Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

Biochemistry

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Summary

Cette méthode est utile pour quantifier la dynamique précoce de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules dépendantes de l'ancrage sur la fibronectine. En outre, cet analyse peut être employé pour étudier les effets de l'homéostasie altérée de redox sur la diffusion de cellules et/ou les voies intracellulaires liées à l'adhérence cellulaire.

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Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

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Abstract

L'adhérence et la diffusion des cellules sur la matrice extracellulaire (ECM) sont des processus cellulaires essentiels pendant le développement de l'organisation et pour l'homéostasie des tissus adultes. Fait intéressant, le stress oxydatif peut modifier ces processus, contribuant ainsi à la physiopathologie de maladies telles que le cancer métastatique. Par conséquent, la compréhension du mécanisme (s) de la façon dont les cellules se fixent et se propagent sur l'ECM pendant les perturbations dans le statut redox peut fournir un aperçu des états normaux et de la maladie. Décrit ci-dessous est un protocole étape-sage qui utilise un jeu d'immunofluorescence-basé pour quantifier spécifiquement l'adhérence cellulaire et la diffusion des cellules immortalisées de fibroblaste sur la fibronectine (FN) in vitro. En bref, les cellules dépendantes à l'ancrage sont maintenues en suspension et exposées à l'inhibiteur de la kinase ATM Ku55933 pour induire un stress oxydatif. Les cellules sont ensuite plaquées sur la surface enduite de FN et autorisées à s'attacher pendant des périodes prédéterminées. Les cellules qui restent attachées sont fixes et étiquetées avec des marqueurs d'anticorps à base de fluorescence de l'adhérence (p. ex. la paxilline) et de la propagation (p. ex., F-actine). L'acquisition et l'analyse de données sont effectuées à l'aide d'équipements de laboratoire couramment disponibles, y compris un microscope à épifluorescence et un logiciel Fidji disponible gratuitement. Cette procédure est très polyvalente et peut être modifiée pour une variété de lignées cellulaires, protéines ECM, ou inhibiteurs afin d'examiner un large éventail de questions biologiques.

Introduction

Les adhérences de matrice cellulaire (c.-à-d. les adhérences focales) sont de grands et dynamiques complexes de protéines multimoléculaires qui entravent l'adhérence cellulaire et la propagation. Ces processus sont essentiels pour le développement, l'entretien et la fonction physiologique des tissus. Les adhérences focales sont composées de récepteurs liés à la membrane, tels que les intégrines, ainsi que de protéines d'échafaudage qui relient l'actine cytosquelettique à la matrice extracellulaire (ECM)1. Ces complexes sont capables de répondre aux indices physiochimiques présents dans l'environnement extracellulaire grâce à l'activation de diverses voies de transduction de signalisation. En tant que tel, les adhérences focales servent de centres de signalisation pour propager des indices mécaniques extracellulaires dans un certain nombre de processus cellulaires, y compris la migration dirigée, la régulation du cycle cellulaire, la différenciation, et la survie1,2. Un groupe de molécules de signalisation qui régulent et interagissent avec les adhérences focales comprend des membres de la famille Rho de petits GTPases. Les Rho GTPases sont des protéines clés qui régulent la migration cellulaire et la dynamique d'adhérence grâce à leur activation spatiotemporale spécifique3. Sans surprise, la dysrégulation de la fonction de protéine de Rho a été impliquée dans un certain nombre de pathologies humaines telles que la métastes, l'angiogenèse, et d'autres. D'intérêt particulier, le statut de redox cellulaire joue un rôle prédominant dans la modulation de la migration cellulaire et de l'adhérence. Des altérations de l'homéostasie redox, telles que l'augmentation des espèces réactives d'oxygène (ROS), ont été démontrées pour réguler l'activité de protéine de Rho, aussi bien que l'adhérence, dans un certain nombre de types de cellules et de maladies humaines4,5,6 ,7,8. Par exemple, les personnes souffrant du trouble neurologique ataxie-telangiectasia (A-T), qui est causée par une mutation dans la réparation des dommages à l'ADN serine / thréonine kinase A-T-mutated (ATM), ont un risque accru de cancer métastatique9, 10. La perte de l'activité de kinase d'ATM dans ces patients et lignes cellulaires, par la mutation génétique ou l'inhibition chimique, a comme conséquence des niveaux élevés de stress oxydatif dû au dysfonctionnement de la voiedephosphate de pentose 7,11, 12. En outre, des études récentes du laboratoire ont mis en évidence un rôle pathophysiologique pour ROS dans A-T en modifiant la dynamique cytosquelettique (c.-à-d. l'adhérence et la propagation) comme résultat direct de l'activation de la famille Rho GTPases in vitro5. En fin decompte, ces altérations de la dynamique cytosquelettique causée par l'activation de la famille Rho peuvent conduire à un risque accru de cancer métastatique noté chez les patients A-T5,13. Par conséquent, la compréhension de l'interaction entre les interactions cellule-matrice pendant le stress oxydatif peut fournir un aperçu de la régulation de l'adhérence et de la propagation. Ces études peuvent également préparer le terrain pour d'autres investigations sur un rôle possible pour la famille Rho GTPases dans ces processus de signalisation.

Décrit ci-dessus est un protocole pour étudier la dynamique cellulaire tôt de l'assemblage d'adhérence et de se propageant pendant l'effort oxydant provoqué par l'inhibition de l'activité de kinase d'ATM. Cet assay est basé sur le mécanisme bien caractérisé de l'adhérence des cellules dépendantes de l'ancrage à la fibronectine de protéine d'ECM (FN). Lorsque les cellules maintenues en suspension sont plaquées sur FN, plusieurs Rho GTPases coordonnent le contrôle de l'actine cytosquelettique3,14. Des changements morphologiques sont observés à mesure que les cellules passent de l'apparence ronde et circulaire à l'aplatiet et à l'expansion. En même temps que ces observations, il y a le développement de nombreuses adhérences matricielles avec l'ECM. Ces changements sont attribués à l'activation biphasique de RhoA avec Rac1 pendant la première heure que les cellules adhèrent et se propagent 15,16.

Une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner la morphologie et la dynamique de l'adhérence ainsi que la propagation cellulaire. Cependant, ces méthodes s'appuient sur des systèmes sophistiqués de fluorescence interne totale à long terme (TIRF) ou de microscopie confocale. Ainsi, les utilisateurs doivent avoir accès à de l'équipement et à des logiciels spécialisés. En outre, le temps d'configuration requis par ces systèmes de bio-imagerie rend la capture des événements d'adhérence précoce difficile, en particulier lors de l'essai de plusieurs inhibiteurs ou des conditions de traitement en même temps.

Les méthodes détaillées, ici, fournissent un moyen simple, économique, mais quantitatif pour évaluer les paramètres qui régissent l'assemblage d'adhérence et la propagation in vitro. Le protocole est exécuté à l'aide d'équipement de laboratoire couramment disponible, comme un microscope épifluorescence et une caméra CCD. Cet analyse consiste à appliquer des cellules dépendantes de l'ancrage à une surface enduite de FN après une période de stress oxydatif causée par l'inhibition chimique de l'activité kinase ATM, qui a été démontrée précédemment5. Après le placage, les cellules sont autorisées à se fixer et à adhérer pendant des durées déterminées. Les cellules non attachées sont lavées, tandis que les cellules attachées sont fixées et étiquetées avec des anticorps à base de fluorescence aux marqueurs d'adhérence (p. ex. de paxillin) et de propagation (p. ex., F-actin)2,5. Ces protéines sont ensuite visualisées et enregistrées à l'aide d'un microscope à épifluorescence. L'analyse ultérieure des données est effectuée à l'aide du logiciel Fidji disponible gratuitement. En outre, cette méthode peut être adaptée pour examiner la dynamique d'adhérence dans un large éventail de conditions, y compris différentes protéines ECM, le traitement avec diverses conditions d'oxydants/culture cellulaire ou une variété de lignées cellulaires dépendantes de l'ancrage pour répondre à un large éventail de questions biologiques.

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Protocol

1. Préparations

REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous a été optimisé pour l'utilisation avec les cellules REF52 et les fibroblasteshumains. D'autres types de cellules peuvent nécessiter une optimisation plus poussée, comme décrit dans les notes et les sections de dépannage ci-dessous.

  1. Faire 500 ml de milieu de culture cellulaire complet pour les cellules REF52. À 500 ml de glucose élevé contenant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) ajouter 10% FBS, 2 mM L-glutamine, et 100 unités/mL pénicilline-streptomycine.
  2. Préparer une solution de fibronectine (FN) de 25 g/mL en ajoutant une solution FN de 300 oL de 1 mg/mL à 12 ml de saline tamponnée stérile de 1x phosphate (PBS), pH 7,4. Bien mélanger.
  3. Préparer une solution de 0,5 % (w/v) délipidée (c.-à-d. sans acide gras) d'albumine bovine (dlBSA) dans un milieu de culture cellulaire DMEM sans sérum. Ajouter 0,5 g de dlBSA à 100 ml de milieu DMEM sans sérum. Bien mélanger la solution, mais ne pas vortex. Filtre stérile la solution dans un nouveau récipient stérile, à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 M avant utilisation. Conserver à 4 oC.
  4. Faire 3,7% solution de paraformaldehyde en dissolvant 3,7 g de paraformaldéhyde dans 100 ml de 1x PBS. Utilisez une chaleur douce et en remuant pour obtenir le paraformaldehyde dans la solution.
    REMARQUE : La solution de paraformaldéhyde est sensible à la lumière et doit être protégée de la lumière. Il est bon pour jusqu'à une semaine lorsqu'il est stocké à 4 oC.
    CAUTION : Le paraformaldéhyde est toxique, inflammable, corrosif et dangereux pour la santé. Examiner la fiche de données sur l'innocuité des matériaux pour le paraformaldéhyde avant d'être utilisée. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation, y compris le bouclier oculaire, le protection facial, le respirateur de particules intégrale, les gants et la blouse de laboratoire.
  5. Préparer la solution de perméabilisation contenant 0,2 % de surfactant non ionique dans 1x PBS (v/v). Pour 100 ml, ajouter lentement 0,2 ml de Triton X-100 à 100 ml de 1x PBS, en remuant.
  6. Faire dissous le tampon de blocage de l'immunofluorescence contenant 2,5 % de BSA, 5 % de sérum de chèvre et 0,05 % de surfactant non ionique (w/v/v) dans la solution 1x PBS. Pour 100 ml, ajouter 5 ml de sérum de chèvre, 2,5 g de BSA et 0,05 ml de Triton X-100 en 95 ml 1x PBS, en remuant.
  7. Cultivez des cellules REF52 dans le milieu de culture complet de DMEM dans une plaque traitée par culture cellulaire de 10 cm2 (ou toute autre taille de navire) dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2.

2. Plaque de culture cellulaire de revêtement avec la fibronectinde extracellulaire de protéine de matrice

REMARQUE : Effectuez cette section en utilisant la technique aseptique et les réactifs stériles dans un capot de flux laminaire certifié BSL-2. Consultez la figure 1A pour un aperçu des étapes clés avant le début.

  1. À l'aide d'une plaque certifiée 24 puits, placez une plaque de verre (12-Cir-1) dans chaque puits. Étiqueter la plaque selon la figure 1B.
  2. Pipette 500 l de la solution FN de 25 g/mL pour chaque puits d'une plaque de 24 puits.
  3. Pipette la solution sur chaque coverslip à quelques reprises pour assurer un revêtement uniforme et une submersion complète. Remettre le couvercle sur l'assiette.
  4. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pour 1 h.
    REMARQUE : Alternativement, incuber toute la nuit à 4 oC.
  5. Après 1 h, retirer la plaque de l'incubateur et aspirer la solution FN des puits.
  6. Laver les puits trois fois avec 500 l de 1x PBS. Aspirez le lavage final de 1x PBS.
  7. Bloquer les puits avec une solution dlBSA de 500 oL de 0,5 % pour un minimum de 15 min à 37 oC et 5 % de CO2.
  8. Aspirez la solution dlBSA avant de placage les cellules à l'étape 3 ci-dessous.
    REMARQUE : Si vous stockez des plaques, ajoutez 500 'L de 1x PBS à chaque coverslip après aspiration de la solution dlBSA. Les plaques peuvent ensuite être conservées à 4 oC jusqu'à une semaine.

3. Préparation des cellules dépendantes de l'ancrage pour l'adhérence

REMARQUE : Effectuez cette section en utilisant la technique aseptique et les réactifs stériles dans un capot de flux laminaire certifié BSL-2.

  1. Au moins 30 min avant le placage cellulaire, préchauffez les solutions suivantes : milieu complet DMEM, solution dlBSA, 1x PBS, 0,5 % de trypsine-EDTA solution, et sérum neutralisant la trypsine (TNS) dans un bain d'eau à 37 oC.
  2. En commençant par une monocouche confluente de cellules REF52 dans un plat de 10 cm2, lavez les cellules deux fois avec 6 ml de 1x PBS chaud. Sérum affaisser les cellules pendant au moins 1 h (selon le type de cellule) dans 6 ml de solution dlBSA chaude à 37 oC et 5% CO2.
  3. Laver les cellules avec 6 ml de 1x PBS réchauffé, aspirer PBS et ajouter 1,5 ml de solution chaude de 0,5% Trypsin-EDTA.
  4. Placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 min.
  5. Observez les cellules sous un microscope léger pour s'assurer que le détachement est complet. Si les cellules sont encore adhérentes après avoir tapé la plaque sur le dessus du banc, retournez à l'incubateur de 37 oC pendant 2 min supplémentaires. Trypsiniser les cellules pendant aussi peu de temps que nécessaire.
  6. Pipette 1,5 ml de solution de neutralisation de la trypsine chaude (TNS) au plat pour arrêter la trypsinisation et recueillir les cellules détachées. Pipette la solution de haut en bas sur le fond de la plaque de nombreuses fois pour enlever toutes les cellules adhérentes restantes. Si les cellules semblent agglomupées, triturate davantage la suspension de la cellule en faisant doucement monter et descendre sur le dos du plat.
  7. Compter les cellules à l'aide de l'exclusion bleu trypan et un hémocytomètre sous un microscope léger. Vous pouvez également utiliser un compteur cellulaire automatisé.
  8. Enlever une quantité appropriée de cellules pour créer une suspension cellulaire de 1,0 à 3,0 x 104 cellules/mL dans 5 ml de dlBSA dans un tube conique de 15 ml.
  9. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 5 min à l'aide d'un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse de table.
  10. Aspirez le supernatant de la pastille cellulaire, et resuspendles les cellules dans un total de 7 ml de solution dlBSA chaude. Ne laissez pas les cellules être trop confluentes sur le placage de couverture, mais également distribuées avec peu de cellules se touchant les unes les autres.
  11. Divisez uniformément la suspension cellulaire en deux tubes coniques de 15 ml, l'un pour le seul contrôle du véhicule (DMSO) et l'autre pour Ku55933 (inhibiteur de la kinase ATM, oxydant)5. Assurez-vous que chaque tube contient 3,5 ml de suspension cellulaire.
  12. À l'aide d'un rotateur de tube, tournez les tubes à 37 oC pendant 90-120 min dans un incubateur de culture cellulaire.
  13. 30 min avant le placage, ajouter une concentration finale de 10 M Ku55933 et DMSO (1:1,000) à chaque tube respectif. Remettre la suspension de la cellule sur le rotateur pour le reste du temps.
  14. Immédiatement avant de placage les cellules, récupérer la plaque de 24 puits de l'incubateur et aspirer la solution dlBSA.
  15. Après avoir revolving la suspension cellulaire pendant 90-120 min, retirer 500 l de suspension cellulaire de chaque groupe de traitement et ajouter à un bordereau enduit FN dans la plaque de 24 puits de l'étape 2 comme illustré (Figure 1B). Remettre la plaque à l'incubateur de culture cellulaire CO2 de 37 oC et 5 % et la suspension cellulaire à la rotation.
  16. Après le placage de la suspension cellulaire sur les couvertures couvertes FN, permettre aux cellules d'adhérer pendant la durée désirée (p. ex. 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) et passer immédiatement à l'étape 4.

4. Fixation cellulaire et coloration d'anticorps pour immunofluorescence

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions non stériles et à température ambiante, sauf indication contraire.

  1. Après le temps désiré pour l'adhérence a passé, aspirer la solution cellulaire de chaque coverslip dans la plaque.
  2. En utilisant les côtés du puits, distribuez délicatement 500 l de solution de paraformaldéhyde de 3,7 % sur chaque bordereau et attendez de 10 à 15 min.
  3. Retirez la solution de paraformaldéhyde et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS pour un total de deux fois.
    REMARQUE : Éliminer les déchets de paraformaldéhyde de façon responsable, selon le plan de santé et de sécurité environnementales de l'institution.
  4. Aspirez le PBS, et perméabilize cellules sur chaque coverslip avec 500 L de 0,2% Triton X-100 en 1x PBS (v/v) pendant 10-15 min à température ambiante.
  5. Laver chaque bordereau avec 500 oL de 1x PBS trois fois.
  6. Bloquer les cellules sur chaque bordereau de couverture avec 500 l de tampon de blocage d'immunofluorescence contenant 5% de sérum de chèvre, 2,5% BSA et 0,05% Triton X-100 dissous dans une solution 1 x PBS pendant 30-60 minutes.
  7. Diluer l'anticorps anti-paxillin primaire (1:250) dans le tampon de blocage. Bien mélanger et ajouter 200 l de la solution d'anticorps à chaque bordereau. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
    REMARQUE : Alternativement, la solution primaire d'anticorps peut être incubée pendant la nuit à 4 oC. Il y a beaucoup de marqueurs focaux communs d'adhérence qui pourraient être employés pour des complexes d'adhérence de coloration et l'analyse suivante de FA. Il s'agit notamment d'anticorps contre les protéines suivantes : sous-unités intégrines (1, 5 ou V), taline ou vinculine2.
  8. Aspirez la solution d'anticorps et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS trois fois pendant 10 min chacun. Protégez les échantillons de la lumière à partir de ce point vers l'avant.
  9. Diluer la sonde phalloidin F-actinconjuge conjuguée au colorant rouge fluorescent Alexa 594 (1:1000) et à la souris chèvre-anti 488 anticorps secondaires fluorescents (1:400) dans la même solution tampon de blocage. Bien mélanger et ajouter 200 l de la solution d'anticorps à chaque bordereau pendant 30 min.
    REMARQUE : Des anticorps secondaires conjugués par fluorescent d'autres espèces peuvent également être utilisés. Cependant, l'utilisation d'anticorps d'autres espèces nécessitera une modification du sérum tampon de blocage.
  10. Aspirez la solution d'anticorps et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS trois fois pendant 10 min chacun.
  11. Aspirer le 1x PBS et rincer une fois avec 500 oL de dIH2O.
  12. Les couvertures de montage sur les lames de microscope à l'aide du support de montage anti-fade contenant du DAPI.
  13. Laissez les lames de microscope pour les mettre toute la nuit dans l'obscurité à température ambiante.
  14. Entreposer les lames de microscope dans l'obscurité à 4 oC pour le stockage à long terme et jusqu'à l'imagerie.
    REMARQUE : Image utilisant des techniques standard d'immunofluorescence. Il est recommandé d'utiliser une lentille objective 60x d'immersion d'huile de haute puissance pour assurer une résolution suffisante pour noter les adhérences focales et les volants périphériques aux bords cellulaires. Acquérir des images de 20-30 cellules dans plusieurs champs de vision pour chaque coverslip sous chaque condition de traitement et le temps. À partir de répliques combinées, cela devrait donner au moins 60 cellules afin d'effectuer une analyse statistique. Enregistrer et exporter des images de fluorescence en tant que . Fichier TIFF avec une résolution minimale de 300 dpi.

5. Quantifier les fibres de stress, la circularité cellulaire et la formation d'adhérence focale

REMARQUE : Les analyses d'images suivantes sont effectuées à l'aide de la dernière version du package de traitement d'imagerie open source Fiji Is Just Image J (Fidji), qui peut être téléchargé gratuitement à (http://fiji.sc/).

  1. Traitement général de l'image
    REMARQUE : Toutes les images devront être préparées pour des analyses de calcul en effectuant des étapes 5.1.1-5.1.5 ci-dessous (figure 2). Par la suite, toutes les procédures de quantification ultérieures peuvent être sélectionnées.
    1. Ouvrez le . Image de fluorescence de TIFF utilisant fidjiens. Assurez-vous que les images sont 8 bits et à l'échelle grise.
    2. Sélectionnez Image-Ajuster-Fenêtre/niveau et sélectionnez Auto (Figure 2A).
    3. Sélectionnez L'arrière-plan Process-Subtract pour soustraire la fluorescence de fond. Vérifiez le paraboloid coulissant et sélectionnez l'option d'un rayon de boule de roulement de 50 pixels (figure 2B).
      REMARQUE : Pour vérifier la taille appropriée du rayon de la boule roulante, sélectionnez l'outil de ligne et dessinez un rayon sur la plus grande adhérence de l'image. Sélectionnez Mesure pour vérifier la longueur de la ligne tracée. Si la valeur du rayon est trop grande, les entités, y compris les adhérences, seront perdues dans l'image. Si le rayon est trop petit, il donnera lieu à des artefacts dans l'image traitée en raison du bruit de fond.
    4. Sélectionnez Image-Ajuster- Luminosité/Contraste pour vérifier l'intensité de l'adhérence sur l'arrière-plan. Ajuster si nécessaire.
      REMARQUE: Pour optimiser la luminosité/contraste et éviter de saturer le signal, utilisez l'outil de recherche de l'image pour examiner son histogramme afin d'ajuster la luminosité/contraste.
    5. Sélectionnez les paramètres suivants dans les mesures Analyze-Set: Zone, Valeur moyenne du gris, Descripteurs de forme et Densité intégrée.
  2. Analyse de formation de fibre de contrainte
    REMARQUE : Les fibres de stress peuvent être quantifiées de multiples façons selon le phénotype.
    1. Comptez le nombre de cellules avec des fibres de stress en pourcentage sur le nombre total de cellules. Cette analyse est préférable s'il existe des différences visuelles dans le nombre de fibres de stress formées dans différentes conditions expérimentales.
    2. Comptez le nombre de fibres de stress qui transversent la cellule. Cette analyse permet de comparer le nombre de fibres de stress formées par cellule.
    3. Mesurer l'intensité totale de fluorescence donnée par la phalloidine (p. ex., F-actin) par cellule17,18. Cette méthode mettra en évidence des augmentations/diminutions drastiques de l'intensité de fluorescence dues à la coloration f-actine.
      1. Définiz les paramètres de mesure à l'étape 5.1.5 ci-dessus.
      2. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils Fidji et tracez manuellement la cellule d'intérêt. Sélectionnez Analyze-Measure. Une nouvelle fenêtre apparaîtra indiquant les paramètres de mesure sélectionnés.
      3. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils Fidji et tracez manuellement un espace vide sans cellules présentes. Sélectionnez Analyze-Measure. Cette mesure servira de fluorescence de fond.
      4. Utilisez l'équation ci-dessous pour déterminer la fluorescence totale de l'actine F par cellule :
        Equation 1
        REMARQUE : La mesure résultante peut être normalisée et comparée à d'autres cellules pour donner la fluorescence de F-actin par cellule.
  3. Analyse de circularité cellulaire
    REMARQUE : Des informations sur la zone cellulaire (un indicateur de propagation cellulaire au fil du temps), ainsi que la circularité peuvent également être enregistrées. Cette mesure est donnée comme un rapport entre 0 à 1 comme un moyen de quantifier les cellules qui sont allongées à ronde, respectivement.
    1. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils fidjienne et tracez une cellule individuelle. Sélectionnez Image-Mesure et enregistrez la zone cellulaire et les mesures du périmètre pour chaque cellule. Répétez cette procédure pour chaque cellule.
      REMARQUE : Sous la fonction Mesures de l'ensemble, la circularité est fournie comme mesure des descripteurs de forme (étape 5.1.5).
    2. Compter manuellement les ébouriffements ou les saillies enrichis par cellule, tels qu'ils sont représentés dans la figure 3 et la figure 4.
  4. Analyse de l'adhérence focale
    REMARQUE : Avant d'effectuer l'analyse d'adhérence focale, installez le plugin mexicain de filtre de chapeau sur la dernière version de Fidji. Le protocole suivant a été modifié à partir d'études précédentes19,20,21.
    1. Sélectionnez Process-Enhance Local Contrast (Clahe) en utilisant un bloc de taille de 19, des bacs histogrammes 256, et une pente maximale de 6, sans masque et pas rapide. (Figure 2C)
    2. Sélectionnez Process-Filters- Gaussian Blur avec un Sigma (Radius) de 2.0 pour filtrer l'image (Figure 2D).
    3. Sélectionnez Plugins-Mexican Hat Filter (Mhf) avec un rayon de 2.0 (Figure 2E).
    4. Exécuter Threshold et sélectionnez Dark Background et Over/Under en utilisant Huang ou Isodata comme méthode de seuil. Sélectionnez Auto-Threshold.
      REMARQUE : Cette étape garantit que les adhérences sont mises en évidence, mais aussi distinctes les unes des autres.
    5. Sélectionnez Particules d'analyse-analyse avec les paramètres suivants sélectionnés : taille 20, pixels-infini et circularité 0,00-0,99. Vérifiez les contours pour assurer la détection et la séparation appropriées des adhérences focales.
      REMARQUE : Ces résultats donnent le nombre, la zone, et la description de forme des adhérences focales individuelles.

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Representative Results

Un schéma général de la mise en place expérimentale

La figure 1 représente le schéma général pour l'adhérence cellulaire et le protocole de propagation commençant par la famine de sérum des cellules REF52 et se terminant par l'analyse computationnelle des images acquises de fluorescence. Les étapes clés du protocole sont illustrées dans la chronologie. Il convient de noter que l'étape 2 du protocole décrit la préparation des fiches de couverture enduites de FN, qui doivent être effectuées en même temps que l'étape 3 : sérum affamé des cellules REF52 avant de les placer en suspension (figure 1A). Exemple d'une plaque de 24 puits étiquetée comme un faux indiquant les groupes de traitement et la durée de l'adhérence cellulaire avant la fixation d'échantillons pour la microscopie à fluorescence (figure 1B).

Traitement d'image d'immunofluorescence pour la quantification focale d'adhérence

Les cellules REF52 ont été suspendues pendant 90 minutes, plaquées sur FN, et autorisées à adhérer pendant 15 minutes supplémentaires. Après fixation et coloration avec un anticorps anti-paxillin, des images fluorescentes à l'échelle grise 8 bits des cellules ont été acquises. L'analyse du traitement d'image a été effectuée selon le protocole défini à l'étape 5. Sont montrées des images représentatives de chaque étape de traitement distincte, y compris l'image originale (Figure 2A), et des images suivant la soustraction de fond (post-Rolling Ball) (Figure 2B), CLAHE (Figure 2C), Gaussian Blur ( Figure 2D) et Filtre à chapeaux mexicain (post-MHF) (figure 2E) étapes de filtrage. Après avoir terminé toutes les étapes de traitement d'image, les adhérences focales individuelles doivent être importantes, ciblées et facilement distinguables les unes des autres(figure 2E). Une fois les images filtrées, les adhérences focales peuvent être quantifiées et leur surface mesurée (étapes 5.1 et 5.4).

Visualisation de l'adhérence cellulaire et propagation sur le FN après stress oxydatif

Une image de fluorescence à l'échelle grise représentative de l'anti-paxilline (marqueur d'adhérence focalisé) (Figure 3, panneau supérieur) et de la coloration de la sonde phalloidin F-actin(figure 3, panneau inférieur) des cellules REF52 après plaquage sur FN avec ou sans Ku55933 ( ROS-induisant le traitement d'agent). Avant l'assidu, les cellules REF52 étaient affamées pendant 1 h. Après la famine de sérum, les cellules ont été maintenues en suspension tout en étant traitées avec l'un ou l'autre véhicule seul ou 10 Ku55933 pour induire le stress oxydatif. Les cellules ont été plaquées sur des couvertures enduites de FN pour les temps indiqués, fixes, puis tachées d'un anticorps aux adhérences focales et à la phalloidin pour détecter les protéines F-actin. Les adhérences focales et les fibres de stress proéminentes devraient être facilement visibles dans les cellules REF52 après avoir été autorisés à adhérer pendant 20-30 min sur LES cellules PLAQUÉes FN. Les cellules plaquées ne devraient pas se chevaucher les unes avec les autres pour permettre la propagation cellulaire complète après l'adhésion. Remarquez les bords cellulaires clairs et distincts ainsi que l'espace pour les cellules individuelles à se propager (Figure 3). Les volants enrichis en F-actine au bord d'avant des membranes cellulaires sont visibles et indiqués avec une flèche (figure 3, panneau inférieur).

Représentation graphique des images de fluorescence quantifiées des fibres de stress et du degré de propagation cellulaire

Exemples d'images quantifiées affichées sous forme de graphique à barres représentant le pourcentage de cellules avec des fibres de stress et le degré de diffusion cellulaire avec et sans traitement Ku55933 à divers moments après l'adhérence. Des images fluorescentes de la sonde phalloidin F-actin et de la coloration anti-paxillin, semblables aux images montrées dans la figure 3, ont été analysées pour le pourcentage de fibres de stress et de propagation cellulaire (c.-à-d. indice de circularité) en utilisant les procédures d'analyse d'image décrit à l'étape 5 du protocole. Notamment, le traitement oxydant a causé une augmentation significative de la formation de fibres de stress à tous les points de temps d'adhérence examinés (figure 4A) et une diminution de la propagation cellulaire après 15 minutes d'adhérence cellulaire à LA FN (Figure 4B).

Images d'immunofluorescence non quantifiables dues à la confluence cellulaire

Les cellules REF52 affamées de sérum ont été maintenues en suspension pendant 90 minutes, pendant lesquelles elles ont été traitées avec 10 Ku55933 pour induire la formation de ROS. Les cellules ont ensuite été plaquées sur FN et ont été autorisées à adhérer pendant 20 minutes, après quoi elles ont été fixées et tachées d'anti-paxillin ou de phalloidin-Alexa 594 F-actin sonde. Le placage à des densités cellulaires plus élevées conduit à l'encombrement cellulaire, qui interdit aux cellules de se propager complètement en raison de la confluence excessive. Les bords des cellules d'avis sont indiscernables des cellules adjacentes (flèches jaunes) (Figure 5A). Par conséquent, la quantification des cellules individuelles est exclue, et la circonférence de propagation ne peut pas être déterminée avec précision. Dans la figure 5B, une lignée cellulaire distincte, les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ont été suspendues puis plaquées sur FN pendant 30 minutes. Des cellules ont alors été fixées et souillées avec un anticorps d'anti-paxillin. Les cellules hors foyer sont marquées par des flèches rouges (Figure 5B). De plus, la réactivité croisée de l'anticorps anti-paxillin avec des débris cellulaires (flèche bleue) modifiera le seuil au cours de l'analyse quantitative de l'image (partie 5) et ne devrait pas être incluse dans l'analyse (figure 5B).

Figure 1
Figure 1: Ligne temporelle du protocole et par exemple de mise en place de plaques de 24 puits.
(A) La ligne de temps met en évidence les étapes clés de l'adhérence cellulaire et de la procédure de propagation. (B) Représentant étiqueté 24-plaque, illustrant des groupes de traitement et des temps pour l'adhérence cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Exemples d'images d'immunofluorescence représentatives après le traitement de l'image.
Les cellules REF52 ont été suspendues pendant 90 min, plaquées sur LE FN, et autorisées à adhérer pendant 15 min. Les cellules ont été fixées et tachées d'un anticorps anti-paxillin. (A) Image originale et images suivantes (B) Soustraction de fond (post-Rolling Ball), (C) CLAHE, (D) Gaussian Blur et (E) Mexican Hat Filter (Post-MHF) étapes de filtrage. Bar, 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives d'immunofluorescence de l'anti-paxillin et de la sonde de phalloidin F-actin souillé stained REF52 cellules plaquées sur FN.
Avant l'assidu, les cellules REF52 étaient affamées pendant 1 h. Après la famine de sérum, les cellules ont été maintenues en suspension tandis qu'elles ont été traitées avec l'un ou l'autre véhicule seul ou 10 Ku55933 pour causer le stress oxydant. Des cellules ont été plaquées sur des couvertures ENduites de FN pour les temps indiqués, fixées et tachées d'un anticorps aux adhérences focales et à la phalloidin pour détecter des protéines F-actin. F-actine enrichi volants au bord d'avant des membranes cellulaires sont indiqués avec une flèche. Bar, 40 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Tolbert et al.5Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Quantification des images d'immunofluorescence.
Graphiques illustrant (A) le pourcentage de cellules présentant des fibres de stress et (B) mesures de circularité cellulaire. La circularité cellulaire a été définie comme la zone cellulaire divisée par le périmètre cellulaire. Les valeurs variaient de 0 à 1,0 indiquant une morphologie allongée ou arrondie, respectivement. Les barres d'erreur indiquent le test t-testde S.E.M. Student pour les échantillons appariés de 0,01 à partir d'expériences réalisées en triple. Ce chiffre a été modifié à partir de Tolbert et al.5Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images d'immunofluorescence non quantifiables.
(A) Les cellules REF52 affamées de sérum ont été maintenues en suspension pendant 90 min, tandis qu'elles ont été traitées avec 10 M Ku55933. Les cellules ont été plaquées sur FN et ont permis d'adhérer pendant 20 min. Les cellules ont été fixées et tachées avec l'anti-paxillin ou la phalloidin-Alexa 594 F-actin sonde. Les bords cellulaires sont représentés par des flèches jaunes. (B) Les cellules MEF ont été suspendues puis plaquées sur FN pendant 30 min. Les cellules ont été fixées et tachées d'un anticorps anti-paxillin. Les cellules hors foyer sont indiquées par des flèches rouges et la réactivité croisée de l'anticorps anti-paxillin avec des débris cellulaires sont dénotées avec des flèches bleues. Bar, 30 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole décrit ici est un moyen polyvalent et économique de filtrer rapidement un certain nombre de types de cellules dépendantes de l'ancrage pour le cytosquelette dynamique remodelant pendant la propagation cellulaire. En particulier, cette méthode examine quantitativement la fibre de stress et la formation d'adhérence focale pendant le stress oxydatif lorsque les cellules adhèrent à la FN (figure 1A). En outre, ces phénotypes cellulaires peuvent suggérer un rôle réglementaire pour les membres de la famille Rho de petits GTPases car ils ont documenté des rôles pendant l'attachement cellulaire et la diffusion15,16,22. Cependant, d'autres techniques biochimiques seraient nécessaires pour identifier la participation possible des protéines actives et liées à la famille Rho liées au GTP.

Le protocole présenté utilise la détection d'immunofluorescence de F-actin et de paxilline pour examiner spécifiquement l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules immortalisées de fibroblaste sur FN après stress oxydatif induit par l'inhibition de kinase d'ATM (figure 2, Figure 3 et Figure 4). Cependant, cette procédure peut également être adaptée pour une utilisation sur d'autres protéines ECM et / ou pour d'autres types de cellules adhérentes. Lors de l'adaptation à d'autres lignées cellulaires, il est important d'optimiser les conditions expérimentales, en particulier : nombre de cellules/densité, temps de famine de sérum, concentration de protéine d'ECM, et conditions oxydantes de traitement d'effort. Lors de l'essai des effets d'un stimulus inconnu sur l'adhérence et la dynamique de propagation, il est nécessaire d'inclure des échantillons de contrôle négatifs et positifs pour vérifier que l'essai fonctionne correctement. Les échantillons de contrôle négatifs peuvent comprendre un échantillon non traité ou réservé au véhicule, tandis qu'un contrôle positif devrait induire un stress oxydatif (p. ex., H2O2). En outre, bien que n'est pas discuté ici, il est également essentiel d'utiliser les contrôles d'anticorps appropriés. Il est recommandé d'utiliser trois contrôles distincts pour chaque anticorps afin de vérifier sa spécificité et d'identifier tout saignement potentiel de fluorescence à travers23,24. Il s'agit notamment de: 1) un contrôle primaire des anticorps pour assurer une liaison spécifique de l'anticorps primaire à l'antigène et de confirmer que la liaison antigène se produit dans les conditions de fixation utilisées, 2) un contrôle secondaire des anticorps (pour les anticorps conjugués non secondaires ) qui montre la spécificité de l'anticorps primaire, et 3) les contrôles de fluorophore qui assurent le fluorophore ajouté n'est pas le résultat de la fluorescence endogène ou de saignement-à travers d'un autre anticorps.

Bien que cet analyse soit utile pour analyser les premiers événements cinétiques de l'assemblage et de la diffusion de l'adhérence, il ne convient pas à l'examen détaillé du démontage ou de la force d'adhérence d'adhérence et du renforcement cellulaire. Cette dernière nécessite l'utilisation de biostations d'imagerie à long terme ou de techniques de spectroscopie à force monocellulaire. Ces dernières techniques comprennent la microscopie à force atomique, les pinces optiques, les capteurs de tension des protéines d'adhérence telles que la vinculine25 ou lataline 26,27, et la microscopie à force 3D28.

Les étapes critiques du protocole comprennent des couvertures de revêtement approfondies avec FN. Ceci est nécessaire pour la diffusion uniforme et l'adhérence des cellules. Il est donc important de pipette la solution FN de haut en bas sur les couvertures plusieurs fois avant l'incubation. Les fiches de couverture doivent rester complètement immergées dans la solution FN pendant la période d'incubation. Les couvertures enduites FN peuvent être conservées jusqu'à 2 semaines à 4 oC.

La densité cellulaire est également importante, car les cellules qui sont plaquées trop densément n'atteindront pas la circonférence maximale de propagation. En outre, il ne serait pas possible de distinguer les adhérences focales individuelles ou les volants cellulaires pour chaque cellule individuelle. Il est donc nécessaire de compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé avant de les suspendre. Bien qu'une estimation de la densité cellulaire soit fournie pour les cellules REF52, elle devra être déterminée empiriquement pour d'autres cellules à l'étude. Les cellules doivent être plaquées assez peu pour que peu de cellules se chevauchent, ce qui leur permet de se propager complètement (Figure 5).

D'autres étapes critiques dans le protocole à considérer sont fluorescente conjuguée phalloidin-Alexa 594 F-actin sonde et les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Par conséquent, les échantillons doivent être peu exposés à la lumière après l'application de ces réactifs. En outre, un certain nombre d'agents qui induisent le stress oxydatif ont de courtes demi-vies. Il est donc nécessaire de tester l'oxydant choisi pour une dose optimale et le temps d'exposition pour atteindre une activité maximale.

Les sections suivantes contiennent des conseils de dépannage en ce qui concerne la concentration de FN, les conditions de famine de sérum, et les méthodologies de détachement de cellules. Ces conseils sont utiles lors de l'adaptation du protocole pour d'autres lignées de cellules et / ou des conditions de traitement.

Pour une analyse cohérente de fa, des conditions optimales d'attachement et d'épandage sont nécessaires, qui varieront selon le ligand D'ECM. Pour fn, commencez à utiliser une plage dynamique de 10 à 30 g/mL. À des concentrations plus élevées de FN, il y a peu de différence dans l'attachement cellulaire. Cependant, certains types de cellules ne se propagent pas efficacement à des concentrations plus élevées d'ECM.

Chaque type de cellule réagit différemment aux conditions de famine de sérum. Les cellules REF52 peuvent facilement être affamées du jour au lendemain sans aucune perte de viabilité, cependant, ce n'est pas vrai pour toutes les lignées cellulaires. Par conséquent, il est nécessaire de déterminer dans quelle mesure la lignée cellulaire à l'étude peut résister à la famine du sérum.

Pour la diffusion des essais, les cellules doivent être trypsinisées pour le moins de temps possible pour les résultats reproductibles29. Après le détachement cellulaire par trypsinisation, les récepteurs de surface cellulaire, leurs ligands cognate, et l'activité de Rho GTPase exigent une période de récupération pour revenir aux niveaux stables-état14,15. La procédure de trypsinisation décrite dans ce protocole devrait permettre aux cellules de conserver la plupart de leurs récepteurs de liaison FN de surface cellulaire29. Cependant, certains types de cellules peuvent nécessiter d'autres méthodes de détachement cellulaire pour empêcher complètement la digestion des récepteurs de surface cellulaire. Ces méthodes comprennent des cellules de chélage utilisant des solutions basées sur l'EDTA (par exemple, Versene) ou des solutions de dissociation enzymatiques plus douces (par exemple, Accutase). L'utilisation de ces solutions de dissociation peut laisser intactes les adhérences cellules-cellules, ce qui entraîne des amas cellulaires. Il est donc important de resuspendre complètement les cellules individuelles pour assurer la reproductibilité expérimentale.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les Drs Scott R. Hutton et Meghan S. Blackledge pour l'examen critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés par les programmes de recherche et de parrainage (MCS) de l'Université High Point et le Programme de biotechnologie de la North Carolina State University (MCS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

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References

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