マウスにおける右心室系と低酸素誘発性肺動脈高血圧に対する侵襲的血行力学的評価

Medicine

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Summary

ここでは、開胸手術アプローチを用いてマウスにおける右心室および肺動脈の侵襲的な形乱態評価を行うプロトコルを提示する。

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Luo, F., Wang, X., Luo, X., Li, B., Zhu, D., Sun, H., Tang, Y. Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice. J. Vis. Exp. (152), e60090, doi:10.3791/60090 (2019).

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Abstract

肺動脈性高血圧症(PAH)は慢性および重度の心肺疾患である。マウスは、この病気を模倣するために使用される一般的な動物モデルです。しかしながら、右心室圧(RVP)および肺動脈圧(PAP)の評価は、マウスにおいて技術的に困難なままである。RVPとPAPは、左右の心臓系の解剖学的な違いのために、左心室圧よりも測定が困難である。本論文では、健康マウスとPAHマウスを用いた安定した右心馬力測定法とその検証について述べた。この方法は、胸部開胸手術と機械的換気サポートに基づいています。それは閉じた胸のプロシージャと比較して複雑なプロシージャである。この手術には十分な訓練を受けた外科医が必要であるが、この手順の利点は、RVPとPAPパラメータの両方を同時に生成することができるので、PAHモデルの評価のための好ましい手順である。

Introduction

肺動脈性高血圧症(PAH)は、小さな肺動脈の細胞増殖および線維化によって引き起こされる肺動脈圧(PAP)および右心室圧(RVP)の上昇を伴う慢性および重度の心肺疾患である1.肺動脈カテーテルは、スワンガンツカテーテル2とも呼ばれ、RVPおよびPAPの臨床モニタリングで一般的に使用されている。さらに、無線PAP監視システムは、臨床的に3、4、5を使用されている。マウスの研究のための疾患を模倣するために、PAH6のヒト臨床症状をシミュレートするために低酸素環境が使用される。動物におけるPAPの評価では、大型動物はヒト被験者と同じ技術を用いて肺動脈カテーテルを介して比較的監視が容易であるが、ラットやマウスなどの小動物は体の大きさが小さいため評価が難しい。マウスにおける右心室系の運動力学的測定は、超小型サイズ1Frカテーテル7で可能である。マウスにおけるRVPおよびPAPを測定する方法は文献8、9で報告されているが、その方法論は詳細な説明を欠いている。RVPとPAPは、左右の心臓システムの解剖学的な違いのために、左心室圧よりも測定するのが難しいです。

同じマウスでPAPとRVPの両方のパラメータを取得するために、右心の快進測定のための開胸手術ベースのアプローチ、健康なPAHマウスとの検証、複雑な開胸中に人工データを生成しないようにする方法について説明します。手術。この技術は、十分に訓練された外科医によって行われるのが最善であるが、それは同じマウスでPAPおよびRVPを評価することができるという利点がある。

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Protocol

動物プロトコルは、北京ユニオン医科大学、フワイ病院、中国医学アカデミー(NO.0000287)の制度的動物ケアと使用委員会によって審査され、承認されました。実験動物は、中国の動物福祉のガイドラインに従って収容され、供給されました。

注:8~12週齢の雄C57BLマウスは、12時間暗い/12時間の光サイクルを有する環境に収容された。PAHマウスを酸素濃度10%の下で4週間収容し、肺高血圧を誘発するために酸素制御低酸素室によって維持され、対照マウスを同一の条件下で室内空気(21%酸素)に収容した。RVPおよびPAP測定は、低酸素チャレンジの4週間の終わりに行った。

1. 術前準備

  1. 圧力トランスデューサカテーテル(サイズ:1Fr)を、血行力学実験の前に少なくとも30分間室温で0.9%生理食合いで浸漬します。
  2. フィルター2,2,2-トリブロモエタノール溶液を0.22μmフィルターで、4度冷蔵庫に保存します。
  3. 手術用手袋などの清掃された手術ツールや消耗品を準備します。
  4. カテーテル洗浄用消化酵素溶液10mLを10mL調製します。
  5. 圧力トランスデューサカテーテルを圧力ボリュームシステムに接続します。
  6. 各マウスの圧力測定を取得する前に、圧力トランスデューサを校正します。
    1. キャリブレーションノブを0 mmHgおよび25 mmHgにして、検証圧力信号をデータ集録ソフトウェアに送信し、ソフトウェアのキャリブレーション設定を設定します。
    2. ノブをトランスデューサに回し、バランスノブをベースラインゼロに調整します。
  7. 標準的なステレオ顕微鏡および外科の間の体温維持のための温度制御された小さい動物の外科テーブルを置く。
  8. 外科区域に十分な光を与えるためにマイクロサージャリーのための光の照明システムを設定する。

2. 胸部開胸手術とヘモ力学測定

  1. 腹腔内注射(i.p.)を介して2,2,2-トリブロモエタノールの250 mg/kgのマウスを麻酔する。必要に応じて、手順中に元の用量の1/3〜1/2で補足用量を繰り返します。
  2. 剃毛器と脱毛ローションを使用して胸と首の毛皮を取り除きます(図1 A、2A)。
  3. 手術中の体温(37°C)を維持するために、温度制御された小動物手術台の上のスフィンの位置に各マウスを固定します。
  4. 70%のエタナルで手術部位をきれいにします。
  5. 麻酔が効いたら、つま先ピンチを用いて十分な麻酔誘導を確認する。
  6. 首の皮膚に中線切開を行います(図1A)。
  7. 湾曲した鉗子を使用して骨格筋を解剖し、気管を露出させる(図1B,1C)。
  8. 修飾された22G静脈内鞘カテーテルを使用して口から挿管を行う。鉗子を使用してチューブが気管内にあることを確認します(図1D)。
  9. チューブを小さな動物用換気装置に接続します。人工呼吸器の取扱説明書10に従って、体重に基づいて呼吸数と潮位を計算して設定する。たとえば、説明した計算に基づいて、30 g マウスの呼吸数を 133/分、潮位量を 180 μL に設定します。
  10. テープを使用して換気のためのチューブを確保します。
  11. つま先ピンチを使用して適切な麻酔誘導を確認します。
  12. 胸の皮膚に中線切開を行い、焼灼ツールを使用して胸筋を慎重に解剖する(図2B,2C)。
  13. 中央にはさみを使って胸骨を切り、胸腔を露出させる(図2D)。
  14. 胸を開いた手術の間に焼灼器を使用して出血を防ぐ。
  15. 右心室をリトラクタで露出する (図 2E)。
  16. 生理線浸漬圧力トランスデューサカテーテルを25G針で作られた小さなトンネルを右心室に挿入し、RVPを測定します(図2Fおよび図3A,3C)。
  17. カテーテルケーブルを持ち、肺動脈と同軸的な方法で肺動脈弁を横切る。圧力波形を観察し、安定したPAP信号を得る(図3B、3D)。
  18. データ取得システムとソフトウェアを使用して、hemodynamicデータを記録します。
  19. 最終測定の後、2,2,2-トリブロモエタノール溶液の過剰投与量のi.p.注射を介してヒトにマウスを安楽死させる。
  20. 慎重に右の心臓システムからカテーテルを取り除き、1%の消化酵素溶液を含む1 mLシリンジに入れます。
  21. 蒸留水を使用してカテーテルを慎重に洗い流し、元の箱に保管してください。

3. ヘモダイナミクスのデータ解析

注:ヘモダイナミックデータは、解析ソフトウェア11(材料表)を使用して記録され、分析されました。

  1. マウスごとに、ノイズのない少なくとも 10 個の連続した安定したハートビート サイクルを選択して、各パラメータの RVP または PAP データの平均データを取得します。
  2. Studentのt検定を使用して、通常の空気制御群と低酸素群を比較します。注: p < 0.05 は統計的に有意と見なされました。データは平均±SDとして提示される。

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Representative Results

圧力トランスデューサカテーテルを25G針で膨張したトンネルを介して右心室(図3A)に挿入し、典型的なRVP波形(図3C)を得た。カテーテルは絶えず調節され、ゆっくりと進み、肺動脈を通過しながら肺動脈と同じ軸に保たれた(図3B)。圧力センサが肺動脈に正常に挿入されると、特徴的な二分不調を有する典型的なPAP波形が現れた(図3D)。人工データの生成を避けるために、波形にノイズが発生したのか(図4)、カテーテルのゼロレベルがドリフトしたのかを観察しました(図5)。この場合、補正が行われ、ノイズのあるセグメントはデータ分析から除外されました。

PAHは、PAPおよびRVPにおける持続的な上昇によって特徴付され、小さな肺動脈における抵抗性の増加によって引き起こされる。PAHは、安静時に≥25mmHgの平均PAPによって定義され、診療所12における右心カテーテル法の間に測定される。誘導された慢性低酸素症(4週間酸素10%に保たれる)または対照群(通常の空気中に保持)を有するマウスのRVPおよびPAPを測定した。結果を図 6に示します。正常な空気制御群の場合と比較して、収縮期PAP (図6A)、拡張期PAP(図6B)、平均PAP(図6C)、および右心室収縮期圧(図6D)慢性低酸素群では全て有意に増加した。研究者はまた、低酸素単独と比較して、マウスにおいて重症PAHを誘導する3週間の慢性低酸素症を有するVEGFR阻害剤の組み合わせがRVP13、18を有意に増加させることができると報告している。

Figure 1
図1:マウスの機械的換気支援のための挿管(A)首の毛皮を脱毛ローションを用いて除去し、手術用のクリーンな領域を得る。頸部の皮膚に中線切開がなされる。(B) 気管を覆う骨格筋が露出する。(C) 骨格筋は気管を露出させるために露骨に解剖される。黄色の矢印は気管を示します。(D)チューブ(22G静脈内カテーテルを使用して改変)を気道に挿入し、鉗子を用いて配置を確認する。黄色の矢印は気管内のチューブを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2: 右心室での血行力学測定のための胸部開胸手術( A)脱毛ローションを用いて胸毛を除去し、手術用のクリーンな領域を得る。(B) 胸筋と胸骨を露出させる中線切開が行われる。(C) 胸部開口部の出血を最小限に抑えるために焼灼ツールを使用する(矢印は焼灼先端を示す)。(D) 胸骨は中間線(黄色の破線)に沿って切断されます。(E)心臓を露出させるために2つのレトラクターが使用される(上矢印は右心房壁を示し、下矢印は右心室自由壁を示す)。(F)圧力トランスデューサカテーテル(下矢印)を穿刺ツール(25Gサイズ針、上矢印)を用いて右心室室に挿入し、右心室自由壁に小さなトンネルを作製する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:代表的なRVPおよびPAP曲線圧力トランスデューサカテーテルを右心室(A)に挿入し、RVP波形(C)を得る。圧力トランスデューサカテーテルは肺動脈弁を通過し、肺動脈(B)にとどまるとPAP波形を生成する。矢印は、肺動脈弁閉鎖の徴候であるPAP波形(D)上の特徴的な二分の一を示す。RA =右心房,RV=右心室,PA=肺動脈,LV=左心室。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:圧力センサ表面を心室壁に触れることによるRVP波形ノイズ。矢印点は、RVPカーブ(上側チャネル)の圧力の急激な増加を示し、同時にdP/dt(下側チャネル)の人工的な変化を生成します。dP/dt は RVP から計算されます。破線は dP/dt ノイズを示します。騒音が常に存在する場合は、心室のカテーテルセンサーの位置を調整すると、騒音を防ぐことができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:RVP測定時の圧力トランスデューサのドリフトゼロ左側のウィンドウには、人工的にわずかに上昇したエンドジアストリック RVP が表示されます。右側の展開ウィンドウには、エンド拡張 RVP の増加が表示されます (矢印はエンド拡張 RVP を示します)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:C57BLマウスにおける低酸素誘発肺動脈高血圧症(A)収縮期PAP(sPAP)。(B) 拡張期 PAP (dPAP)(C) 平均 PAP (mPAP) を意味します。(D) 右心室収縮期圧 (RVSP).(E) および (F) は、それぞれ制御および PAH マウスの代表的な PAP 波形 *p < 0.05;学生のt-テスト;制御グループ n = 10;低酸素群n = 3。データは、平均±SD.PAP=肺動脈圧、RVP=右心室圧として提示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

気管挿管は、胸部開胸手術の最初の重要なステップです。ラットやマウスなどの小動物の気管挿管の古典的な方法は、気管にT字型の切開を行い、気管にY型気管チューブを直接挿入することを含む。実際には、この方法は操作中に簡単ではないことがわかります。Y型気管チューブは小動物には大きすぎて気管と角度を形成します。したがって、チューブを所定の場所に固定することは困難である。さらに、開胸手術中に誤って気道から挿管チューブが出ると、通常は機械的換気サポートが失われたために動物死に至る。そこで、皮膚に切開を行い、気管を露出させる筋肉層を分離して気管内挿管14の方法を改変し(図1C)、気管チューブを気道に直接挿入して、動物の口。気管内チューブの配置は、鉗子を使用して気管をクランプすることによって便利に確認することができる(図1D)。ガイド針を取り外し、シースカテーテルのみを使用した後、22Gの静脈内カテーテルが挿管チューブとして使用される。管は挿管の後に容易にしっかり固定することができる。これは、手術中の挿管を管理するための安全な方法であり、小動物の胸部手術の成功率を大幅に向上させることができます。ただし、この方法ではトレーニングと練習が必要です。

右心経流体測定のための胸部閉鎖アプローチは、詳細15、16に記載されている。閉胸法の1つの制限は、カテーテルがマウスの肺動脈にアクセスできないため、RVPのみを評価するために使用することができるということです。右心室の自由壁が位置する中線胸部切開を胸骨のすぐ下に使用します(図2D)。右心室カテーテル法を行ってRVPを得た後、肺動脈と同軸的な方法でカテーテルを挿入してPAPを得ることが容易である(図2E)。胸部開胸手術中に胸骨を切断すると、血液喪失による人工血圧低下を防ぐために、胸部切除部出血を避けるために電気凝固ツールが使用されます(図2C)。この開胸手術では、P-Vループカテーテルを使用してRVPとボリューム情報17の両方を取得することは任意です。ただし、サイズが大きいため、PAP の取得には使用しないことをお勧めします。この方法は、十分に訓練された外科医によって行われるのが最善であるが、それは動物の死を避けるために開胸手術中の気管挿管の維持および出血の予防を可能にするので、閉胸アプローチよりも好ましい。

さらに、右心室自由壁は、心室へのカテーテルの挿入中の抵抗を減らすために25Gまたはより小さい針で穿刺される。カテーテル法の間、圧力センサー表面は鋭い金属表面によってカテーテルセンサーへの偶発的な損傷を防ぐために針のベベルから逸脱してはならない。通常、さらなる出血を引き起こすため、大きな針を使用して心室の自由壁を穿刺しないことが好ましく、循環中の血液量が不足すると人工圧力データも引き起こす。

マウスの心室の体積が小さく、右心室の不規則な大きさのため、カテーテルの圧力センサは、高い心拍数の間に右心室自由壁に容易に触れる。これは心室圧力の分析に直接影響する心室圧力曲線(図4)に騒音を発生させる。この場合、カテーテルの角度と深さは、ノイズが消えるまで調整して、滑らかな心室圧力波形を再び得る必要があります。

1 Fr圧力トランスデューサカテーテル7の小さいサイズは非常に精密で、正確な圧力トランスデューサーを作る。ゼロドリフトは、一般に、カテーテルに欠陥があるか損傷を受けていない限り、インビトロでの生理行溶液の標準的なカテーテル試験中には経験されない。しかし、体血の存在下では、圧力センサ表面に付着した血液成分が、生体内実験中にカテーテルがゼロドリフトを受ける可能性がある(図5)。この問題に対処するために、私たちは次の手順を行います:心室からカテーテルを一時的に取り出し、カテーテルのセンサー先端を暖かい1.0%の消化酵素溶液に入れられます。センサー表面に取り付けられた血液成分を消化するためにそれをインキュベート;そして、生理線浸しガーゼでカテーテルを穏やかに拭いた後、カテーテルを心室に戻し、安定した、ゼロではない心室圧波形を得る。

安定したデータを得るためには、圧力トランスデューサカテーテルの調製も不可欠です。カテーテルの圧力センサ先端は、カテーテルの安定性を維持するために、生体内処置の前に室温で0.9%の生理行で少なくとも30分間浸漬されなければならない。このようにして、圧力トランスデューサカテーテルの電気的特性を最適に安定化させることができる。

最後に、低酸素症期間は、マウス6、14、17、18における低酸素誘発高血圧モデルにして3〜4週間生存可能である。我々のデータは、低酸素症の4週間がC57BLマウスにおいて安定な肺高血圧モデルを誘導できることを示し、PAPおよびRVPレベルは文献に匹敵する。マウスが異なる低酸素プロトコルのノルモキシカル条件に戻された場合に、PAHモデルを維持できる期間に対処するために、さらなる研究が必要である。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

本研究は、北京連合医科大学大学院教育教育教育教育教育改革プロジェクト(10023-2016-002-03)、不和病院青少年基金(2018-F09)、北京前臨床研究の鍵研究室長と心臓血管インプラント材料の評価 (2018-PT2-ZR05).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G For anesthesia
Animal temperature controller Physitemp Instruments, Inc. TCAT-2LV For temperature control
Dissection forceps Fine Science Tools, Inc. 11274-20 For surgery
Gemini Cautery System Gemini GEM 5917 For surgery
Intravenous catheter (22G) BD angiocath 381123 For intubation
LabChart 7.3 ADInstruments For data analysis
Light illumination system Olympus For surgery
Mikro-Tip catheter Millar Instruments, Houston, TX SPR-1000 For pressure measurement
Millar Pressure-Volume Systems Millar Instruments, Houston, TX MVPS-300 For pressure measurement
O2 Controller and Hypoxia chamber Biospherix ProOx 110 For chronic hypoxia
PowerLab Data Acquisition System ADInstruments PowerLab 16/30 For data recording
Scissors Fine Science Tools, Inc. 14084-08 For surgery
Small animal ventilator Harvard Apparatus Mini-Vent 845 For surgery
Stereomicroscope Olympus SZ61 For surgery
Surgery tape 3M For surgery
Terg-a-zyme enzyme Sigma-Aldrich Z273287-1EA For catheter cleaning

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References

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