gepresenteerd is een methode om glur-handel in gezien hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Een "antilichaam-voedende" benadering wordt gebruikt voor het differentieel visualiseren van GluR populaties uitgedrukt op het oppervlak en inwendige membranen. Door het labelen van de oppervlakte-receptoren op levende cellen en het oplossen van hen op verschillende tijdstippen voor receptoren endocytose en/of recycling, deze handel processen kunnen worden geëvalueerd en selectief bestudeerd. Dit is een veelzijdig protocol dat kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische benaderingen of overexpressie van veranderde receptoren om waardevolle informatie te verkrijgen over stimuli en moleculaire mechanismen die de handel in GluR beïnvloeden. Evenzo, het kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere receptoren of oppervlakte uitgedrukt eiwitten.

Introduction

Cellen maken gebruik van het actieve proces van handel om eiwitten te mobiliseren voor specifieke subcellulaire lokalisaties en het uitoefenen van strikte spatiotemporele regulering over hun functie1. Dit proces is vooral belangrijk voor transmembraan receptoren, als cellulaire reacties op verschillende milieu stimuli vertrouwen op intracellulaire Cascades veroorzaakt door receptor activering. Cellen zijn in staat om deze reacties te wijzigen door het veranderen van de dichtheid, lokalisatie, en subeenheid samenstelling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak via receptor subcellulaire handel voorschrift2. Het inbrengen van nieuw worden receptoren in het plasma membraan, samen met endocytose en recycling van bestaande receptoren zijn voorbeelden van mensenhandel processen die bepalen de netto pool van oppervlakte-uitgedrukt receptoren2. Veel moleculaire mechanismen werken samen om de eiwit handel te reguleren, waaronder eiwit-eiwit interacties en posttranslationele modificaties zoals fosforylering, Ubiquitination of palmitoylation2.

Regulering van de receptor handel is met name vereist in sterk gepolariseerde cellen met zeer gespecialiseerde structuren. Het paradigmatische voorbeeld is de controle van neuronale functie door gereguleerde handel in glutamaat receptoren (glurs)3,4. Glutamaat, de belangrijkste excitatory neurotransmitter, bindt en activeert oppervlak-uitgedrukt GluRs voor het beheersen van fundamentele fysiologische neuronale functies zoals synaptische transmission en synaptische plasticiteit. Het feit dat veranderde GluR handel is waargenomen in een breed spectrum van neuropathieën, variërend van neuroontwikkelingsstoornissen tot neurodegeneratieve ziekten, benadrukt het belang van dit proces5. Het begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die de handel in GluR beheersen, is dus interessant voor veel onderzoeksgebieden.

In dit protocol wordt een methode op basis van antilichamen gebruikt om het niveau van oppervlakte-uitgedrukt GluRs in primaire hippocampale neuronen te kwantificeren en te evalueren hoe veranderingen in internalisatie en recycling resulteren in de waargenomen netto-oppervlakte uitdrukking. Het gebruik van farmacologie en/of overexpressie van exogene receptoren die specifieke mutaties verteren maakt dit protocol een bijzonder krachtige benadering voor het bestuderen van moleculaire mechanismen onderliggende neuronale aanpassing aan verschillende milieu stimuli. Een laatste voorbeeld van het nut van dit protocol is het bestuderen van de invloed van de multifactoriële veranderingen in het milieu (zoals in een ziekte model) op de handel in GluR door het onderzoek van de oppervlakte expressie in dergelijke modellen.

Met behulp van specifieke voorbeelden, het is in eerste instantie aangetoond hoe een farmacologische manipulatie nabootsen van fysiologische synaptische stimulatie [Chemical LTP (cLTP)] verhoogt de oppervlakte uitdrukking van de endogene GluA1 subeenheid van de AMPA-type van GluRs (AMPARs) 6. de handel in een overuitgedrukt fosho-mimetische vorm van de GluN2B subeenheid van het NMDA-type GluRs (NMDARs) wordt ook geanalyseerd om te illustreren hoe dit protocol kan worden gebruikt om de regulering van de GluR-handel te bestuderen door specifieke posttranslationele Wijzigingen. Hoewel deze specifieke voorbeelden worden gebruikt, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere gluren en andere receptoren en eiwitten die antigene extracellulaire domeinen bezitten. In het geval dat er geen antilichamen beschikbaar zijn voor extracellulaire domeinen, overexpressie van extracellulaire epitope-Tagged (bijv., vlag-, Myc-, GFP-Tagged, enz.) eiwitten kunnen helpen bij de etikettering van eiwitten.

Het huidige protocol bevat instructies voor het kwantificeren van specifieke GluR-subtype dichtheid en mensenhandel met specifieke antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen 1) totaal GluR oppervlakte expressie, 2) GluR internalisatie, en 3) GluR recycling. Om elk proces afzonderlijk te bestuderen, wordt geadviseerd om te beginnen met de secties 1 en 2 en door te gaan met sectie 3, 4 of 5. In alle gevallen, eindig met secties 6 en 8 (Figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Werk met betrekking tot de voorbereiding van de primaire cultuur van hippocampal werd beoordeeld en goedgekeurd door het noordwestelijke universitair Dierenzorg-en gebruiks Comité (protocol #IS00001151).

