التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تقنيات المقاصة البصرية تجعل الأنسجة شفافة عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة للتصوير الثلاثي الأبعاد اللاحقة (3-D). وقد حظيت باهتمام كبير في جميع مجالات البحوث لإمكانية تحليل الهياكل المجهرية متعددة الخلايا التي تمتد على مسافات العيان. وبالنظر إلى أن أنابيب الكلى، والأوعية الدموية، والأعصاب، وغطاء الكلى تمتد في العديد من الاتجاهات، والتي تم التقاطها جزئيا فقط من قبل التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد حتى الآن، وتطهير الأنسجة فتحت أيضا العديد من المجالات الجديدة لبحوث الكلى. قائمة أساليب المقاصة البصرية تنمو بسرعة، ولكن لا يزال من الصعب للمبتدئين في هذا المجال لاختيار أفضل طريقة لسؤال بحثي معين. شريطة هنا هو طريقة بسيطة تجمع بين وضع العلامات الأجسام المضادة من شرائح الكلى الماوس سميكة. (أ) التطهير البصري باستخدام الإيثيل الإيثيلي الرخيص وغير السام والجاهزة للاستخدام؛ والتصوير البؤري. يصف هذا البروتوكول كيفية بث الكلى واستخدام خطوة استرجاع مستضد لزيادة ربط الأجسام المضادة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يتم عرض تطبيقه في تصوير هياكل متعددة الخلايا مختلفة داخل الكلى، ويتم معالجة كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوء اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. كما نناقش الصعوبات المحتملة في تصوير الفلوروفورس الذاتية والحصول على عينات كبيرة جدا وكيفية التغلب عليها. يوفر هذا البروتوكول البسيط أداة سهلة الإعداد وشاملة لدراسة الأنسجة في ثلاثة أبعاد.

Introduction

وقد أدى الاهتمام المتزايد بدراسة أعضاء كاملة أو هياكل كبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير أساليب التطهير البصري التي تنطوي على تصوير الأنسجة الشفافة في ثلاثة أبعاد. حتى وقت قريب، كانت أفضل الطرق لتقدير عدد الخلايا، وطول، أو حجم الهياكل كلها ستيريوي أو مقطع تسلسلي شامل، والذي يقوم على أخذ العينات النظامية من الأنسجة لتحليلها في وقت لاحق في بعدين 2 , 3- ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتاطويلا وتحتاج إلى مستوى عال من التدريب والخبرة 4. طرق المقاصة البصرية التغلب على هذه المشاكل عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة لجعل الأنسجة شفافة للتصوير 3-D7.

وقد تم تطوير عدة طرق للتطهير البصري تندرج في فئتين رئيسيتين: الأساليب القائمة على المذيبات والأساليب القائمة على مائي. يمكن تقسيم الأساليب المائية إلى غمربسيط 8،هايبرأوهدينغ10،11،وهيدروجيل التضمين12،13. الطرق القائمة على المذيبات تجفيف الأنسجة، وإزالة الدهون وتطبيع مؤشر الانكسار إلى قيمة حوالي 1.55. القيود المفروضة على معظم الأساليب القائمة على المذيبات هي تبريد الفلورة الذاتية من البروتينات مراسل شائعة الاستخدام مثل GFP، سمية المذيبات، والقدرة على حل الغراء المستخدمة في بعض غرف التصوير أو العدسات الموضوعية، وانكماش الأنسجة خلال الجفاف14،15،16،17،18،19،20،21. ومع ذلك، الطرق القائمة على المذيبات بسيطة، وكفاءة الوقت، ويمكن أن تعمل في عدد من أنواع الأنسجة المختلفة.

تعتمد الطرق المائية على غمر الأنسجة في الحلول المائية التي تحتوي على مؤشرات انكسار في نطاق 1.38-1.528و11و12و22و23و24 . وقد وضعت هذه الأساليب للحفاظ على انبعاث البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية ومنع الانكماش الناجم عن الجفاف، ولكن القيود المفروضة على معظم أساليب المقاصة المائية تشمل مدة أطول من البروتوكول، وتوسيع الأنسجة، و تعديل البروتين (أي إزالة الصبغة الجزئية للبروتينات عن طريق اليوريا فيبروتوكولات ترطيب مفرط مثل ScaleA2) 7،11،23،25. تناول ScaleS توسع الأنسجة من خلال الجمع بين اليوريا مع السوربيتول، والتي توازن عن طريق الجفاف توسع الأنسجة الناجمة عن اليوريا، والحفاظ على البنية الفوقية للأنسجة كما تم تقييمها من قبل المجهر الإلكتروني10. يؤثر انكماش الأنسجة أو توسعها على الأحجام المطلقة للهياكل أو المسافات بين الكائنات أو كثافة الخلايا لكل وحدة تخزين. وبالتالي، فإن قياس التغيرات في الحجم عند إزالة الأنسجة قد يساعد على تفسير النتائج التي تم الحصول عليها7،26.

بشكل عام، يتكون بروتوكول التنظيف البصري من خطوات متعددة، بما في ذلك المعالجة المسبقة، ونفاذية، ووسم المناعة (إذا لزم الأمر)، ومطابقة مؤشر الانكسار، والتصوير مع الفحص المجهري الضوئي المتقدم (على سبيل المثال، اثنين من الفوتون، أو البؤرة، أو ضوء ورقة الفلورة المجهرية). وقد وضعت معظم نُهُج المقاصة لتصور الأنسجة العصبية، وقد أثبتت الدراسات الناشئة تطبيقها في أجهزة أخرى5. وقد ثبت من قبل هذه الأداة الشاملة للسماح بتحليل موثوق وفعال لهياكل الكلى، بما في ذلك الكلى27،28،التسلل المناعي28،الأوعية الدموية28،وشرائح الأنابيب 29، وهو نهج مثالي لتحسين فهم وظيفة الكبيبي والأنابيب إعادة عرض في الصحة والمرض.

ملخصة هنا هو طريقة تعتمد على المذيبات التي تجمع بين تلطيخ المناعة من أنابيب الكلى. التطهير البصري مع رخيصة، غير سامة، وجاهزة للاستخدام الكيميائية إيثيل سينامات (ECi)؛ والتصوير المجهري البؤري الذي يسمح بالتصور الأنبوبي الكامل والقياس الكمي. هذه الطريقة بسيطة، تجمع بين مستضد استرجاع شرائح الكلى مع تلطيخ الأجسام المضادة التجارية، ولا تتطلب معدات متخصصة، مما يجعلها في متناول معظم المختبرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية، والسلطات المحلية ذات الصلة في آخن، ألمانيا.

1. الرجعية البطن الأبهر التسريب وتثبيت الكلى الماوس

  1. إعداد الحلول في نفس اليوم أو المساء قبل وتخزينها في الثلاجة بين عشية وضحاها. حلول دافئة لدرجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  2. جعل دفعة جديدة من 3٪ بارافورمالهايد (PFA) في 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). هناك حاجة إلى حوالي 50-100 مل PFA لكل ماوس.
    1. لجعل 1 لتر من 3٪ PFA: تزن 30 غرام من PFA وإضافة 800 مل من الماء المقطر في غطاء محرك الدخان. يُحرّك المزيج ويُحرّك إلى 50-60 درجة مئوية. لا تسخن فوق 70 درجة مئوية.
      تحذير: PFA سامة. إعداد PFA في غطاء محرك السيارة الدخان.
    2. ببطء إضافة عدة قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 2N. انتظر بضع دقائق حتى يذهب PFA إلى الحل أو إضافة بضع قطرات أخرى. بعض القطع الصغيرة لن تذوب.
    3. إزالة الحل من الحرارة. إضافة 50 مل من 20X PBS. تبرد على الجليد إلى RT.
    4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3-7.4 مع حمض الهيدروكلوريك إضافة الماء المقطر إلى 1 لتر.
    5. إزالة أي جزيئات غير مذابة عن طريق تصفية 1X PBS و 3٪ PFA مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. إضافة 1000 وحدة من الهيبارين إلى 1 لتر من 1X PBS. نقل 1X PBS التي تحتوي على الهيبارين و 3٪ PFA في 1X PBS في المحاقن البلاستيكية 50 مل منفصلة.
    ملاحظة: إذا كانت متاحة، يمكن استخدام مضخة التي تسيطر عليها الضغط في 80-100 مم زئبق أو الضغط الهيدروستاتيكي (طريقة بالتنقيط، وارتفاع حلول التسريب: 160-200 سم فوق الحيوان) لضخ الكلى.
  4. ربط PBS، PFA وإبرة فراشة 21 G حادة إلى سدادة ثلاثية. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام بأكمله.
  5. تسمية أنبوب مخروطي 15 مل والاستغناء عن 10 مل من PFA في ذلك.
  6. تخدير عميق للذكور أو الإناث C57BL/6 الماوس 12-24 أسابيع من العمر باستخدام 120 ملغ / كغ من الكيتامين وزن الجسم و 16 ملغ / كغ من وزن الجسم xylazine. يجب فحص الحيوان للغياب الكامل للاستجابة عن طريق الضغط على ردود الفعل قبل الشروع في الجراحة (على سبيل المثال، منعكس قرصة اصبع القدم).
  7. بمجرد أن يصل الحيوان إلى مستوى جراحي للتخدير، وضعه على ظهره تحت المجهر التشريحي. فتح البطن جراحيا مع شق في البطن خط الوسط باستخدام مقص التشغيل وفضح الشريان الأبهر البطني.
  8. المشبك الشريان الأبهر البطني الحق فوق المتفرعة إلى الشريان الحرقفي مع hemostat منحني. ثم المشبك الشريان الأبهر البطني الحق تحت الشرايين الكلوية مع serrefine الصغيرة. قم بعمل شق صغير (1 مم) على الشريان الأبهري البطني بين المشابك مع مقص الفاناس. أدخل إبرة الفراشة في الشق ببطء وكن حذرا ً لعدم تمزيق الشريان الأبهري البطني المفتوح.
  9. قم بإزالة الشريان الكلوي الأيمن بخياطة حريرية 5-0 وإزالة الكلى المناسبة لإجراء تحليل آخر إذا كانت هناك حاجة إلى كلية واحدة فقط للتسريب والتثبيت.
  10. إزالة serrefine الصغيرة، مقطعة الوريد المدخل مع مقص فاناس، وperfuse على الفور مع 50 مل من PBS تحتوي على الهيبارين، ثم التبديل وperfuse مع 50 مل من 3٪ PFA.
    ملاحظة: الضغط العالي من خلال الشريان الأبهري البطني مطلوب لفتح أنابيب الكلى لنشر الأجسام المضادة بشكل أفضل من خلال الأنسجة. قد لا يفتح التسريب من خلال القلب أنابيب كلوية.
  11. جمع الكلى الممزوجة بعناية وتجنب ثقب أو الضغط على الأنسجة.
  12. إزالة الكبسولة وقطع الكلى إلى شرائح الإكليل 1 ملم سميكة. استخدام مصفوفة تقطيعاللحم (جدول المواد) لتوحيد سمك شريحة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، والنظر في استخدام الاهتزاز.
  13. تزج شرائح الكلى مع PFA أعدت في أنبوب مخروطي 15 مل المسمى.
  14. الاستغناء عن 10 مل من PFA إلى آخر المسمى 15 مل أنبوب مخروطي. امسح إبرة الإيقاف والفراشة ثلاثية الاتجاه مع PBS قبل الانتقال إلى الماوس التالي.
  15. تنفيذ ما بعد التثبيت بين عشية وضحاها في RT محمية من الضوء.

2. إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة

  1. بعد التثبيت، وغسل شريحة الكلى مرتين مع1X غسل العازلة (جدول المواد) لمدة 1 ساعة على الروك الأفقي في RT.
  2. إجراء استرداد مستضد. تسخين 300 مل من 1X مستضد كشف الحل (T قادرةعلىالمواد) في كوب 500 مل إلى 92-98 درجة مئوية. قم بتضمين الشريحة في شريط تضمين نفاذي إلى المخزن المؤقت الساخن مع التحريك لمدة ساعة واحدة عند 92-98 درجة مئوية. إزالة الكأس من الحرارة وتركها لتبرد إلى RT.
    ملاحظة: يقوم بعض البائعين باختبار أجسامهم المضادة لتطبيق الكيمياء المناعية وسوف يدرجون طريقة استرجاع مستضد مقترحة في ورقة البيانات. لذلك، قد تتطلب بعض الepitopes المخزن المؤقت أكثر أساسية (على سبيل المثال، الحموضة 9).
  3. نقل شريحة في 10 مل من 1X العازلة غسل مع 0.1٪ تريتون X-100 والصخور بين عشية وضحاها في RT. غسل شرائح 2X مع 10 مل من 1X العازلة غسل الطازجة لمدة ساعة 1 في اليوم التالي.
  4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 500 درجة مئوية منمادة منع المناوطة الطبيعية (جدول المواد). ابدأ بتركيز من 1:50-1:100. هز بلطف شريحة الكلى في الجسم المضاد الأساسي المخفف لمدة 4 د عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: منذ كل الأجسام المضادة له خصائص فريدة من نوعها، ودرجة الحرارة أثناء حضانة الأجسام المضادة والتخفيفات من الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تكون الأمثل لتحقيقات الفردية. للتحكم الثانوي للأجسام المضادة فقط، ترعى أنسجة الكلى في تخفيف دون الأجسام المضادة الأولية. بدلا من ثنائي ة الأجسام المضادة التجارية، 1X PBS مع 0.1٪ تريتون X-100 و 0.01٪ يمكن استخدام أزيد الصوديوم.
  5. غسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في RT مع تغيير واحد من العازلة غسل بعد 8 ح.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 1:100 للأجسام المضادة الثانوية المترافقة أليكسا فلور) في 500 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة الطبيعي. حضانة شرائح الكلى في الجسم المضاد الثانوي المخفف لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية. من هذه الخطوة فصاعدا، وحماية شرائح الكلى من الضوء.
  7. اغسل شرائح الكلى في 10 مل من 1X مخزن الغسيل الاحتياطي بين عشية وضحاها في RT مع تغيير واحد من العازلة غسل بعد 8 ح.

3. إزالة الأنسجة

  1. نقل شريحة الكلى إلى 5 مل منارتفاع درجة 100٪ الإيثانول (جدول المواد) لمدة 2 ساعة في RT مع هزاز لطيف (مع تغيير واحد إلى الإيثانول الطازج بعد 1 ساعة). هذه الخطوة هي لجفاف الأنسجة.
    ملاحظة: مطلوب الإيثانول عالية الجودة لتحقيق شفافية الأنسجة العالية في الخطوة التالية. الميثانول أو رباعي هيدروفوران هي الكواشف الجفاف البديلة مع إمكانية إزالة الدهون عالية.
  2. تزج شريحة الكلى في 2مل من ECi (جدول المواد) مع هزاز لطيف في RT (مع تغيير واحد إلى ECi الطازجة بعد 2 ساعة) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: نقطة التجميد / ذوبان ECi هو 6-8 درجة مئوية. لذلك، لا تقم بتخزين العينات في الثلاجة. إجراء الغمر في غطاء الدخان التهوية بشكل صحيح وتجنب الاتصال المباشر مع الملابس والجلد (ECi هو غير سامة الغذاء والدواء المعتمدة من قبل إدارة مركب ولكن لديه رائحة قوية). استخدام أنابيب Eppendorf العادية أو الأوعية الزجاجية (لا سفن البوليسترين).
  3. يمكن تحقيق شفافية الأنسجة بعد غمر ECi وعندما تكون شرائح الكلى جاهزة للتصوير.

4. التصوير البؤري وتحليل الصور

ملاحظة: بالنسبة للتصوير، يمكن استخدام تقنيات الفحص المجهري الأخرى طالما أن حل مطابقة الفهرس الانكسار متوافق مع العدسة الموضوعية. يستخدم هذا البروتوكول مجهرًا مقلوبًا.

  1. إضافة 600-1000 درجة مئوية من ECi فيالطبق السفلي الزجاجي (جدول المواد).
    ملاحظة: تجنب استخدام أطباق زراعة الخلايا العادية، لأن ECi هو مذيب عضوي من شأنه أن يذوب الأطباق البلاستيكية. وبالمثل، ECi قد تهاجم أجزاء بلاستيكية / حلقات العزل على العدسات الموضوعية. راجع التقارير المناسبة للحصول على نظرة عامة على أطباق التصوير المتوافقة30 والغرف المطبوعة ثلاثية الأبعاد ذاتية الصنع28.
  2. نقل شريحة الكلى شفافة في الطبق. ضع غطاء مستدير على شريحة الكلى لتطبيق ضغط الضوء نحو أسفل الزجاج. ختم الطبق مع فيلم البارافين (جدولالمواد)لتجنب تسرب ECi.
    ملاحظة: قد تتطلب الأعضاء الكاملة أو عدة شرائح من الأنسجة السميكة بالمليمتر حدودًا (أسمنت الأسنان أو الاستومر سيليكون؛ راجع جدولالمواد) حول الأنسجة لجعل تجمع ECi للعينة.
  3. ضع الطبق على منصة التصوير المجهري.
  4. تأخذ عدة z-مداخن وأداء خياطة. تبدأ مع حجم خطوة z من 5 ميكرومتر.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار استخدام مسافة العمل الطويلة (>5 مم) والفتحة الرقمية العالية (>0.9) لأهداف تصوير شرائح الأنسجة السميكة جدًا أو الأعضاء. بعد التصوير، نقل الأنسجة مرة أخرى إلى الإيثانول وتخزينها في العازلة غسل أو PBS مع 0.02٪ أزيد الصوديوم.
  5. تحليل الصورة باستخدام تقديم ثلاثي الأبعاد مع البرامج (جدولالمواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكلى هي أعضاء معقدة تتألف من 43 أنواع الخلايا المختلفة31. معظم هذه الخلايا تشكل هياكل كبيرة متعددة الخلايا مثل الكبية والأنابيب، ووظيفتها تعتمد إلى حد كبير على التفاعلات مع بعضها البعض. الكلاسيكية 2-D التقنيات النسيجية التقاط جزئيا هذه الهياكل الكبيرة، وقد تفوت التغييرات البؤرية داخل هياكل سليمة31. وهكذا، فإن التحليل ثلاثي الدّي باستخدام تقنيات التنظيف البصري يساعد على فهم كيفية عملها في الصحة والمرض.

معظم تقنيات المقاصة البصرية القائمة على المذيبات سوف على الأقل جزئيا إرواء إشارة البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية. وقد لوحظ التبريد من YFP الموسومة Parvalbumin عند الجفافوالمقاصة البصرية مع ECi (الشكل 1). ومع ذلك، قد تقاوم بروتينات الفلورسنت القوية الأخرى تبريد الإشارات، وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى المستويات الأساسية (الرقم الهيدروجيني 8-11) قد استقرار البروتينات الفلورية الذاتية14،20،28،30. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي النظر في الأساليب القائمة على المائية إذا كان من المرغوب فيه الحفاظ على انبعاثات البروتين الفلوري. وفي هذا التقرير، يثبت أن بروتوكول المقاصة القائم على المذيبات يتوافق مع وضع العلامات على الأجسام المضادة؛ على الرغم من أنه لا يزال من الصعب تحقيق علامات المناعة العميقة للأنسجة، وخاصة في عضو غني بالخلايا الكثيفة مثل الكلى.

ثم أجريت التسريب الأبهري البطني الرجعي للكلى لإزالة خلايا الدم وفتح الأنابيب (الشكل2A، B). هذا النهج يقلل من الفلورة الذاتية وتحسين انتشار الأجسام المضادة. تركيز الأجسام المضادة يعتمد على حجم الأنسجة ووفرة مستضد. لذلك، يمكن أن تتصل إشارة سطحية إما ضعف اختراق الأجسام المضادة أو كمية غير كافية من الأجسام المضادة (الشكل 3A، B، انظر أيضا الفيلم 1). بالنسبة للعينات الكبيرة أو علامات وفيرة للغاية، قد تكون هناك حاجة إلى تركيزات أعلى من الأجسام المضادة وتجديد الأجسام المضادة بعد 1-2 أيام. إذا تم التعبير عن مستضد الاهتمام في الأوعية الدموية الكلوية ، ينبغي النظر في تسليم الجسم المضاد داخل الأوعية الدموية (الشكل 3C). ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات في الغشاء الصدحي للخلايا الظهارية الأنبوبية لا تعبر حاجز الترشيح الكبيبي بسبب الحجم الجزيئي، مما يسبب إشارات غير محددة في الأوعية الدموية وجلابية (الشكل3D).

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على شرائح الكلى أو الكلى بأكملها (الشكل4A, B). لاختبار خصوصية الأجسام المضادة، تم إخضاع عناصر التحكم فقط للجسم المضاد الثانوي (الشكل4C). يمكن تسمية الأنسجة بأجسام مضادة للكشف عن مجموعة خلايا محددة (على سبيل المثال، الخلايا المتكاثرة، الشكل 4D)أو لتصور أجزاء أنبوبية كاملة باستخدام أجسام مضادة خاصة بقطعة (الشكل4E). وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين الأجسام المضادة المتعددة يوفر الفرصة لإضفاء الطابع المحلي على بروتينات مختلفة في 3-D (على سبيل المثال، للكشف عن تضخم الأنابيب الخاصة بقطعة محددة كما يحدث في إعادة عرض الأنابيب على محفزات مختلفة) (الشكل4F, G; انظر أيضا الفيلم 2).

Figure 1
الشكل 1: تبريد إشارة بروتين مراسل الفلورسنت الذاتية. (أ) بروتين مراسل الفلورسنت المحلي المشتق من بارفالبومينYFP+الماوس المعدل وراثيا يمكن الكشف عنها في 5 ميكرومتر رقيقة PFA ثابتة أقسام الكلى المجمدة. الأسهم علامة بعض parvalbumin الفلورسنت المسمى+ الخلايا الموجودة في الجزء الأول من الأنابيب الملتوية البعيدة. (ب) لا توجد إشارة فلورية واضحة بعد أن لوحظ تمسح البصرية من أنسجة الكلى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تقييم جودة التسريب الكلوي. (أ) حمض شيف الدوري (PAS) ملطخة البارافين الأنسجة جزءا لا يتجزأ (5 أقسام رقيقة ميكرومتر) يظهر عدد قليل من الأنابيب مع التجويف فتح قليلا (عادة الأنابيب القريبة التي تمتلك فرشاة الحدود؛ انظر السهام). (B) يتم فتح جميع الأنابيب بعد التسريب الكلوي الجيد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استكشاف أخطاء وضع العلامات المناعية بالكامل. (ألف،باء) كانت شريحة الكلى سميكة ملطخة بجسم مضاد ضد cotransporter-2 كلوريد الصوديوم (NKCC2)، والذي يعبر عنه في الطرف الصاعد سميكة من حلقة هينل. يمكن الكشف عن الإشارة على سطح الأنسجة (الأسهم في (B)). ومع ذلك، لم يخترق الجسم المضاد الأنسجة [انظر رأس السهم في (B)]. (C) حقن الأجسام المضادة للأوعية الدموية التي تستهدف البروتينات المعبر عنها في الأوعية الدموية (على سبيل المثال، CD31) يسمح تلطيخ الأوعية الدموية بسرعة وتجانس. الهياكل المستديرة مع إشارة قوية هي الكلى. (د) ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات المعبر عنها في الغشاء الصدغي للظهارة الأنبوبية (على سبيل المثال، cotransporter كلوريد الصوديوم الفوسفوري (phospho-NCC) الذي يعبر في الأنابيب الملتوية البعيدة) لن تعبر الكبيبي حاجز الترشيح، مما تسبب في إشارات غير محددة في الأوعية الدموية (انظر رأس السهم مشيرا إلى arterioles afferent وغيرها من السفن) وglomeruli (انظر السهام). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لأنسجة الكلى التي تحمل علامة مناعية وأزيلت بصرياً. (ألف،باء) يسمح هذا البروتوكول بإزالة الكلى بأكملها بالبصرية. (C) ممثل z-المكدس لإظهار عدم وجود ربط غير محدد للجسم المضاد الثانوي كعنصر تحكم دون حضانة مسبقة. (D) 3-D التصور من z-المكدس ممثل يظهر انتشار بروموديوكسيريدين (BrdU)+ الخلايا في النخاع الكلى. (E) يتم تصور قنوات جمع Medullary باستخدام جسم مضاد ضد aquaporin-2 (AQP2). (واو،ز) تحليل وكمية BrdU+ الخلايا داخل AQP2+ قنوات جمع medullary. ل (F, G), انظر أيضا فيلم 2. وقد عُدل هذا الرقم من ساريتاس وآخرون29. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1 (ذات الصلة إلى الشكل3): التصور 3-D من NKCC2+الطرف التصاعدي سميكة من حلقة Henle. يظهر الفيلم ضعف اختراق الأجسام المضادة في شريحة الكلى مسح بصريا. الرجاء النقر هنا لتحميل الفيديو.

الفيلم 2 (ذات الصلة إلى الشكل4): التصور 3-D من BrdU+الخلايا وAQP2+القنواتجمع medullary في شريحة الكلى مسح بصريا. BrdU+ تظهر الخلايا (باللون الأحمر) وAQP2+ قنوات جمع medullary (باللون الأخضر). تم استخدام خوارزميات بقعة وسطح Imaris لتحديد BrdU+ الخلايا خارج (البقع الفيروزية) أو داخل (البقع الوردية) AQP2+الأنابيب (الأسطح الخضراء). هذا الفيلم ظهرت أصلا في ساريتاس وآخرون. 29. يرجى النقر هنا لتحميل الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد حظيت تقنيات التطهير البصري باهتمام واسع النطاق للتصور ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للتشريح المجهري في مختلف الأجهزة. هنا، تم الجمع بين طريقة المقاصة القائمة على المذيبات (ECi) مع وضع العلامات المناعية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنابيب الكاملة في شرائح الكلى. هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة وسريعة. ومع ذلك، يمكن الإجابة على أسئلة البحوث الأخرى على أفضل وجه مع بروتوكولات المقاصة الأخرى5. من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن الأساليب القائمة على المذيبات تسبب انكماش الأنسجة في درجات متغيرة، ويرجع ذلك أساسا إلى الجفاف الخطوة14،18. معظم الأساليب القائمة على المذيبات (على سبيل المثال، ECi14)أيضا على الأقل جزئيا تبريد الفلورة الذاتية للصحفيين مثل GFP أو tdTomato؛ وبالتالي، FDISCO32،الوضوح12،أومكعب 11 قد تكون بمثابة بروتوكولات بديلة. ومع ذلك، فإن تأثير التبريد من ECi متغير ويعتمد على المنشآت الفردية لكل فأر مراسل28. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام 1) جسم مضاد فلورسنت ضد GFP وصحفيين آخرين أو 2) البروتوكولات المعدلة القائمة على المذيبات التي تحافظ على إشارات الفلورة الذاتية30،32 يمكن أيضا أن يكون نهجا بديلا في هذا السياق. ومن الجدير بالذكر أن عدة مجموعات قد اختبرت توافق البروتوكولات المائية المستندةإلى 24،33،34 لتصور الحمض النووي الريبي في 3-D، في حين أن أساليب المقاصة القائمة على المذيبات لم يتم اختبارها بعد. وبالتالي، ينبغي تفضيل أساليب المقاصة المائية مثل النسخة المعدلة من CLARITY33 عند النظر في تحليل الحمض النووي الريبي.

يمكن تصور الخلايا أو المنتجات الجينية ذات الأهمية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير عن البروتين الفلورسنت الذاتية، ولكن توليد خطوط الماوس المهندسة وراثيا هو مضيعة للوقت ومكلفة. لذلك، وضع العلامات الأجسام المضادة هو أكثر عملية ويوفر المزيد من المرونة، على الرغم من أن وضع العلامات المناعية للأنسجة الكبيرة هو التحدي. على النقيض من بروتوكول ECi الأصلي14، نهجنا يجمع بين طريقة تطهير بصري ECi المعدلة ووسم المناعة ، والذي يستخدم خطوة مستضد الاسترجاع. سوف الاسترجاع المستحث بالحرارة تشويه البروتينات، ولكن يساعد على استعادة فقدان مضادات الجينات خلال PFA-تثبيت35 ويحسن الأجسام المضادة ملزمة.

هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا، من المهم إجراء التسريب الجيد للكلية. الهيموغلوبين الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء يحد من عمق التصوير7 والأنابيب الموسعة مع التجويف المفتوح تعزيز اختراق الأجسام المضادة. افتتاح الأنابيب يسمح أيضا أفضل التمييز بين البروتينات المعبر عنها في الغشاء الأوبي الظهاري من البروتينات الأخرى التي أعرب عنها apically على الجانب المنافي. ومع ذلك، قد تؤثر الأنابيب الموسعة بشكل مصطنع سلبا على بنية الأنابيب وقناع استجابة باثوالفسيولوجية محددة من الكلى (على سبيل المثال توسيع الأنابيب القريبة المصابة،) ولكن ليس من الأنابيب الصحية36. ثانيا، حضانة الأجسام المضادة في 37 درجة مئوية بدلا من 4 درجة مئوية أو RT يحسن اختراق الأجسام المضادة27. ومع ذلك، كل الأجسام المضادة له خصائص فريدة; وبالتالي، فإن درجة الحرارة أثناء حضانة الأجسام المضادة تحتاج إلى تحسين للتحقيقات الفردية. ثالثا، استخدام اليكسا فلور-647 (الطيف الأحمر البعيد) الأجسام المضادة الثانوية يساعد على زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وخاصة منذ الكلى تنبعث منها كمية كبيرة من autofluorescence في الطيف الأزرق والأخضر37.

حقن المدار الرجعي14 أو التسريب من الكلى38 مع الأجسام المضادة الفلورية المترافقة ضد البروتينات المعبر عنها في الأوعية الدموية هو وسيلة أنيقة وسريعة لتسمية الأوعية الدموية الكلى. ومع ذلك، لا تزال البروتينات في الغشاء apical من الأنابيب لا يمكن الوصول إليها عن طريق الحقن داخل الأوعية الدموية منذ الأجسام المضادة لا يمكن عبور حاجز الترشيح الكبيبي مع وزنه الجزيئي قطع لترشيح البروتينات في نطاق 60-65 كيلودا. لذلك، فإن استخدام شظايا الأجسام المضادة الصغيرة والمتغيرات المهندسة مثل شظايا فاب (~ 55 كيلودا)، ديابودي (~ 50 كيلودا)، جنبا إلى جنب scFv (~ 28 كيلوDa) أو aptamers حمض نووي (~ 6-30 كيلودا) مع خصائص التعرف الجزيئي المحفوظة من الأجسام المضادة قد توفر فرصة للوصول إلى غشاء apical من الأنابيب38،39. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين شظايا الأجسام المضادة الصغيرة مع الحقول الكهربائية40 أو الضغط13 أو استخدام كبريتات الصوديوم dodecyl (SDS) القائم على بروتوكولات المقاصة لإزالة الدهون24،41،42 قد تمكن اختراق الأجسام المضادة بسرعة وكفاءة من الأنسجة.

أظهرت عدة مجموعات أن التسريب مع الكاشف المقاصة لا يقلل فقط من وقت البروتوكول، ولكن أيضا يزيد من شفافية الأنسجة19،24،43،44. لذلك ، ينبغي النظر في تعليب الشريان الأبهر البطني أو الشريان الكلوي مع التسريب اللاحق للكلية مع الحلول مطابقة مؤشر الجفاف والانكسار لتحقيق أفضل وأسرع إزالة الأنسجة. ومع ذلك، لم نكن يتغلغل الكلى بأكملها مع الكواشف تطهير واستخدام شرائح الكلى لعدة أسباب. أولاً، يمكن تصور المستضدات المختلفة عن طريق وضع علامات الأجسام المضادة لشرائح الكلى المتعددة من كلية واحدة. ثانيا، هناك حاجة إلى وقت أقل والأجسام المضادة لإجراء وضع العلامات المناعية لشريحة الكلى مقارنة مع الكلى بأكملها. ثالثاً، يؤدي التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات الكبيرة إلى إنشاء مجموعات بيانات تصل إلى عدة تيرابايت، والتي يمكن أن تكون صعبة في إدارة معظم محطات العمل. لذلك، البيانات من شرائح الأنسجة أو مجموعات فرعية من الملفات الكبيرة هي أكثر ملاءمة لتنفيذ عمليات معقدة مثل العد التلقائي أو قياسات المسافة.

في هذا البروتوكول، يتم استخدام الفحص المجهري البؤري لإجراء التصوير بدقة خلية واحدة، وهو أمر ذو صلة خاصة في دراسات التعريب المشترك. ومع ذلك، يتطلب التصوير البؤري المسح بالليزر، لأن سرعة التصوير الخاصة به عملية فقط لقطع صغيرة من الأنسجة التي تم تطهيرها. لإجراء تحليل مورفومتري ثلاثي الأبعاد للهياكل متعددة الخلايا مثل أجزاء الأنابيب الطويلة أو حتى الأجهزة الكاملة، من الضروري استخدام تقنيات المجهر الأسرع مثل المجاهر الفلورية للورقة الخفيفة (LSFM). تسمح LSFM بالتصوير السريع عندما لا تكون الدقة الخلوية الأعلى ضرورية. على سبيل المثال، تم تقييم أطوال الأنابيب الملتوية البعيدة مؤخرا من خلال الجمع بين وضع العلامات المناعية جبل كامل، والمقاصة البصرية على أساس الوضوح12،وLSFM29. لسوء الحظ، LSFM التجارية مكلفة وغير متوافقة دائما مع بروتوكولات المقاصة القائمة على المذيبات. في الواقع، تم اختيار الوضوح لهذه الدراسة، لأن LSFM لدينا خاصة مع هدف مخصص للوضوح لم يكن متوافقا مع ECi29. ومع ذلك، أظهر كلينغبيرغ وآخرون أن ECi متوافق من حيث المبدأ مع LSFM14.

وفي الختام، يتم إثبات طريقة بسيطة للتطهير البصري تستند إلى ECi، والتي يمكن تطبيقها على أي مشروع بحثي باستخدام شرائح الأنسجة الثابتة التي تتراوح بين ~100 درجة مئوية إلى عدة ملليمترات في سمكها. كما أنه يتيح إجراء تحليلات مجدية كانت تتطلب في السابق جهودا ً شبه شاملة لاستكمالها، ويلغي الافتراضات والاستنتاجات المطلوبة المرتبطة بالتحليل الثنائي الأبعاد للمورفولوجيا. مزيج من وضع العلامات المناعية جبل كامل، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوء المتقدم سيساعد على تعزيز فهم وظيفة الخلوية في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

T. S. بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية DFG (332853055)، آخر Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197)، وكلية الطب في RWTH آخن (RWTH برنامج العائدين). V. G. P. بدعم من زمالات بحثية من دويتشه جيسيلشافت فور كلورولوجي، ومؤسسة ألكسندر فون هومبولدت، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا. D. H. E بدعم من مؤسسة LeDucq. ويتلقى ر. ك. الدعم من المنح المقدمة من وزارة المالية (KR-4073/3-1 وSCHN1188/5-1 وSFB/TRR57 وSFB/TRR219) وولاية نورثراينويستفاليا (MIWF-NRW) والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية في جامعة RWTH Aachen (O3-11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 G butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 mL plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
Curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
Dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
Hemostat Agnthos 312-471-140
Horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508, (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17, (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10, (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369, (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26, (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18, (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7, (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10, (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28, (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70, (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5, (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25, (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95, (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143, (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8, (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9, (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23, (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4, (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43, (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7, (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11, (5), e201700248 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics