Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Neuroscience

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Summary

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

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Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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Abstract

Les réponses cellulaires aux stimuli externes dépendent fortement de l'ensemble des récepteurs exprimés à la surface de la cellule à un moment donné. En conséquence, la population de récepteurs exprimés en surface s'adapte constamment et est soumise à des mécanismes stricts de régulation. L'exemple paradigmatique et l'un des événements de trafic les plus étudiés en biologie est le contrôle réglementé de l'expression synaptique des récepteurs du glutamate (GluRs). Les GluRs sont la médiation de la grande majorité de la neurotransmission excitatrice dans le système nerveux central et contrôlent les changements fonctionnels et structurels dépendants de l'activité physiologique aux niveaux synaptique et neuronal (p. ex., plasticité synaptique). Les modifications dans le nombre, l'emplacement, et la composition de sous-unité de la surface exprimée GluRs affectent profondément la fonction neuronale et, en fait, les changements dans ces facteurs sont associés à différentes neuropathies. Présenté ici est une méthode pour étudier le trafic de GluR dans les neurones primaires hippocampiques dissociés. Une approche d'« alimentation par anticorps » est utilisée pour visualiser différemment les populations de GluR exprimées à la surface et aux membranes internes. En étiquetant les récepteurs de surface sur les cellules vivantes et en les fixant à des moments différents pour permettre l'endocytose des récepteurs et/ou le recyclage, ces processus de trafic peuvent être évalués et étudiés de manière sélective. Il s'agit d'un protocole polyvalent qui peut être utilisé en combinaison avec des approches pharmacologiques ou la surexpression des récepteurs modifiés pour obtenir des informations précieuses sur les stimuli et les mécanismes moléculaires affectant le trafic de GluR. De même, il peut être facilement adapté pour étudier d'autres récepteurs ou protéines exprimées en surface.

Introduction

Les cellules utilisent le processus actif de trafic pour mobiliser les protéines à des localisations sous-cellulaires spécifiques et exercer une réglementation spatiotemporal stricte sur leur fonction1. Ce processus est particulièrement important pour les récepteurs transmembranaires, car les réponses cellulaires à différents stimuli environnementaux reposent sur des cascades intracellulaires déclenchées par l'activation des récepteurs. Les cellules sont capables de modifier ces réponses en modifiant la densité, la localisation et la composition sous-unité des récepteurs exprimés à la surface des cellules par le biais de la régulation du trafic sous-cellulaire des récepteurs2. L'insertion de récepteurs nouvellement synthétisés dans la membrane plasmatique, ainsi que l'endocytose et le recyclage des récepteurs existants sont des exemples de processus de traite qui déterminent le pool net de récepteurs exprimés en surface2. De nombreux mécanismes moléculaires coopèrent pour réguler le trafic de protéines, y compris les interactions protéines-protéines et les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l'ubiquitination ou la palmitoylation2.

La régulation du trafic de récepteurs est particulièrement nécessaire dans les cellules fortement polarisées avec des structures hautement spécialisées. L'exemple paradigmatique est le contrôle de la fonction neuronale par le trafic réglementé des récepteurs du glutamate (GluRs)3,4. Le glutamate, le principal neurotransmetteur excitateur, lie et active les GluRs exprimés en surface pour contrôler les fonctions neuronales physiologiques fondamentales telles que la neurotransmission synaptique et la plasticité synaptique. Le fait que le trafic altéré de GluR a été observé dans un large éventail de neuropathies, allant des désordres neurodevelopmental aux maladies neurodegenerative, accentue l'importance de ce processus5. Ainsi, la compréhension des événements moléculaires qui contrôlent le trafic de GluR est d'intérêt dans de nombreux domaines de recherche.

Dans ce protocole, une méthode basée sur l'alimentation des anticorps est utilisée pour quantifier le niveau de GluRs exprimés en surface dans les neurones hippocampiques primaires ainsi que pour évaluer comment les changements dans l'internalisation et le recyclage entraînent l'expression de surface nette observée. L'utilisation de la pharmacologie et/ou de la surexpression de récepteurs exogènes abritant des mutations spécifiques fait de ce protocole une approche particulièrement puissante pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'adaptation neuronale à différents stimuli environnementaux. Un dernier exemple de l'utilité de ce protocole est d'étudier comment les changements multifactoriels dans l'environnement (comme dans les modèles de maladie) affectent le trafic de GluR par l'examen de l'expression de surface dans de tels modèles.

À l'aide d'exemples spécifiques, il est d'abord démontré comment une manipulation pharmacologique imitant la stimulation synaptique physiologique [LTP chimique (cLTP)] augmente l'expression de surface de la sous-unité endogène GluA1 du type AMPA de GluRs (AMPA) 6. Le trafic d'une forme phospho-mimétique surexprimée de la sous-unité GluN2B de Type NMDA de GluR (NMDA) est également analysé pour illustrer comment ce protocole peut être utilisé pour étudier la régulation du trafic de GluR par modifications. Bien que ces exemples spécifiques soient utilisés, ce protocole peut facilement être appliqué à d'autres GluRs et d'autres récepteurs et protéines qui possèdent des domaines extracellulaires antigéniques. Dans le cas où il n'y a pas d'anticorps disponibles pour les domaines extracellulaires, la surexpression des protéines épitopères extracellulaires (p. ex. Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) peut aider à l'étiquetage des protéines.

Le protocole actuel fournit des instructions pour quantifier la densité et le trafic spécifiques du sous-type GluR à l'aide d'anticorps spécifiques. Ce protocole peut être utilisé pour étudier 1) l'expression totale de surface de GluR, 2) l'internalisation de GluR, et 3) le recyclage de GluR. Pour étudier chaque processus individuellement, il est conseillé de commencer par les articles 1 et 2 et de continuer avec les sections 3, 4 ou 5. Dans tous les cas, terminez avec les sections 6 et 8 (figure1).

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Protocol

Les travaux relatifs à la préparation de la culture primaire hippocampal ont été examinés et approuvés par le Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocole #IS00001151).

1. Préparation avant l'étiquetage

  1. Préparation et entretien des cultures hippocampiques primaires
    1. Préparer les cultures hippocampales primaires à une densité de 150 000 cellules plaquées sur des verres de couverture de 18 mm recouverts de poly-D-lysine (0,1 mg/mL). D'excellents guides pour la préparation de la culture neuronale dissociée sont disponibles7,8.
      REMARQUE: Si nécessaire, les cultures peuvent être traitées avec cytosine arabinoside (Ara-C, 10 mM de DIV1) pour éviter la prolifération gliale dans la préparation.
      REMARQUE: D'autres réactifs de revêtement tels que la fibronectine (1 mg/ml) ou la laminin (5 mg/mL) peuvent être utilisés au lieu de la poly-D-lysine.
    2. Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 en 2 ml/puits de neurobasal, complété par du B27 et 2 mM de L-glutamine.
      REMARQUE: Des substituts à la L-glutamine (p. ex. Glutamax) peuvent être utilisés, si désiré.
    3. Sur la base hebdomadaire, retirez la moitié du volume des médias et remplacez-les par le même volume de médias neurobasal complétés.
  2. OPTIONAL: Transfection de récepteurs mutés et/ou épitope
    REMARQUE :
    Les neurones doivent être transfectés au moins 3 à 4 jours avant le point de temps d'analyse pour permettre l'expression des récepteurs. L'utilisation de jeunes neurones [Jours in vitro 6-9 (DIV6-9)] se traduit par une meilleure efficacité de transfection que les neurones plus anciens (DIV15-20), mais un nombre suffisant de cellules transfectées (-gt;20) peut être atteint indépendamment du DIV utilisé.
    1. Pour chaque puits d'une plaque de 12 puits, diluer 1,5 g de plasmide contenant la construction de l'intérêt dans 100 l de milieux neurobasal frais sans supplémentation B27 ou glutamine dans un tube microcentrifuge et mélanger en vortexant rapidement.
      REMARQUE: Pour une transfection réussie, il est essentiel que le milieu neurobasal utilisé soit aussi frais que possible, idéalement moins d'une semaine après l'ouverture de la bouteille.
    2. Dans un deuxième tube de microcentrifuge, mélanger 1 L d'un réactif lipofection approprié dans 100 oL de médias neurobasal frais et mélanger délicatement.
      REMARQUE: Ne pas vortex le mélange de réactif lipofection. L'utilisation de réactifs à lipofection frais peut améliorer l'efficacité de la transfection.
    3. Incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante (RT).
    4. Ajouter le mélange de réactif lipofection dropwise au mélange d'ADN, mélanger doucement, et incuber pendant 20 min à RT.
    5. Ajuster le volume de support dans chaque puits à 1 ml de support conditionné.
    6. Ajouter le réagent lipofection -MÉLANGE d'ADN dropwise au puits.
    7. Retournez les cellules à l'incubateur et accordez au moins 3 à 4 jours pour l'expression des protéines.
      REMARQUE: Aux fins des protocoles d'internalisation et de recyclage décrits ci-dessous, les neurones hippocampes ont été transfectés à DIV11-12 avec des constructions exprimant GluN2B étiqueté avec GFP dans le domaine extracellulaire (GFP-GluN2B) et représenté à DIV15-16.
  3. OPTIONAL: Incubation des cellules avec des médicaments (chroniquement ou aiguement) dans le support conditionné jusqu'à la fixation.
    REMARQUE :
    Pour un traitement aigu, commencez à traiter les cellules avant l'étiquetage. Selon le protocole de traitement médicamenteux utilisé, les cellules peuvent être maintenues dans les médias contenant des médicaments pendant la section 2. Dans notre exemple, les cellules DIV21 ont été soumises à un protocole cLTP pour augmenter AMPAR9exprimé en surface.
    1. Échange de médias conditionnés pour une solution extracellulaire (ECS).
    2. Traiter les cellules avec 300 M de glycine dans ECS pendant 3 min à RT. Comme un contrôle, traiter un coverslip soeur avec ECS (sans glycine).
    3. Laver les cellules 3x avec un SCEde de 37 oC et les retourner dans l'ECS (sans glycine) à l'incubateur cellulaire pendant 20 minutes avant de continuer avec la section 2.
      REMARQUE: ECS (en mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 strychnine, et 0.03 picrotoxine au pH 7.4.

2. Étiquetage en direct des récepteurs exprimés par surface

  1. Préparer des fiches de couverture pour l'étiquetage
    1. Pour enregistrer les réactifs et faciliter la manipulation, transférer les couvertures côté cellule jusqu'à un plateau recouvert de paraffine.
      REMARQUE: Il est essentiel de ne jamais laisser sécher les échantillons.
    2. Enregistrer et maintenir les supports conditionnés à 37 oC pour les étapes d'incubation et de lavage.
      REMARQUE: Pour un bordereau de 18 mm, l'incubation avec 75 à 100 l de supports pour l'étiquetage des anticorps et 120 à 150 l pour l'internalisation/recyclage sont recommandées.
  2. Étiquetage des récepteurs de surface avec anticorps primaires
    1. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire dilué dans le support conditionné pendant 15 min à RT.
      REMARQUE: Pour les récepteurs marqués GFP, l'anticorps anti-GFP de lapin à une dilution de 1:1000 a été employé. Pour gluA1 endogène, la souris anti-GluA1 à une dilution 1:200 a été utilisée.
    2. Aspirez soigneusement les supports contenant des anticorps à l'aide d'une pipette à vide et lavez les cellules trois fois avec des supports conditionnés.
      REMARQUE: Si les supports conditionnés ne sont pas disponibles, toutes les étapes de lavage peuvent être effectuées à l'aide de PBSMD [saline tamponnée de phosphate (PBS) contenant 1 mM MgCl2 et 0,1 mM CaCl2]. L'aspiration manuelle à l'aide d'une micropipette peut être effectuée si l'aspiration de vide doux n'est pas disponible.

3. Expression de surface (Figure 2)

  1. Étiquetage secondaire des anticorps des récepteurs exprimés en surface
    1. Laver une fois avec PBSMD.
    2. Fixer les cellules en coucuba avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) et 4% de saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      REMARQUE: Contrairement à d'autres méthodes de fixation telles que l'incubation du méthanol, PFA ne perméabibilise pas la membrane plasmatique et est donc adapté à l'analyse de l'expression de surface. Pour des résultats optimaux, utilisez un PFA fraîchement préparé. Le stockage à court terme de pfA à 4 oC ou à long terme (jusqu'à 30 jours) de stockage à -20 oC est permissif pour une fixation adéquate.
      MISE EN GARDE: La PFA est un cancérogène connu. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation.
    3. Laver les cellules trois fois avec un SCP régulier.
      REMARQUE: Alternativement, 0,1 M de glycine peut être utilisé pour laver PFA au lieu de PBS, comme la glycine étanchera tout fixatif restant qui peut augmenter l'arrière-plan dans la préparation.
    4. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en couvant avec 10% de sérum de chèvre normal (NGS) en PBS pendant 30 min à RT.
      REMARQUE: Le temps de blocage peut être prolongé sans effets néfastes sur l'étiquetage.
    5. Incuber avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs primaires étiquetés par anticorps (c.-à-d. exprimés en surface).
      REMARQUE: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 d'anticorps secondaires Alexa 555-conjugués : anti-lapin de chèvre pour les récepteurs GFP-étiquetés et anti-souris de chèvre pour GluA1 a été employée.
    6. Laver les cellules avec PBS 3x.
  2. Étiquetage des récepteurs intracellulaires
    1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min à RT.
      REMARQUE: Pour vérifier que le premier cycle d'étiquetage des anticorps occupe toutes les épitopes de surface, cette étape de perméabilisation peut être ignorée dans une culture sœur. Dans ce cas, aucun signal pour les récepteurs intracellulaires ne devrait être obtenu. De plus, pour vérifier qu'aucun récepteur interne n'a été étiqueté dans la section 2 précédente (c.-à-d. montrant l'intégrité des membranes plasmatiques en culture), l'étape de perméabilisation peut être ignorée dans une culture sœur, et un anticorps primaire contre un les protéines intracellulaires (p. ex. PSD-95 ou MAP2) peuvent être utilisées à l'étape 2.2.1. Aucun signal ne doit être obtenu à partir de cette primaire dans ces conditions. Dans ce cas, un anticorps anti-PSD-95 de lapin (1:500) a été employé.
    2. Bloc avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT.
    3. Étiqueter les récepteurs intracellulaires en incuber des cellules perméabilisées avec le même anticorps primaire utilisé dans la section 2.2 diluée en 3% NGS en PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: La dilution d'anticorps pour l'étiquetage des récepteurs intracellulaires peut être différente de celle requise pour étiqueter les récepteurs exprimés en surface. Dans l'exemple de GluA1, la même dilution d'anticorps (1:200) a été utilisée.
    4. Laver les cellules 3x avec PBS.
    5. Étiquette avec le deuxième anticorps secondaire fluorescent-étiqueté dilué dans 3% NGS dans PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 de chèvre anti-souris Alexa 647-conjugué anticorps secondaires (pour GluA1) a été utilisé.
    6. Laver les cellules 3x avec PBS.

4. Internalisation (Figure 3)

  1. Internalisation des récepteurs de surface étiquetés anticorps
    1. Après l'étiquetage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des médias conditionnés sans anticorps et les retourner à l'incubateur (37 oC) pour permettre l'internalisation.
      REMARQUE: Pour les récepteurs NMDA, 30 min pour l'internalisation est recommandé. En tant que contrôle, une culture sœur peut être maintenue avec des supports conditionnés à 4 oC pendant le processus d'internalisation. L'internalisation minimale des récepteurs devrait se produire dans ces conditions.
  2. Étiquetage des récepteurs de surface
    1. Laver les cellules une fois avec PBSMD.
    2. Fixer les cellules avec 4% PFA et 4% saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      MISE EN GARDE: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation de PFA.
    3. Laver les cellules 3x avec un PBS régulier.
    4. Bloquer avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT pour empêcher la liaison non spécifique.
    5. Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs primaires étiquetés par anticorps (c.-à-d. récepteurs exprimés en surface qui n'ont pas été intériorisés).
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 555-conjugué chèvre anti-lapin anticorps secondaires (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
    6. Laver les cellules 3x avec PBS.
  3. Étiquetage des récepteurs intériorisés
    1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min.
    2. Bloquer la liaison non spécifique par incubation avec 10% de NGS en PBS pendant 30 min à RT.
    3. Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs étiquetés intériorisés.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 647-conjugué chèvre anti-lapin anticorps secondaires (1:500) est utilisé pour l'étiquetage.
    4. Laver les cellules 3x avec PBS.

5. Recyclage (Figure 4)

  1. Internalisation des récepteurs de surface étiquetés anticorps
    1. Après l'étiquetage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des médias conditionnés sans anticorps et les retourner à l'incubateur (37 oC) pour permettre l'internalisation.
      REMARQUE: Pour les récepteurs NMDA, 30 min pour l'internalisation est recommandé.
  2. Blocage des récepteurs exprimés à la surface stable
    1. Pour bloquer les épitopes sur l'anticorps primaire attaché aux récepteurs exprimés en surface qui n'ont pas été intériorisés, incuber des cellules avec des fragments d'anticorps non conjugués Fab anti-IgG (H-L) (contre le primaire utilisé dans la section 2.2) dilués dans des supports conditionnés ( 20 g/mL) pendant 20 min à RT. Ce traitement empêche l'interaction future avec les anticorps secondaires.
      REMARQUE: Pour cet exemple, des fragments de Chèvre anti-lapin Fab ont été utilisés.
      REMARQUE: Expérience de contrôle : pour s'assurer qu'un blocage complet des récepteurs exprimés en surface a eu lieu, les couvertures soeurs peuvent être incubées avec et sans Fab. Les cultures doivent être fixées immédiatement après le traitement Fab, et les deux cultures sont incubées avec Alexa 555-conjugué anticorps secondaires. Aucun signal Alexa 555 dans les cellules incubées Fab n'indique un blocage approprié des anticorps.
    2. Laver les cellules 3x avec des supports conditionnés.
    3. Incuber les cellules avec des supports conditionnés contenant 80 m de dynasore pour empêcher l'internalisation et retourner les cellules à l'incubateur (37 oC) pour permettre le recyclage des récepteurs intériorisés. Dynasore est un inhibiteur de GTPase qui inhibe le dynamin et empêche donc l'internalisation.
      REMARQUE: 45 min pour le recyclage NMDAR est recommandé. Notez que Dynasore bloque exclusivement le processus d'internalisation dépendant du dynamin (p. ex., l'internalisation des NMDR). Cependant, l'internalisation d'autres protéines synaptiques (dynamin-indépendante) peut encore se produire en présence de Dynasore.
  3. Étiquetage des récepteurs recyclés
    1. Laver les cellules une fois avec PBSMD.
    2. Fixer les cellules avec 4% PFA et 4% saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      MISE EN GARDE: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation de PFA.
    3. Laver les cellules 3x avec PBS.
    4. Bloquer avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT pour empêcher la liaison non spécifique.
    5. Étiqueter les cellules avec le premier anticorps secondaire étiqueté fluorescent dilué en 3% NGS en PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 555-conjugué anticorps anti-lapin de chèvre (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
    6. Laver les cellules 3x avec PBS.
      REMARQUE: Des lavages plus longs avec PBS (5-10 min) peuvent aider à réduire l'arrière-plan dans la préparation.
  4. Étiquetage des récepteurs intériorisés
    1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min.
    2. Bloc avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT.
    3. Étiquette avec le deuxième anticorps secondaire fluorescent-étiqueté dilué dans 3% NGS dans PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 647-conjugué anticorps anti-lapin de chèvre (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
    4. Laver les cellules 3x avec PBS.

6. Montage et imagerie d'échantillons

  1. Monter les cellules en plaçant doucement le côté des cellules des couvertures vers le bas sur 12 à 15 ml du support de montage approprié.
    REMARQUE: L'aspiration d'un excès de supports de montage améliorera la qualité des images.
  2. Cellules d'image sur un microscope confocal approprié.
    REMARQUE: Il est recommandé d'imager une z-pile à un grossissement de 60x avec des étapes de 0,35 m, englobant toute l'épaisseur du neurone.

7. Considérations temporelles

  1. Il s'agit d'un long protocole qui peut être arrêté à plusieurs points. Si désiré, effectuer des étapes de blocage et d'incubation des anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC dans une chambre humide.
  2. Alternativement, si désiré, utilisez un processeur de tissu micro-ondes pour accélérer considérablement les temps d'incubation post-fixation. Pour toutes les étapes, utilisez 150 W à 30 oC pour les réglages "On".
    1. Pour bloquer, exécutez le processeur à 2 min "On", 1 min "Off," et 2 min "On."
    2. Pour les étapes d'incubation des anticorps primaires et secondaires, exécutez le processeur à 3 min « On », 2 min « Off » et 3 min « On ».
      REMARQUE: Nous n'observons aucune différence de qualité en apportant les modifications ci-dessus au protocole.

8. Analyse d'image

  1. Il est recommandé d'utiliser FIJI 'lt;https://fiji.sc/'gt; pour effectuer une analyse d'image, car il est compatible avec plusieurs formats de fichiers. Pour nos données, des images dans le format de fichier Nikon ND2 ont été acquises.
  2. Un script macro est fourni pour la quantification par lots facile de différents paramètres présélectionnés par FIJI. Les étapes suivantes sont incluses dans la macro :
    REMARQUE: Pour ces exemples, « l'intensité intégrée » a été mesurée.
  3. Ouvrez les fichiers d'images dans les canaux FIJI et séparés.
  4. Z-projeter chaque pile de canal comme projection d'intensité maximale.
  5. Définir un seuil inférieur pour chaque canal.
    REMARQUE: Les seuils doivent être déterminés empiriquement pour chaque ensemble de données expérimentales. Bien que chaque canal puisse avoir une valeur de seuil inférieure distincte, il est crucial que les valeurs de seuil de canal soient constamment maintenues pour toutes les images d'un même ensemble de données.
  6. Sélectionnez trois à cinq dendrites secondaires ou tertiaires et sauvez-les en tant que régions d'intérêt (IA).
  7. Mesurer la densité intégrée de chaque retour sur investissement dans les canaux de surface et intracellulaires.
  8. Normaliser le signal pour chaque retour sur investissement en divisant la valeur de densité intégrée du canal de surface par le canal intracellulaire.
  9. Répétez les mesures pour toutes les images de contrôle et expérimentales et normalisez les valeurs expérimentales pour contrôler les valeurs (p. ex., GluN2B WT ou les conditions sans glycine).

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Representative Results

Ce protocole pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate est basé sur l'étiquetage différentiel des récepteurs exprimés à la surface de la cellule et ceux exprimés dans les membranes internes. La ségrégation est réalisée par l'étiquetage des récepteurs avant et après la perméabilisation de la membrane, en utilisant le même anticorps primaire, mais un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore différent. Comme le décrivent les étapes facultatives incluses dans le protocole, il s'agit d'une méthode très polyvalente pour interroger différents processus de trafic de récepteurs, tels que l'internalisation et le recyclage, et peut être facilement adaptée aux besoins de l'enquêteur (figure 1) .

Tout d'abord, une méthode est fournie pour la quantification des récepteurs exprimés à la surface neuronale. Ce protocole permet de quantifier l'expression de surface basale ainsi que d'étudier les mécanismes moléculaires par lesquels différents médicaments ou mutations modifient les niveaux basaux des récepteurs exprimés à la surface. Les récepteurs exprimés en surface ont d'abord été étiquetés en couvant avec des anticorps primaires et secondaires avant la perméabilisation. Après la perméabilisation avec 0.25% Triton X-100, le pool intracellulaire des récepteurs est accessible pour l'étiquetage d'anticorps. Pour illustrer ce protocole, la coloration de surface contre intracellulaire des récepteurs d'AMPA (AMPA) dans les cultures de contrôle et après induction du cLTP a été conduite. Plus précisément, les cellules vivantes ont été étiquetées à l'aide d'un anticorps contre un épitographe extracellulaire dans la sous-unité GluA1 de l'AMPAR, et les cellules ont été fixées puis étiquetées avec Alexa 555-conjugué secondaire. Les cellules ont ensuite été perméabilisées et étiquetées avec le même anticorps anti-AMPAR et incubées avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa 647. Cette double étiquetage permet une visualisation claire des deux populations de GluA1.

Après l'acquisition d'images confocales, le signal fluorescent peut être facilement quantifié pour montrer une augmentation de l'expression de surface, par rapport à la population intracellulaire, suivant cLTP (Figure 2A, B). Comme un contrôle, l'étape de perméabilisation a été ignorée (incubation avec 0,25% Triton X-100) dans un coverslip soeur et un anticorps primaire a été utilisé contre PSD-95, un marqueur intracellulaire standard pour les synapses excitatrices. Comme le montre la figure 2C, aucun signal pour PSD-95 ne peut être obtenu dans les cellules non perméabilisées, démontrant l'intégrité de la membrane plasmatique. Cela indique que le signal obtenu pour le « GluA1 de surface » correspond en effet aux récepteurs exprimés en surface (c.-à-d. que le signal pour le GluA1 exprimé en surface n'inclut pas les récepteurs intracellulaires). Fait important, un signal minimal pour le « GluA1 intériorisé » peut être observé dans des conditions de non-perméabilisation, montrant que toutes les épitopes de surface sont occupés par le cycle initial d'étiquetage des anticorps (c.-à-d. que le signal pour le GluA1 intracellulaire n'inclut pas récepteurs exprimés en surface).

Un deuxième processus qui peut être examiné en utilisant ce protocole est l'internalisation des récepteurs exprimés à la surface. Plus précisément, les récepteurs de surface sont étiquetés sur une cellule vivante, et les neurones sont retournés à l'incubateur pendant un temps donné pour subir l'internalisation des récepteurs par endocytose à médiation clathrine. Après cette étape, les cellules sont fixées pour préserver l'expression spatiale des récepteurs primaires étiquetés anticorps (c.-à-d. récepteurs exprimés en surface et intériorisés). Ensuite, les récepteurs de surface (c.-à-d. ceux qui n'ont pas été intériorisés au cours de la période d'intérêt) sont étiquetés avec un anticorps secondaire avant la perméabilisation. Après la perméabilisation, les récepteurs qui ont été intériorisés sont étiquetés par un anticorps secondaire avec un fluorophore différent.

Dans ce protocole, il a été examiné comment une phosphorylation particulière dans le ligand PDZ de la sous-unité GluN2B de NMDARs (à S1480) induit l'internalisation nMDAR. Pour ce faire, les cultures primaires ont été transfectées avec un récepteur phospho-mimétique, dans lequel la sérine (S1480) avait été remplacée par le glutamate (E). Le mutant qui en résulte, Le GluN2B S1480E, agit comme une forme « constitutivement phosphorylated » de GluN2B. Pour faciliter l'étiquetage de GluN2B et identifier le mutant phospho-mimétique, GFP a été utilisé comme une étiquette d'épitope sur le côté extracellulaire de GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Les récepteurs de surface sur les cellules vivantes ont été étiquetés avec un anticorps anti-GFP pendant 15 min à RT. Ensuite, l'anticorps excédentaire a été lavé avec des supports conditionnés et a renvoyé les cellules à 37 oC pendant 30 min pour permettre l'endocytose. Ensuite, les cellules ont été fixées pour geler le mouvement des récepteurs. Les récepteurs qui sont restés sur la surface ont alors été étiquetés avec l'anticorps secondaire Alexa 555-conjugué avant la perméabilisation.

Pour identifier les récepteurs qui avaient été intériorisés pendant la période d'incubation de 30 min, les cellules ont été perméabilisées, et les récepteurs intériorisés (déjà étiquetés avec un anticorps primaire) ont ensuite été étiquetés avec un anticorps conjugué Alexa 647. Encore une fois, cette stratégie de double étiquetage permet de quantifier la proportion de récepteurs intériorisés. Cet exemple souligne que la phosphorylation GluN2B à S1480 favorise l'internalisation des récepteurs, comme le mutant phospho-mimétique S1480E a montré un rapport d'internalisation beaucoup plus élevé par rapport aux récepteurs WT (Figure 3A, B). En tant que contrôle, une culture sœur à 4 oC a été maintenue dans des supports conditionnés pendant l'internalisation afin de ralentir fortement le processus. Comme prévu, aucun signal n'a été obtenu pour les récepteurs « internalisés » dans ces conditions (figure3C).

Enfin, ce protocole peut être utilisé pour examiner le recyclage des récepteurs précédemment intériorisés. Cette variation de protocole est une continuation du protocole d'internalisation, en suivant ces récepteurs de nouveau à la surface de cellules. Il y a deux éléments cruciaux à cette variation. Tout d'abord, les récepteurs qui sont restés stables exprimés à la surface pendant tout le protocole (c.-à-d. les récepteurs qui n'ont pas été intériorisés ou recyclés) doivent être « bloqués » afin qu'ils ne soient pas confondus avec des récepteurs recyclés. Pour ce faire, avant d'effectuer l'étape de recyclage, les neurones vivants sont incubés avec des concentrations élevées de Fab qui interagissent avec les récepteurs primaires étiquetés anticorps exprimés à la surface pour empêcher la liaison du secondaire fluorophore conjugué anticorps. Deuxièmement, l'internalisation doit être évitée pendant la phase de recyclage, de sorte que les récepteurs recyclés ne soient pas réintérisés. Cela a été fait en ajoutant dynasore aux médias pendant le recyclage que ce médicament bloque les processus dépendant de dynamin tels que l'endocytose clathin-négociée, comme l'internalisation NMDAR. Dans ce protocole, l'étude du trafic du mutant phospho-mimétique GluN2B S1480E a été réalisée ainsi que l'étiquetage de surface de GFP-GluN2B sur les cellules vivantes, ce qui a permis l'internalisation pendant une période de 30 minutes comme expliqué précédemment.

Par la suite, les récepteurs de surface qui n'ont pas été intériorisés pendant cette période ont été bloqués en couvant les cellules avec Fab pendant 20 min à RT. Ensuite, les cellules ont de nouveau été incubées à 37 oC pendant 45 min pour permettre de recycler le GluN2B préalablement intériorisé à la surface de la cellule. Dynasore était présent dans les médias lors de l'étape de recyclage. La fixation des cellules suivant cette étape permet d'identifier les récepteurs recyclés (c.-à-d. ceux qui sont débloqués et exprimés à la surface des cellules) et les récepteurs intériorisés (c.-à-d. ceux qui sont les anticorps primaires étiquetés et intracellulaires). Par 1) l'étiquetage des récepteurs recyclés avec un anticorps secondaire conjugué Alexa 555 avant la perméabilisation et 2) l'étiquetage intériorisé, mais non recyclé, des récepteurs avec Alexa 647-conjugué anticorps secondaires, un rapport de recyclage a été généré pour montrer que GluN2B S1480E n'a aucun effet sur le recyclage NMDAR (figure 4A, B). Comme un contrôle, il a été assuré que le blocage complet des récepteurs exprimés en surface s'est produit en couvant des couvertures soeurs en présence ou en absence de Fab, suivie s'est fixation DE PFA. Comme le montre la figure 4C, un signal fort peut être observé pour le GluN2B exprimé en surface en l'absence de blocage Fab. Ce signal disparaît dans les cultures traitées par Fab, démontrant que le protocole de blocage est suffisant pour bloquer complètement les épitopes exprimés à la surface et que les signaux de surface observés après le recyclage correspondent en effet aux récepteurs trafiqués vers la membrane plasmatique.

Figure 1
Figure 1 : Schéma tique des variations du protocole pour étudier l'expression de la surface des récepteurs, l'internalisation des récepteurs (endocytose) et le recyclage des récepteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : le cLTP augmente l'expression de surface de GluA1. Les neurones hippocampiques primaires à DIV21 ont été soumis au LTP chimique (cLTP) en couvant avec l'ECS contenant de la glycine. L'étiquetage distinct des populations de GluA1 exprimées en surface par rapport aux populations intracellulaires (bleues) de GluA1 révèle l'augmentation prévue de l'expression de surface de l'AMPAR. (A) Avion unique et (B) Z-empilés (projection d'intensité maximale) images confocales. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Le graphique montre l'expression accrue de surface du protocole GluA1 après cLTP. Indice d'expression de surface : récepteurs de surface/intracellulaires (n ' 3; nombre de cellules : con '7; cLTP '7; les valeurs représentent la moyenne ' SEM; 'p 'lt; 0.0001 utilisant le test Mann-Whitney U). (C) Expérience de contrôle dans laquelle l'étape de perméabilisation a été ignorée. En plus de la surface et interne GluA1, le marqueur synaptique excitateur intracellulaire PSD-95 a été évalué. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : La phosphorylation du GluN2B au S1480 favorise l'internalisation de NMDAR. Les neurones hippocampiques primaires ont été transfectés avec GFP-GluN2B WT ou le mutant phospho-mimétique GFP-GluN2B S1480E sur DIV11-12. Après 3-4 jours d'expression de protéine, le GFP de surface a été étiqueté sur des cellules vivantes avec un anticorps anti-GFP de lapin et les cellules ont été alors retournées à 37 oC pour permettre l'internalisation de récepteur par l'endocytosis. Des récepteurs exogènes exprimés en surface ont été visualisés avec l'anticorps secondaire Alexa 555-conjugué, et la population intériorisée identifiée après perméabilization utilisant l'anticorps Alexa 647-conjugué. Pour plus de clarté, la surface GFP-GluN2B est pseudo-colorée en vert et intériorisée GFP-GluN2B est pseudo-colorée en blanc. (A) Avion unique et (B) Z-empilés (projection d'intensité maximale) images confocales. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Le graphique montre l'internalisation élevée affichée par le mutant phospho-mimétique GluN2B S1480E. Indice d'internalisation : récepteurs intériorisés/récepteurs exprimés en surface (n - 6; nombre de cellules : WT - 34 ; S1480E 28; les valeurs représentent la moyenne - SEM; p lt; 0.001 en utilisant le test Mann-Whitney U). (C) Expérience de contrôle dans laquelle l'étape d'internalisation (Intenaliz.) a été effectuée à 4 oC. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La phosphorylation du GluN2B au S1480 ne modifie pas le recyclage NMDAR. Les neurones hippocampiques primaires ont été transfectés avec GFP-GluN2B WT ou le mutant phospho-mimétique GFP-GluN2B S1480E sur DIV11-12 comme indiqué dans la figure 3. Après 3-4 jours d'expression de protéine, le GFP de surface a été étiqueté sur des cellules vivantes avec un anticorps anti-GFP de lapin et les cellules ont été alors retournées à 37 oC pour permettre l'internalisation de récepteur par l'endocytosis. Les récepteurs exprimés en surface restants ont été bloqués par l'incubation de Fab et le recyclage a été autorisé pendant 45 min. La surface disponible exprimée récepteurs exogènes (recyclés) ont été visualisés avec Alexa 555-conjugué anticorps secondaires, et l'intériorisé population identifiée après perméabilisation à l'aide d'anticorps conjugués Alexa 647. Pour plus de clarté, la surface GFP-GluN2B est pseudo-colorée en blanc et intériorisée GFP-GluN2B est pseudo-colorée en vert.  (A) Avion unique et (B) Z-empilés (projection d'intensité maximale) images confocales. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Le graphique montre l'absence d'effet de la phosphorylation GluN2B S1480 sur le recyclage. Indice de recyclage : récepteurs recyclés/récepteurs internalisés (n ' 5; nombre de cellules : WT ' 27; S1480E 24; les valeurs représentent la moyenne - SEM; n.s. - non significatif à l'aide du test Mann-Whitney U). (C) Expérience de contrôle dans laquelle l'étape d'incubation Fab pour bloquer les épitopes exprimés en surface a été ignorée. Barres d'échelle de 50 m (cellule entière) ou de 5 m (dendrite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L'interaction entre une cellule et son environnement (par exemple, la communication avec d'autres cellules, la réponse à différents stimuli, etc.) repose fortement sur l'expression correcte des récepteurs à la surface de la cellule. La régulation rapide et affinée du contenu des récepteurs expriméens en surface permet une réponse cellulaire appropriée à un environnement en constante évolution. Dans le cas particulier des neurones, des altérations dans le nombre, la localisation, et la composition de subunit des récepteurs synaptically exprimés influence fortement la communication synaptique, la plasticité synaptique, la synaptogenèse, et l'élagage synaptique3, 5,10. Par conséquent, l'analyse précise de l'expression de la surface des récepteurs et du mécanisme sous-jacent à sa réglementation est un sujet de recherche important.

Il existe un certain nombre de modalités par lesquelles l'expression de surface des récepteurs peut être étudiée. En général, ces catégories relèvent de trois catégories principales : (i) l'isolement biochimique de la population de récepteurs exprimés à la surface, (ii) les techniques d'imagerie pour visualiser les récepteurs à la surface et (iii) les techniques fonctionnelles pour surveiller les conséquences des récepteurs activation. Ces approches sont complémentaires et peuvent être utilisées en conjonction pour répondre à des questions spécifiques sur l'expression de surface des récepteurs.

Les exemples d'isolement biochimique des récepteurs exprimés en surface comprennent les protocoles de biotinylation dans les cellules cultivées ou les tranches de cerveau et la fractionnement subcellulaire des cellules cultivées ou des tissus11. La biotinylation de surface est basée sur l'étiquetage des récepteurs exprimés en surface avec la biotine en couvant les cultures avec de la biotine activée par l'ester. Le groupe ester réagit avec les groupes aminés primaires (-NH2) pour former des liaisons amide stables. Étant donné que ce réactif est imperméable aux cellules, seules les protéines exprimées en surface sont étiquetées avec de la biotine. Après la lyse cellulaire utilisant des détergents, le récepteur étiqueté peut être récupéré en couvant le lysate de cellules avec des perles d'Agarose conjuguées à l'avidin ou à ses variantes qui ont une forte affinité pour la biotine, alors évaluée par immunoblotting. La fractionnement subcellulaire est un protocole biochimique qui utilise plusieurs étapes de centrifugation pour isoler différents compartiments membranaires cellulaires en fonction de leurs différentes densités12. Les deux techniques sont utiles pour quantifier les changements dans l'expression de surface des protéines endogènes et peuvent être utilisées en conjonction avec des approches pharmacologiques (in vivo et en culture) pour déterminer comment les manipulations moléculaires affectent l'expression de surface des récepteurs. Ils sont particulièrement utiles parce que les changements dans les récepteurs endogènes multiples, par rapport à une norme, peuvent être quantifiés simultanément. Cependant, contrairement aux modalités d'imagerie, telles que celle décrite dans ce protocole, la résolution spatiale est perdue par le traitement biochimique des échantillons.

Le protocole décrit ici appartient à la catégorie des techniques d'imagerie. Ce groupe d'approches (comme l'étiquetage de surface et l'imagerie à cellules vives de protéines surexprimées étiquetées fluorescentes) sont utiles pour donner une résolution spatiotemporelle à l'expression de surface des récepteurs. Par exemple, en examinant l'expression de surface par rapport à l'expression intracellulaire de l'AMPAR, comme illustré précédemment, on peut examiner comment les changements d'expression sont prononcés dans les dendrites (le compartiment biologique d'intérêt pour cette application particulière). Comme la fractionnement biochimique, les médicaments peuvent être utilisés avec des techniques d'imagerie pour déterminer les effets d'un médicament sur l'expression de la surface. En outre, la transfection des neurones avec des récepteurs contenant des modifications (mutations ou étiquettes) développe en outre les possiblities pour l'imagerie. La transfection avec des récepteurs mutants peut délimiter les effets d'une mutation particulière sur l'expression de surface.

Une autre approche utile pour visualiser le trafic de récepteurs est la microscopie d'imagerie vivante après la transfection des cultures primaires avec des constructions fluorescentes, telles que la phluorine superécliptique (SEP) - ou d'autres constructions taguées par fluorophore13. Les récepteurs marqués par le SEP peuvent être particulièrement utiles pour étudier les récepteurs exprimés en surface, car ce fluorophore ne fluoré lorsqu'il est exposé au milieu extracellulaire. Comme les exemples précédents, des approches pharmacologiques peuvent être utilisées, ou des mutations faites sur le récepteur, pour déterminer si elles modifient les caractéristiques d'expression de surface du récepteur. Dans le cas des médicaments, l'imagerie cellulaire vivante peut être utilisée pour surveiller les modifications de l'expression de la surface en temps réel. Une limitation à l'imagerie en direct est le manque de perspicacité mécaniste dans les changements dans l'expression de surface. Par exemple, une diminution de l'expression de surface peut être le résultat d'une internalisation accrue des récepteurs, d'une réduction du recyclage des récepteurs, ou des deux.

Pour répondre à cette question, le protocole décrit ci-dessus peut être utilisé. Un autre événement important de trafic qui peut être surveillé à l'aide d'approches d'imagerie en direct est la diffusion latérale des récepteurs entre les différents compartiments de la membrane plasmatique (par exemple, entre les sites synaptiques et extrasynaptiques). Dans ce cas, la technique de choix est l'utilisation d'approches de suivi à parti unique dans lesquelles un nanocristal semi-conducteur de fluorescence [c.-à-d., Quantum Dot (QD)] est attaché à un anticorps contre un épitope extracellulaire sur la protéine d'intérêt. Les QD sont caractérisés par une stabilité remarquable (permettant beaucoup moins de photoblanchiment que les protéines fluorescentes traditionnelles), une forte luminosité et l'alternance entre le statut on/off (« clignotement »). En utilisant les réglages appropriés au microscope, il est possible de suivre le mouvement d'un seul QD (et, par conséquent, une seule protéine d'intérêt) à travers la membrane plasmatique cellulaire14.

Le protocole actuel prévoit un examen des récepteurs de la population de surface, de la population intériorisée et de la population recyclée, ce qui permet de calculer les ratios pour déterminer comment ces processus contrôlent l'expression totale de la surface. En outre, l'arrêt des processus d'internalisation ou de recyclage à différents moments ajoute une résolution temporelle. Cette méthode permet donc des études d'expression de surface spatiotemporales. Contrairement aux autres techniques d'imagerie, les niveaux d'expression endogène de la surface peuvent également être étudiés (p. ex., AMPAR), à condition qu'il existe un anticorps contre la partie extracellulaire du récepteur. Cependant, parce que cette méthode nécessite la fixation des cellules, elle n'est pas compatible avec l'imagerie cellulaire vivante et ne peut donc pas fournir d'informations en temps réel.

Enfin, les approches fonctionnelles comme l'électrophysiologie15 ou l'imagerie calcique16 sont des manières puissantes, bien que souvent indirectes, d'étudier l'expression de surface des récepteurs. Ces méthodes sont basées sur la quantification des changements fonctionnels dans la cellule après l'activation du récepteur (p. ex., changement de potentiel membranaire ou concentration de calcium). Utilisant la pharmacologie pour isoler la réponse d'un récepteur donné, ces méthodes permettent d'estimer les récepteurs exprimés à la surface de la cellule d'une manière précise et spatiotemporal. Ces méthodes sont polyvalentes et permettent l'étude des cellules en culture et dans des conditions plus physiologiques ex vivo (par exemple, tranches de cerveau aigus) et invivo. Cependant, comme dans le cas des approches d'imagerie en direct, l'information mécaniste est souvent manquée lors de l'utilisation d'approches fonctionnelles.

En résumé, une combinaison de techniques pour étudier l'expression de surface des récepteurs peut être utilisée pour bien comprendre comment l'expression de surface est contrôlée. Le protocole présenté ici est particulièrement puissant car il fournit une compréhension mécaniste de l'expression de surface spatiotemporaldes des récepteurs dans les cultures primaires dissociées.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions le Northwestern Center for Advanced Microscopy pour l'utilisation du microscope Nikon A1 Confocal et leur aide dans la planification et l'analyse des expériences. Cette recherche a été appuyée par nigMS (T32GM008061) (A. M. C.), ni NIA (R00AG041225) et une subvention de jeunes chercheurs du NARSAD de la Brain and Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

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References

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