1. voorbereiding voor het labelen

  1. Bereiding en onderhoud van primaire hippocampal culturen
    1. Bereid primaire hippocampal culturen met een dichtheid van 150.000 cellen verguld op poly-D-Lysine-gecoate (0,1 mg/mL) 18 mm afdek glazen. Uitstekende gidsen voor de dissociatie van de neuronale cultuur voorbereiding zijn7,8beschikbaar.
      Opmerking: Indien nodig kunnen de culturen worden behandeld met cytosine uracilarabinoside (Ara-C, 10 mM van DIV1) om gliale proliferatie in het preparaat te voorkomen.
      Opmerking: Alternatieve coating reagentia zoals fibronectin (1 mg/mL) of laminine (5 mg/mL) mogen worden gebruikt in plaats van poly-D-Lysine.
    2. Handhaaf culturen in een cel incubator bij 37 °C en 5% CO2 in 2 ml/put van neurobasal media aangevuld met B27 en 2 mm L-glutamine.
      Opmerking: Vervangingen voor L-glutamine (bijv. Glutamax) kunnen desgewenst worden gebruikt.
    3. Op wekelijkse basis, verwijder de helft van het volume van de media en vervangen door dezelfde hoeveelheid aangevuld neurobasal media.
  2. Optioneel: transfectie van gemuleerde en/of epitope-gelabelde receptoren
    Opmerking:
    neuronen moeten ten minste 3 – 4 dagen voorafgaand aan de analysetijd punt worden getransffecteerd om toe te staan voor receptor expressie. Het gebruik van jonge neuronen [dagen in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulteert in een betere transfectie-efficiëntie dan oudere (DIV15 – 20) neuronen, maar een voldoende aantal getranssinfecteerde cellen (> 20) kan worden bereikt, ongeacht de gebruikte DIV.
    1. Verdun voor elk goed van een 12-waterput 1,5 μg plasmide met de te bouwen belangstelling in 100 μL verse neurobasale media zonder B27 of glutamine suppletie in een micro centrifugebuis en meng snel door grondig.
      Opmerking: Voor een succesvolle transfectie is het van cruciaal belang dat de gebruikte neurobasal media zo vers mogelijk zijn, idealiter minder dan 1 week na het openen van de fles.
    2. Meng in een tweede microcentrifuge buis 1 μL van een geschikt lipofection-reagens in 100 μL verse neurobasale media en meng zachtjes.
      Opmerking: De lipofection reagens mengsel niet Vortex. Gebruik van verse lipofectie reagentia kan transfectie efficiëntie verbeteren.
    3. Incuberen de buisjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voeg het lipofection-reagens mengsel druppelsgewijs toe aan het DNA-mengsel, meng zachtjes en inincuberen gedurende 20 minuten bij RT.
    5. Pas het volume van de media in elke put aan op 1 mL geconditioneerde media.
    6. Voeg de lipofection reagens-DNA mengsel druppelsgewijs aan de put.
    7. Cellen terug naar de incubator en laat ten minste 3 – 4 dagen voor eiwit expressie.
      Opmerking: Voor de doeleinden van de hieronder uiteengezette internalisering en recycling protocollen werden hippocampal neuronen getransffecteerd op DIV11-12 met constructies die GluN2B gelabeld met GFP in het extracellulaire domein (GFP-GluN2B) en afbeelding gemaakt op DIV15 – 16.
  3. FACULTATIEF: incubatie van cellen met geneesmiddelen (chronisch of acuut) in de geconditioneerde media tot de fixatie.
    Opmerking:
    voor acute behandeling, beginnen met het behandelen van cellen voordat labelen. Afhankelijk van het gebruikte protocol voor de behandeling van geneesmiddelen kunnen cellen worden gehandhaafd in de drugsbevattende media tijdens rubriek 2. In ons voorbeeld waren DIV21 cellen onderhevig aan een cLTP-protocol om het oppervlak te verhogen-uitgedrukt AMPAR9.
    1. Exchange geconditioneerde media voor extracellulaire oplossing (ECS).
    2. Behandel cellen met 300 μM Glycine in ECS gedurende 3 minuten bij RT. Als een controle, behandelen van een zuster afdek met ECS (zonder Glycine).
    3. Spoel cellen 3x met 37 °C ECS en retourneer de cellen in ECS (zonder Glycine) naar de celincubator gedurende 20 minuten voordat u doorgaat met rubriek 2.
      Opmerking: ECS (in mm): 150 NaCl, 2 CACL2,5KCl, 10 Hepes, 30 glucose, 0,001 TTX, 0,01 strychnine en 0,03 picrotoxin bij pH 7,4.

2. live labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren

  1. Dekbonnen voorbereiden voor labelen
    1. Om reagentia op te slaan en manipulatie te vergemakkelijken, overzet u de celzijde naar een met paraffine folie bedekte lade.
      Opmerking: Het is van cruciaal belang om de monsters nooit uit te laten drogen.
    2. Bewaar en onderhoud geconditioneerde media bij 37 °C voor incubatie-en wasstappen.
      Opmerking: Bij een dekslip van 18 mm wordt incubatie met 75 – 100 μL media voor antilichaam etikettering en 120 – 150 μL voor internalisatie/recycling aanbevolen.
  2. Etikettering van oppervlakte receptoren met primair antilichaam
    1. Incuberen cellen met primair antilichaam, verdund in geconditioneerde media gedurende 15 minuten bij RT.
      Opmerking: Voor receptoren met GFP-Tags werd het konijn anti-GFP-antilichaam bij een verdunning van 1:1000 gebruikt. Voor endogene GluA1, muis anti-GluA1 bij een 1:200 verdunning werd gebruikt.
    2. Zuig de media met behulp van een vacuümpipet en spoel de cellen driemaal met geconditioneerde media zorgvuldig op.
      Opmerking: Als de geconditioneerde media niet beschikbaar zijn, kunnen alle wasstappen worden uitgevoerd met PBS + [fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 mM MgCl2 en 0,1 mm CACL2]. Handmatige aspiratie met behulp van een micro pipet kan worden uitgevoerd als zachte vacuüm aspiratie niet beschikbaar is.

3. oppervlakte-uitdrukking (Figuur 2)

  1. Secundaire antilichamen labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren
    1. Was één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% Paraformaldehyde (PFA) en 4% sucrose in PBS gedurende 7 – 8 minuten.
      Opmerking: In tegenstelling tot andere fixatie methoden, zoals methanol, is PFA niet doordrongen van het plasma membraan en daarom geschikt voor oppervlakte-expressie analyse. Gebruik voor optimale resultaten vers bereide PFA. Kortdurende opslag van PFA bij 4 °C of lange termijn (up 30 dagen) opslag bij-20 °C is toelaatbaar voor adequate fixatie.
      Let op: PFA is een bekend kankerverwekkend. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren.
    3. Spoel de cellen drie keer met regelmatige PBS.
      Opmerking: Als alternatief kan 0,1 M glycine worden gebruikt voor het wassen van PFA in plaats van PBS, omdat Glycine alle resterende fixeermiddelen zal doven die de achtergrond in het preparaat kunnen verhogen.
    4. Blokkeer niet-specifieke binding sites door te incuberen met 10% normaal geiten serum (NGS) in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
      Opmerking: De blokkeertijd kan worden verlengd zonder nadelige effecten op het labelen.
    5. Inincuberen met fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT om primaire antilichaam gelabelde receptoren te labelen (d.w.z. oppervlakte-uitgedrukt).
      Opmerking: In deze voorbeelden werd een 1:500 verdunning van Alexa 555-geconjugeerde secundaire antilichamen: geit anti-konijn voor GFP-gelabelde receptoren en geit anti-muis voor GluA1 werd gebruikt.
    6. Spoel cellen met PBS 3x.
  2. Etikettering van intracellulaire receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min bij RT.
      Opmerking: Om te controleren of de eerste ronde van antilichaam labeling alle oppervlakte epitopes beslaat, kan deze permeabilization stap in een zuster cultuur worden overgeslagen. In dit geval, geen signaal voor intracellulaire receptoren moet worden verkregen. Bovendien, om te controleren of er geen interne receptoren zijn gelabeld in de vorige sectie 2 (d.w.z., met de integriteit van de plasma membranen in de cultuur), de permeabilization stap kan worden overgeslagen in een zuster cultuur, en een primair antilichaam tegen een intracellulair eiwit (bijv. PSD-95 of MAP2) kan in stap 2.2.1 worden gebruikt. Er moet onder deze omstandigheden geen signaal worden verkregen van deze primaire. In dit geval werd een konijn anti-PSD-95 antilichaam (1:500) gebruikt.
    2. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 min bij RT.
    3. Het etiket intracellulaire receptoren door permeabel cellen te incuberen met hetzelfde primaire antilichaam dat wordt gebruikt in paragraaf 2,2, verdund in 3% ngs in PBS gedurende 1 uur bij RT.
      Opmerking: De antilichaam verdunning voor het labelen van intracellulaire receptoren kan afwijken van die nodig zijn voor het labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren. In het voorbeeld van GluA1 werd dezelfde antilichaam verdunning (1:200) gebruikt.
    4. Was cellen 3x met PBS.
    5. Label met tweede fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: In deze voorbeelden werd een 1:500 verdunning van geit anti-muis Alexa 647-geconjugeerd secundair antilichaam (voor GluA1) gebruikt.
    6. Was cellen 3x met PBS.

4. internalisering (Figuur 3)

  1. Internalisering van antilichaam-gelabelde oppervlak receptoren
    1. Na het labelen van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren en het wassen van antilichamen (punt 2,2), het onderhouden van cellen in geconditioneerde media zonder antilichaam en terug te keren naar de incubator (37 ° c) om te internaliseren.
      Opmerking: Voor NMDA-receptoren wordt 30 min voor internalisatie aanbevolen. Als controle kan een zuster cultuur worden gehandhaafd met geconditioneerde media bij 4 °C tijdens het internalisatie proces. Minimale receptor internalisering moet plaatsvinden onder deze omstandigheden.
  2. Etikettering van oppervlakte receptoren
    1. Spoel de cellen één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% PFA en 4% sucrose in PBS voor 7 – 8 min.
      Let op: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren van PFA.
    3. Was cellen 3x met reguliere PBS.
    4. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke binding te voorkomen.
    5. Inbroed monsters met fluorescently-gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT om primaire antilichaam gelabelde receptoren te labelen (d.w.z. oppervlakte-uitgedrukte receptoren die niet geïnternationaliseerd waren).
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 555-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    6. Was cellen 3x met PBS.
  3. Etikettering van geïnternationaliseerde receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min.
    2. Blokkeer niet-specifieke binding door te incubatie met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
    3. Inbroed monsters met fluorescently gelabeld secundair antilichaam, verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT, voor het labelen van geïnternationaliseerde antilichamen-gelabelde receptoren.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 647-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) wordt gebruikt voor het labelen.
    4. Was cellen 3x met PBS.

5. recycling (Figuur 4)

  1. Internalisering van antilichaam-gelabelde oppervlak receptoren
    1. Na het labelen van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren en het wassen van antilichamen (punt 2,2), het onderhouden van cellen in geconditioneerde media zonder antilichaam en terug te keren naar de incubator (37 ° c) om te internaliseren.
      Opmerking: Voor NMDA-receptoren wordt 30 min voor internalisatie aanbevolen.
  2. Blokkering van stabiel oppervlak uitgedrukt receptoren
    1. Om de epitopen te blokkeren op het primaire antilichaam dat is bevestigd aan de oppervlakte-uitgedrukte receptoren die niet geïnternationaliseerd zijn, cellen met niet-geconjugeerde Fab anti-IgG (H + L) antilichaam fragmenten (tegen de primaire gebruikt in punt 2,2), verdund in geconditioneerde media ( 20 μg/mL) gedurende 20 minuten bij RT. Deze behandeling voorkomt toekomstige interactie met secundaire antilichamen.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld werden geit anti-Rabbit Fab fragmenten gebruikt.
      Opmerking: Controle experiment: om ervoor te zorgen dat volledige blokkering van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren is opgetreden, zuster dekstroken kunnen worden geïnineerd met en zonder fab. Culturen moeten onmiddellijk na een fantastische behandeling worden vastgesteld en beide culturen worden geïnfiltreerd met Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam. Geen Alexa 555 signaal in de Fab-geïnde cellen geeft goede antilichaam blokkering.
    2. Was cellen 3x met geconditioneerde media.
    3. Incubeer cellen met geconditioneerde media die 80 μM dynasore bevatten om verdere internalisering te voorkomen en cellen terug te keren naar de incubator (37 °C), zodat er recycling van geïnternationaliseerde receptoren mogelijk is. Dynasore is een GTPase-remmer die dynamin remt en daarom internalisering voorkomt.
      Opmerking: 45 min voor nmdar recycling wordt aanbevolen. Merk op dat Dynasore uitsluitend het dynamin-afhankelijke internalisatie proces blokkeert (bijv. internalisering van NMDARs). Echter, internalisatie van andere synaptische eiwit (dynamine-onafhankelijk) kan nog steeds optreden in de aanwezigheid van Dynasore.
  3. Etikettering van gerecycleerde receptoren
    1. Spoel de cellen één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% PFA en 4% sucrose in PBS voor 7 – 8 min.
      Let op: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren van PFA.
    3. Was cellen 3x met PBS.
    4. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke binding te voorkomen.
    5. Label cellen met eerste fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 555-geconjugeerde geit anti-konijn antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    6. Was cellen 3x met PBS.
      Opmerking: Langere wast met PBS (5 – 10 min) kan helpen om de achtergrond in het preparaat te verminderen.
  4. Etikettering van geïnternationaliseerde receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min.
    2. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 min bij RT.
    3. Label met tweede fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 647-geconjugeerde geit anti-konijn antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    4. Was cellen 3x met PBS.

6. montage en beeldvorming van monsters

  1. Monteer de cellen door de afdek stroken van de cel voorzichtig op 12 – 15 mL van de juiste bevestigings media te plaatsen.
    Opmerking: Aspiratie van overtollige bevestigings media zal de kwaliteit van de beelden verbeteren.
  2. Beeld cellen op een geschikte confocale Microscoop.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om een z-stack te beelden met een vergroting van 60x met stappen van 0,35 μm, die de volledige dikte van het neuron omvat.

7. tijd overwegingen

  1. Dit is een lang protocol dat op verschillende punten kan worden stopgezet. Indien gewenst, voer de incubatie stappen voor blokkering en primair antilichaam 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer uit.
  2. Als alternatief u desgewenst een microgolf tissue processor gebruiken om de incubatie tijden na de vastlegging aanzienlijk te versnellen. Gebruik voor alle stappen 150 W bij 30 °C voor "aan"-instellingen.
    1. Om te blokkeren, voert u de processor uit op 2 minuten "aan," 1 min "uit," en 2 min "aan."
    2. Voer voor de incubatie stappen primair en secundair antilichaam de processor in op 3 min "aan," 2 min "uit," en 3 min "aan."
      Opmerking: We observeren geen kwaliteitsverschil door de bovenstaande wijzigingen aan te maken in het protocol.

8. beeldanalyse

  1. Het wordt aanbevolen om FIJI te gebruiken < https://Fiji.SC/> om beeldanalyse uit te voeren, omdat het compatibel is met meerdere bestandsformaten. Voor onze gegevens werden afbeeldingen in het Nikon ND2-bestandsformaat verkregen.
  2. Een macro script is voorzien voor eenvoudige batch kwantificering van verschillende parameters die vooraf zijn geselecteerd door FIJI. De volgende stappen zijn opgenomen in de macro:
    Opmerking: Voor deze voorbeelden werd "geïntegreerde intensiteit" gemeten.
  3. Open de afbeeldingsbestanden in FIJI en afzonderlijke kanalen.
  4. Z-projecteer elke kanaal stack als een projectie met maximale intensiteit.
  5. Stel voor elk kanaal een lagere drempel in.
    Opmerking: De drempels moeten voor elke experimentele gegevensset empirisch worden bepaald. Hoewel elk kanaal een afzonderlijke lagere drempelwaarde kan hebben, is het cruciaal dat de drempelwaarden voor kanaal consistent worden bijgehouden voor alle afbeeldingen van dezelfde gegevensset.
  6. Selecteer drie tot vijf secundaire of tertiaire dendrites en sla ze op als interessegebieden (ROIs).
  7. Meet de geïntegreerde dichtheid van elke ROI in oppervlakte-en intracellulaire kanalen.
  8. Normaliseer het signaal voor elke ROI door de geïntegreerde dichtheidswaarde van het oppervlakte kanaal te delen door het intracellulaire kanaal.
  9. Herhaal de metingen voor alle besturings-en experimentele beelden en Normaliseer experimentele waarden om waarden te beheersen (bijv. GluN2B WT-of no-Glycine-condities).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol om te studeren glutamaat-receptor handel is gebaseerd op differentiële labeling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak en die uitgedrukt in interne membranen. Segregatie wordt bereikt door het labelen van de receptoren voor en na membraan permeisatie, met behulp van hetzelfde primaire antilichaam, maar een secundair antilichaam geconjugeerd aan een verschillende fluorophore. Zoals uiteengezet in de optionele stappen omvatte het Protocol, dit is een zeer veelzijdige methode voor het ondervragen van verschillende receptor mensenhandelprocessen, zoals internalisatie en recycling, en kan gemakkelijk worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker (Figuur 1) .

Ten eerste wordt een methode gegeven voor de kwantificering van receptoren uitgedrukt op het neuronale oppervlak. Dit protocol maakt het mogelijk om de basale oppervlakte expressie te kwantificeren en de moleculaire mechanismen te bestuderen waarmee verschillende geneesmiddelen of mutaties de basale niveaus van op het oppervlak uitgedrukte receptoren veranderen. Het oppervlak-uitgedrukt receptoren werden voor het eerst gelabeld door te incuberen met zowel primaire als secundaire antilichamen voorafgaand aan permeabilization. Na permeabilization met 0,25% Triton X-100 is de intracellulaire pool van receptoren toegankelijk voor antilichaam labeling. Ter illustratie van dit protocol, oppervlak versus intracellulaire kleuring van AMPA receptoren (AMPARs) in controleculturen en na inductie van cLTP werd uitgevoerd. Specifiek, levende cellen werden gelabeld met behulp van een antilichaam tegen een extracellulaire epitoop in de GluA1 subeenheid van de ampar, en cellen werden gerepareerd dan gelabeld met Alexa 555-geconjugeerd secundair. De cellen werden vervolgens permeabel en gelabeld met hetzelfde anti-ampar antilichaam en geïnineerd met een secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa 647. Deze dubbele labeling maakt een duidelijke visualisatie van de twee GluA1 populaties mogelijk.

Na het verwerven van confocale beelden, kan het fluorescerende signaal gemakkelijk worden gekwantificeerd om een toename van de oppervlakte expressie te tonen, ten opzichte van de intracellulaire populatie, na cLTP (Figuur 2a, B). Als controle werd de permeabilization stap overgeslagen (incubatie met 0,25% Triton X-100) in een zuster dekslip en werd een primair antilichaam gebruikt tegen PSD-95, een standaard intracellulaire marker voor excitatory synapsen. Zoals weergegeven in figuur 2c, kan geen signaal voor PSD-95 worden verkregen in niet-permeabilized cellen, wat de integriteit van het plasma membraan aantoont. Dit geeft aan dat het signaal verkregen voor "oppervlak GluA1" inderdaad overeenkomt met oppervlakte-uitgedrukt receptoren (dat wil zeggen, signaal voor oppervlakte-uitgedrukt GluA1 omvat geen intracellulaire receptoren). Belangrijk is dat een minimaal signaal voor "geïnternationaliseerde GluA1" kan worden waargenomen onder niet-permeabilization condities, waaruit blijkt dat alle oppervlakte epitopen bezet zijn door de eerste ronde van antilichaam labeling (d.w.z. signaal voor intracellulaire GluA1 niet opgenomen op het oppervlak-uitgedrukt receptoren).

Een tweede proces dat kan worden onderzocht met behulp van dit protocol is de internalisering van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren. Specifiek, oppervlakte receptoren zijn gelabeld op een levende cel, en neuronen worden teruggegeven aan de incubator voor een bepaalde tijd te ondergaan receptor internalisatie door clathrin-gemedieerde endocytose. Na deze stap zijn cellen vast om de ruimtelijke expressie van primaire antilichaam-gelabelde receptoren (d.w.z. oppervlakte-uitgedrukt en geïnternationaliseerde receptoren) te behouden. Vervolgens, oppervlakte receptoren (dat wil zeggen, die die niet zijn geïnternationaliseerd in de tijdsperiode van belang), worden geëtiketteerd met een secundair antilichaam voorafgaand aan permeabilization. Na permeisatie worden receptoren die geïnternationaliseerd zijn gelabeld door een secundair antilichaam met een verschillende fluorophore.

In dit protocol werd onderzocht hoe een bepaalde fosforylering binnen de PDZ ligand van de GluN2B subeenheid van NMDARs (bij S1480) NMDAR internalisatie induceert. Om dit te doen, werden primaire culturen met een fosho-mimetic receptor, waarbij serine (S1480) was vervangen door glutamaat (E). De resulterende Mutant, GluN2B S1480E, fungeert als een "constitutief-gefosforyleerd" vorm van GluN2B. Om de labeling van GluN2B te verlichten en de phospho-mimetic Mutant te identificeren, werd GFP gebruikt als een epitoop tag op de extracellulaire kant van GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Oppervlakte-receptoren op levende cellen werden gelabeld met een anti-GFP-antilichaam gedurende 15 minuten bij RT. Vervolgens werd het overtollige antilichaam gewassen met geconditioneerde media en de cellen teruggebracht tot 37 °C gedurende 30 minuten om endocytose mogelijk te maken. Vervolgens, cellen werden vastgesteld om te bevriezen van de receptor beweging. Receptoren die bleven op het oppervlak werden vervolgens gelabeld met Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam voorafgaand aan permeabilization.

Om receptoren te identificeren die tijdens de incubatieperiode van 30 minuten geïnternationaliseerd waren, werden cellen permeabiliseerd en werden de geïnternationaliseerde receptoren (al gelabeld met een primair antilichaam) vervolgens gelabeld met Alexa 647-geconjugeerd antilichaam. Nogmaals, deze dual-labeling strategie maakt kwantificering van de proportie van geïnternationaliseerde receptoren mogelijk. In dit voorbeeld wordt benadrukt dat GluN2B fosforylering bij S1480 de internalisatie van de receptor bevordert, aangezien de fosho-mimetic Mutant S1480E een veel hogere internalisering heeft vergeleken met WT-receptoren (Figuur 3a, B). Als controle werd een zuster cultuur bij 4 °C tijdens de internalisatie in geconditioneerde media gehandhaafd om het proces sterk te vertragen. Zoals verwacht werd er geen signaal verkregen voor "geïnternationaliseerde" receptoren onder deze omstandigheden (figuur 3c).

Tot slot kan dit protocol worden gebruikt om de recycling van eerder geïnternationaliseerde receptoren te onderzoeken. Deze protocol variatie is een voortzetting van het internalisatie protocol door deze receptoren terug naar het celoppervlak te volgen. Er zijn twee cruciale onderdelen voor deze variatie. Ten eerste moeten receptoren die stabiel bleven uitgedrukt aan de oppervlakte tijdens het gehele protocol (d.w.z. receptoren die niet geïnternationaliseerd of gerecycled waren) "geblokkeerd" worden zodat ze niet worden verward met gerecycleerde receptoren. Om dit te doen, worden levende neuronen voor het uitvoeren van de recycling stap geïnpoleerd met hoge concentraties van Fab die omgaan met primaire antilichaam gelabelde receptoren, uitgedrukt aan het oppervlak om verdere binding van de fluorophore-geconjugeerde secundaire Antilichaam. Ten tweede moet de internalisatie tijdens de recycling fase worden voorkomen, zodat gerecycleerde receptoren niet herhaald geïnternationaliseerd worden. Dit werd gedaan door het toevoegen van dynasore aan de media tijdens recycling, omdat deze drug blokkeert processen afhankelijk van dynamin zoals clathrin-gemedieerde endocytose, zoals NMDAR internalisatie. In dit protocol werd het bestuderen van de handel in de fosho-mimetische Mutant GluN2B S1480E uitgevoerd, evenals oppervlakte etikettering van GFP-GluN2B op levende cellen, die voor internalisering tijdens een periode van 30 minuten toegestaan, zoals eerder uitgelegd.

Na dit, werden oppervlakte receptoren die niet geïnternationaliseerd tijdens deze periode werden geblokkeerd door het inbroed van de cellen met Fab voor 20 min bij RT. Vervolgens werden de cellen opnieuw geïnincubeerd bij 37 °C gedurende 45 min, zodat eerder geïnternationaliseerde GluN2B terug naar het celoppervlak konden worden gerecycled. Dynasore was aanwezig in de media tijdens de recycling stap. Fixatie van de cellen na deze stap maakt het mogelijk om gerecycleerde receptoren te identificeren (d.w.z. die die zijn geblokkeerd en uitgedrukt op het celoppervlak) en geïnternationaliseerde receptoren (d.w.z. de primaire antilichamen met het label en intracellulaire). Door 1) etikettering van gerecycleerde receptoren met een Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam voorafgaand aan permeabilization en 2) etikettering geïnternationaliseerd, maar niet gerecycled, receptoren met Alexa 647-geconjugeerd secundair antilichaam, een recycling ratio werd gegenereerd om te laten zien dat GluN2B S1480E heeft geen effect op NMDAR recycling (figuur 4a, B). Als een controle werd verzekerd dat volledige blokkering van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren plaatsvond door het inbroed van zuster dekstroken in de aanwezigheid of afwezigheid van Fab, gevolgd door PFA fixatie. Zoals weergegeven in figuur 4c, kan een sterk signaal worden waargenomen voor oppervlakte-uitgedrukt GluN2B in de afwezigheid van Fab blocking. Dit signaal verdwijnt in Fab-behandelde culturen, waaruit blijkt dat het blokkerende protocol voldoende is om het oppervlak volledig te blokkeren-uitgedrukt epitopen en dat de oppervlakte signalen die na recycling worden waargenomen, inderdaad corresponderen met receptoren die worden verhandeld terug naar het plasma membraan.

Figure 1
Figuur 1: schematische voorstelling van protocol variaties voor de studie receptor oppervlak expressie, receptor internalisatie (endocytose) en receptor recycling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: cLTP verhoogt de oppervlakte expressie van GluA1. Primaire hippocampal neuronen op DIV21 werden onderworpen aan chemische LTP (cLTP) door te bebroed met Glycine-bevattende ECS. Duidelijke labeling van oppervlakte-uitgedrukt (rood) versus intracellulaire (blauw) GluA1 populaties onthult de verwachte toename van de oppervlakte expressie van AMPAR. A) confocale Foto's met één vlak en (B) Z-gestapeld (projectie met maximale intensiteit). Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Grafiek toont de toegenomen oppervlakte-expressie van GluA1 na het cLTP-protocol. Oppervlak expressie index: oppervlakte/intracellulaire receptoren (n = 3; aantal cellen: con = 7; cLTP = 7; waarden staan voor gemiddelde ± SEM; * * * * p < 0,0001 met behulp van Mann-Whitney U-test). (C) controle-experiment waarbij de permeabilization stap werd overgeslagen. Naast de oppervlakte en interne GluA1, de intracellulaire excitatory synaptische marker PSD-95 werd geëvalueerd. Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: fosforylering van GluN2B bij S1480 bevordert de internalisatie van NMDAR. Primaire hippocampal neuronen werden getransffecteerd met ofwel GFP-GluN2B WT of de fosho-mimetic Mutant GFP-GluN2B S1480E op DIV11-12. Na 3-4 dagen van eiwit expressie werd het oppervlak GFP gelabeld op levende cellen met een konijn anti-GFP antilichaam en cellen werden vervolgens teruggebracht tot 37 °C om de receptor internalisatie door endocytose mogelijk te maken. Oppervlakte-uitgedrukt exogene receptoren werden gevisualiseerd met Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam, en de geïnternationaliseerde populatie geïdentificeerd na permeabilization met behulp van Alexa 647-geconjugeerd antilichaam. Voor de duidelijkheid, oppervlak GFP-GluN2B is pseudogekleurd in het groen en geïnternationaliseerde GFP-GluN2B is pseudogekleurd in wit. A) confocale Foto's met één vlak en (B) Z-gestapeld (projectie met maximale intensiteit). Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Grafiek toont de verhoogde internalisatie weergegeven door de fosho-mimetic Mutant GluN2B S1480E. Internalisatie-index: geïnternationaliseerde receptoren/receptoren (n = 6; aantal cellen: WT = 34; S1480E = 28; waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM; p < 0,001 met de Mann-Whitney U-test). C) controle-experiment waarbij de internalisatie stap (Intenaliz.) werd uitgevoerd bij 4 °c. Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: fosforylering van GluN2B bij S1480 wijzigt NMDAR recycling niet. Primaire hippocampal neuronen werden getransffecteerd met ofwel GFP-GluN2B WT of de fosho-mimetic Mutant GFP-GluN2B S1480E op DIV11-12 zoals weergegeven in Figuur 3. Na 3-4 dagen van eiwit expressie werd het oppervlak GFP gelabeld op levende cellen met een konijn anti-GFP antilichaam en cellen werden vervolgens teruggebracht tot 37 °C om de receptor internalisatie door endocytose mogelijk te maken. Overgebleven oppervlak-uitgedrukt receptoren werden geblokkeerd door Fab incubatie en recycling werd toegestaan voor 45 min. beschikbare oppervlakte uitgedrukt exogene receptoren (gerecycled) werden gevisualiseerd met Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam, en de geïnternationaliseerde populatie geïdentificeerd na permeabilization met behulp van Alexa 647-geconjugeerd antilichaam. Voor de duidelijkheid, oppervlak GFP-GluN2B is pseudogekleurd in wit en geïnternationaliseerde GFP-GluN2B is pseudogekleurd in het groen.  A) confocale Foto's met één vlak en (B) Z-gestapeld (projectie met maximale intensiteit). Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Grafiek toont het gebrek aan effect de GluN2B S1480 fosforylering heeft op recycling. Recycling index: gerecycleerde receptoren/geïnternaliseerde receptoren (n = 5; aantal cellen: WT = 27; S1480E = 24; waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM; n.s. = niet significant met de Mann-Whitney U-test). C) controle-experiment waarbij de Fab incubatie stap om het oppervlak te blokkeren-uitgedrukt epitopen werd overgeslagen. Schaal staven = 50 μm (hele cel) of 5 μm (dendriet). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De interactie tussen een cel en zijn omgeving (bijv. communicatie met andere cellen, reactie op verschillende stimuli, enz.) is sterk afhankelijk van de juiste expressie van receptoren op het celoppervlak. De snelle en fijngetunede regulering in oppervlakte-uitgedrukt receptor inhoud zorgt voor een goede cellulaire reactie op een voortdurend veranderende omgeving. In het specifieke geval van neuronen, wijzigingen in het aantal, lokalisatie, en de samenstelling van de subeenheid van Synaptisch uitgedrukt receptoren sterk beïnvloedt synaptische communicatie, synaptische plasticiteit, synaptogenese, en synaptische snoeien3, 5,10. Daarom is een nauwkeurige analyse van de receptor oppervlak expressie en het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de verordening een belangrijk onderwerp van onderzoek.

Er bestaan een aantal modaliteiten waardoor de receptor oppervlak expressie kan worden bestudeerd. In het algemeen vallen deze onder drie hoofdcategorieën: (i) biochemische isolatie van het oppervlak uitgedrukt receptor populatie, (II) beeldvormingstechnieken om receptoren aan de oppervlakte te visualiseren, en (III) functionele technieken om de gevolgen van de receptor te bewaken Activering. Deze benaderingen zijn complementair en kunnen worden gebruikt in combinatie om specifieke vragen over oppervlakte expressie van receptoren te beantwoorden.

Voorbeelden van biochemische isolatie van oppervlakte uitgedrukt receptoren omvatten biotinylation protocollen in gekweekte cellen of hersenen segmenten en subcellulaire fractionering van gekweekte cellen of weefsel11. Oppervlak biotinylatie is gebaseerd op het labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren met biotine door het inbroed van de culturen met Ester-geactiveerde biotine. De ester groep reageert met primaire amino groepen (-NH2) om stabiele amide bindingen te vormen. Omdat dit reagens celondoorlatend is, worden alleen oppervlakte-uitgedruct eiwitten gelabeld met biotine. Na Cellulaire Lysis met behulp van detergenten, gelabelde receptor kan worden teruggewonnen door het cel lysaat met agarose kralen geconjugeerd aan avidin of de varianten die een sterke affiniteit voor Biotine hebben, vervolgens geëvalueerd door immunoblotting. Subcellulaire fractionering is een biochemisch protocol dat verschillende Centrifugeer stappen gebruikt om verschillende cellulaire membraneuze compartimenten te isoleren op basis van hun verschillende dichtheden12. Beide technieken zijn nuttig om veranderingen in de oppervlakte expressie van endogene eiwitten te kwantificeren en kunnen worden gebruikt in combinatie met farmacologische benaderingen (zowel in vivo als in cultuur) om te bepalen hoe moleculaire manipulaties de oppervlakte expressie beïnvloeden van receptoren. Ze zijn vooral nuttig omdat veranderingen in meerdere endogene receptoren, ten opzichte van een standaard, gelijktijdig kunnen worden gekwantificeerd. In tegenstelling tot beeldvormings modaliteiten, zoals beschreven in dit protocol, gaat ruimtelijke resolutie echter verloren door biochemische verwerking van monsters.

Het hier beschreven protocol behoort tot de categorie beeldvormingstechnieken. Deze groep van benaderingen (zoals oppervlakte etikettering en live-celbeeldvorming van fluorescently gelabelde eiwitten) zijn nuttig om spatiotemporele resolutie te geven aan de oppervlakte-expressie van receptoren. Door bijvoorbeeld oppervlakte-versus intracellulaire expressie van AMPAR te onderzoeken, zoals eerder geïllustreerd, kan men nagaan hoe veranderingen in uitdrukking worden uitgesproken in de dendrites (het biologisch compartiment van belang voor deze specifieke toepassing). Net als biochemische fractionering, kunnen geneesmiddelen worden gebruikt met beeldvormingstechnieken om de effecten van een medicijn op de oppervlakte expressie te bepalen. Bovendien, transfectie van neuronen met receptoren met wijzigingen (mutaties of Tags) verder uitgewerkt de mogelijkheden voorbeeld vorming. Transfectie met gemuteerde receptoren kan de effecten van een bepaalde mutatie op de oppervlakte expressie afbakenen.

Een andere nuttige benadering voor het visualiseren van de receptor handel is Live Imaging microscopie na transfectie van primaire culturen met fluorescently gelabelde constructies, zoals Superecliptic pHluorin (SEP)-of andere fluorophore-Tagged constructies13. Met sep gelabelde receptoren kunnen met name nuttig zijn voor het bestuderen van oppervlakte-uitgedrukte receptoren, aangezien deze de alleen fluoresceren zal zijn bij blootstelling aan het extracellulaire medium. Net als voorgaande voorbeelden, farmacologische benaderingen kunnen worden gebruikt, of mutaties gemaakt op de receptor, om te bepalen als deze de oppervlakte expressie kenmerken van de receptor wijzigen. In het geval van drugs kan Live-celbeeldvorming worden gebruikt om de wijzigingen in de oppervlakte expressie in real-time te bewaken. Een beperking tot Live Imaging is het gebrek aan mechanistisch inzicht in veranderingen in de oppervlakte expressie. Een verminderde oppervlak expressie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een verhoogde receptor internalisering, minder receptor recycling of beide.

Om deze vraag te beantwoorden, kan het hierboven beschreven protocol worden gebruikt. Een andere belangrijke gebeurtenis van de handel die kan worden bewaakt met behulp van Live Imaging benaderingen is de laterale diffusie van receptoren tussen verschillende compartimenten in het plasma membraan (bv, tussen synaptische en extrasynaptic sites). In dit geval is de techniek van keuze het gebruik van één-deeltjes Volg benaderingen waarbij een fluorescentie halfgeleider nanocrystal [d.w.z., quantum dot (QD)] is bevestigd aan een antilichaam tegen een extracellulaire epitoop op het eiwit van belang. Qd's worden gekenmerkt door opmerkelijke stabiliteit (waardoor veel minder foto bleken mogelijk is dan traditionele fluorescerende eiwitten), sterke helderheid en de afwisseling tussen aan/uit-status ("knipperen"). Door de juiste Microscoop-instellingen te gebruiken, is het mogelijk om de beweging van een enkele QD (en dus een enkel eiwit van belang) te volgen via het cellulaire plasma membraan14.

Het huidige protocol biedt een onderzoek van de receptoren in de oppervlakte populatie, de geïnternationaliseerde populatie en de gerecycleerde populatie, waardoor de verhoudingen kunnen worden berekend om te bepalen hoe deze processen de totale oppervlakte expressie beheersen. Bovendien voegt het stoppen van de internalisatie-of recycling processen op verschillende tijdstippen een tijdelijke oplossing toe. Deze methode kan daarom spatiotemporele oppervlak expressie studies. In tegenstelling tot de andere beeldvormingstechnieken kunnen ook niveaus van endogene oppervlakte expressie worden bestudeerd (bijv. AMPAR), op voorwaarde dat er een antilichaam tegen het extracellulaire gedeelte van de receptor bestaat. Omdat deze methode echter fixatie van cellen vereist, is deze niet compatibel met Live-celbeeldvorming en kan dus geen real-time informatie worden verschaft.

Tot slot, functionele benaderingen zoals elektrofysiologie15 of calcium Imaging16 zijn krachtige, hoewel vaak indirecte, manieren om te bestuderen van de oppervlakte-expressie van receptoren. Deze methoden zijn gebaseerd op de kwantificering van functionele veranderingen in de cel na receptor activatie (bijv. verandering in membraanpotentiaal of calciumconcentratie). Met behulp van farmacologie om de respons van een bepaalde receptor te isoleren, kunnen deze methoden voor een schatting van de receptoren uitgedrukt op het celoppervlak in een precieze, spatiotemporele manier. Deze methoden zijn veelzijdig en zorgen voor de studie van cellen in cultuur en in meer fysiologische omstandigheden ex vivo (bijv. acute hersen sneden) en in vivo. Echter, zoals in het geval van de Live Imaging benaderingen, mechanistische informatie wordt vaak gemist bij het gebruik van functionele benaderingen.

Kortom, een combinatie van technieken om de receptor oppervlak expressie te bestuderen kan worden gebruikt om volledig te begrijpen hoe de oppervlakte expressie wordt bestuurd. Het protocol hier gepresenteerd is bijzonder krachtig omdat het een mechanistisch begrip van de spatiotemporale oppervlakte expressie van receptoren in gezien primaire culturen biedt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken het noordwestelijke centrum voor geavanceerde microscopie voor het gebruik van de Nikon a1 confocale Microscoop en hun hulp bij het plannen en analyseren van de experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) en NIA (R00AG041225) en een NARSAD Young Investigator subsidie van de Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics