超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

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Summary

免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。ここでは、研究設定で広く使用できるように、この実験方法の紹介です。

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Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

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Abstract

グリコミックスは、疾患感受性、創薬、精密医療のための次世代バイオマーカーの発見に大きな可能性を秘めた、オミックスシステム研究の新しいサブスペシャリティです。代替IgG N-グリカンは、いくつかの一般的な慢性疾患で報告されており、臨床応用に大きな可能性を有することが示唆されている(すなわち、疾患の診断および予測のためのバイオマーカー)。IgG N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)の方法を用いて広く特徴付けられている。UPLCは、再現性と高い相対定量精度を備えた安定した検出技術です。さらに、IgG N-グリカンの構造が明確に分離され、血漿中のグリカン組成と相対的な存在量が特徴です。

Introduction

ヒトタンパク質のN-グリコシル化は、一般的かつ必須の翻訳後修飾1であり、比較的正確に疾患の発生および発症を予測するのに役立ち得る。その構造の複雑さのために、5,000以上のグリカン構造があり、疾患の診断および予測バイオマーカーとして大きな可能性を提供することが期待される2.免疫グロブリンG(IgG)に結合したN−グリカンは、IgGの機能に必須であることが示されており、IgG N-グリコシル化は、プロおよび抗炎症系3との間のバランスに関与する。微分IgG N-グリコシル化は、疾患の発症および進行に関与し、疾患病理に関与する素因および機能機構の両方を表す。IgG N-グリコシル化の炎症役割は、老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌4に関連している。

検出技術の開発に伴い、 以下の方法は、高スループットグリコミクスで最も広く使用されています:蛍光性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC-FLR)、レーザー誘導蛍光検出による多重キャピラリーゲル電気泳動 (xCGE-LIF)、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化時間質量分析(MALDI-TOF-MS)、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法(LC-ESI-MS).これらの方法は、低フラックス、不安定な結果、および低感度特異性の以前の欠点を克服しています5,6.

UPLCは、IgG N-グリコシル化と特定の疾患(すなわち、老化7、肥満8、脂質異常症9、II型糖尿病10、高血圧11、虚血性脳卒中12、およびパーキンソン病13)との関連を探索するために広く使用されている。上記の他の3つの方法と比較して、UPLCは以下の利点を有する5、14である。まず、相対的な定量分析方法を提供し、総面積正規化を伴うデータ分析により、各サンプルの比較性が向上します。第二に、機器のコストと必要な専門知識は比較的低いため、グリコシル化バイオマーカーの実装と臨床応用への変換が容易になります。ここでは UPLC の概要を紹介します。

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Protocol

議定書に含まれるすべての科目は、首都医科大学、北京、中国12の倫理委員会によって承認されています。書面によるインフォームド・コンセントは、研究の開始時に各被験者から得られた。

1. IgGの分離

  1. 結合緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS):1x PBS(pH=7.4)、中和緩衝液:10x PBS(pH=6.6-6.8)、溶離剤:0.1Mギ酸(pH=2.5)、溶離液中和溶液:1M炭酸アンモニウム、貯蔵緩衝液を含む化学物質を調製する: 20%エタノール + 20 mM トリス + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), タンパク質 G: 0.1 M NaOH + 30% プロパン-2-オールのための洗浄液.
    注: このプロトコルでは、pH のレベルが重要です。IgGの溶出は非常に低いpHを必要とし、酸加水分解によるシアル酸の損失の危険性がある。したがって、溶出は数秒以内に発生し、pHは急速に中性に回復し、IgGおよびシアル酸の完全性を維持する。
  2. サンプルを準備する:冷凍プラズマサンプルを解凍し、80 x gで10分間遠心分離し、タンパク質Gモノリシックプレートと上記の化学物質を室温で30分間残します(RT)。
  3. 100 μL サンプル (最初の故障を防ぐために 2x を検出するために使用できます) を 2 mL コレクション プレート (ここでは、合計 6 つの標準サンプル、1 つの制御サンプル [超純水]、および 89 個のプラズマ サンプルを 96 ウェル プレート用に設計し、ランダムに割り当てられました)をプレートに)
  4. サンプルを 1x PBS で 1:7 (v/v) 希釈します。
  5. 超純水200μL(繰り返し2倍)で0.45μmの親水性ポリプロピレン(GHP)フィルタープレートを洗浄します。
  6. 希釈したサンプルをフィルタープレートに移し、真空ポンプ(266.6-399.9 Paで真空圧を制御)を使用して回収プレートにサンプルを濾過します。
  7. タンパク質Gモノリシックプレートの調製
    1. ストレージ バッファを破棄します。
    2. 超純水2mL、1x PBSの2mL、0.1 Mギ酸の1mL、10x PBSの2 mL、1x PBSの2 mL(順次)でモノリシックプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
  8. 濾過したサンプルをIgG結合および洗浄用のタンパク質Gモノリシックプレートに移し、次いで1x PBSの2mLでモノリシックプレートを洗浄します(クリーニング2xを繰り返します)。
  9. 1 mLの0.1 Mギ酸でIgGを溶出し、真空ポンプで回収プレートにサンプルを濾過し、170μLの1M重炭酸アンモニウムを回収プレートに加えます。
  10. 吸収分光光度計(最適波長=280nm)を用いてIgG濃度を検出する。
    1. ソフトウェアを開き、タンパク質CY3モードを選択します。
    2. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします(1xを繰り返します)。
    3. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアのサンプルをクリックして超純水を検出します。
    4. IgGサンプルを2μL引き出して画面にロードし、ソフトウェアの「サンプル」をクリックしてサンプルを検出します。
    5. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします。
    6. ソフトウェアを閉じます。
      注: IgG 濃度を計算する式は次のとおりです。

      CIgG = 吸光度 x 消滅係数 (13.7) x 1,000 μg/mL
  11. 抽出したIgGを60°Cのオーブンで乾燥させ、抽出したIgG(300μL抽出IgGを4時間抽出)に保存します。
    1. 濃度が1,000μg/mLを超える場合は、抽出されたIgGを300μL除去します。
    2. 濃度が500~1,000μg/mLの場合は、抽出したIgGを350μL取り除く。
    3. 濃度が200~500μg/mLの場合は、抽出したIgGを400μL取り除く。
    4. 濃度が200μg/mLより小さい場合は、抽出されたIgGの600 μLを除去します。
      注:IgGの濃度は、後続の検出のために>200 μg/mLであることが好ましいはずです。IgGの平均量は、最初のテストが失敗した場合に2倍にテストすることができる>1,200 μgであることが好ましいはずです。
  12. 再利用のためのタンパク質Gモノリシックプレートの洗浄
    1. 2mLの超純水、1mLの0.1 M NaOH(沈殿タンパク質を除去する場合)、4mLの超純水、1x PBS(順次)でプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
    2. 超純水2mL、30%プロパン-2-オール(結合疎水タンパク質を除去する場合)の2mL、超純水2mL、1x PBS(順次)の4mLでプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
    3. 1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) でプレートを洗浄し、1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) をプレートに追加し、プレートを 4 °C のままにします。

2. グリカンリリース

  1. 乾燥したIgGを準備し、1.33%SDS、4%イゲパル(光から離れて保存)、およびRTで5x PBSを含む化学物質を保存します。
  2. 250 ΜLの超純水で250U酵素を希釈してPNGase F酵素を調製します。
  3. IgGの変性
    1. 30°Lの1.33%SDSを加え、ボルテックスで混ぜ、サンプルを65°Cのオーブンに10分間移し、オーブンから取り出して15分間休ませます。
    2. 4%イゲパルの10 μLを加え、5分間振るインキュベーターの上に置きます。
  4. グリカンの除去と放出
    1. 5x PBSの20 μLと0.1モル/L NaOHの30-35 μLを加え、8.0のpHを調節し、ボルテックスで混合します。PNGase F酵素を4μL加え、ボルテックスで混ぜます。次いで、37°水浴中で18〜20時間インキュベートする。
    2. 放出したグリカンを60°Cのオーブンで2.5~3.0時間乾燥させます。
    3. さらに測定するまで、放出されたグリカンを-80°Cで保存します。
      注: この手順は重要です。グリカン放出の鍵は、その効率を最大化するためにPNGase F酵素の活性を改善することです。

3. グリカンの表示と精製

  1. 2-アミノベンズアミド(2-AB)標識試薬を0.70mgの2-AB、10.50μLの酢酸、6mgのシアノボロ水素ナトリウム(NaBH3CN)、24.50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)(総体積=35μL)で調製します。次に、酢酸、2-AB、および NaBH3CN を DMSO に順番に追加します。
  2. 2-AB標識試薬の35μLを使用してグリカンにラベルを付け、標識されたグリカンを5分間発振器に移し、65°Cで3時間オーブンに移し、30分間RTに移す。
    注: グリカンラベリングステップ全体を光から保護しながら実行する必要があります。
  3. 0.2μm GHPフィルタープレートを200°Lのエタノール700°L、200°Lの超純水、200μLの96%アセトニトリル(4°)で除去し、真空ポンプを使用して廃棄物を除去します。
  4. 2-AB標識グリカンの精製
    1. 2-AB標識グリカンに100%アセトニトリルの700 μLを加え、5分間振とうインキュベーターに移します。
    2. 134 x g での遠心分離5 分間 (4 °C)。
    3. サンプルを0.2μm GHPフィルタープレートに2分間移し、真空ポンプを使用して濾液(流動液体)を除去します。
  5. 2-AB標識グリカンを96%アセトニトリル(4°)の200°Lで洗浄し、真空ポンプ5x-6xを使用して濾液(流動液体)を除去します。
  6. 超純水3xの100°Lで2-ABラベルグリカンをエルテ。
  7. 2-AB標識グリカンをオーブンに移し、60°Cで3.5時間乾燥させます。
  8. さらに測定するまで、ラベル付けされたN-グリカンを-80°Cに保存します。

4. 水酸相互作用クロマトグラフィーとグリカンの分析

  1. UPLC機器のコンディショニングと移動相の準備
    1. 溶媒A:100 mMアンモニウムギ酸(pH=4.4)、溶媒B:100%アセトニトリル、溶媒C:90%超純水(10%メタノール)、および溶媒D:50%メタノール(超純水)を含む移動相を調製する。
    2. モバイルフェーズを制御するソフトウェアを開きます。
    3. 流量0.2mL/分(50%溶剤Bおよび50%溶媒C)で30分間のバランスをとり、流量0.2mL/分(25%の溶媒Aおよび75%の溶媒B)で20分間バランスをとり、次いで流量0.4 mL/分のバランスをとります。
  2. 標識したN-グリカンを100%アセトニトリルと超純水の混合物の25°Lで2:1の比率(v/v)で溶解します。次いで、134×gで5分間(4°)で遠心分離機を行い、標識されたN-グリカンの10μLをUPLC機器にロードする。
  3. 標識されたN-グリカンを流量0.4mL/分で、75%~62%のアセトニトリルの直線勾配で25分間分離します。次いで、60°CのUPLC上でデキストランキャリブレーションラダー/糖ペプチドカラムによる分析実行を行う(ここでは、サンプルを注射前に4°Cに保った)。
  4. 330 nmおよび420 nmの励起および発光波の長さでN-グリカン蛍光をそれぞれ検出する。
  5. ピーク位置と保持時間に基づいてグリカンを統合します。
  6. 各グリカンピーク(GP)/すべてのグリカンピーク(GP)(パーセンテージ、%)次のように: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GPs*100 など

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Representative Results

図1に示すように、IgG N-グリカンはピーク位置と保持時間に基づいて24個の初期IgGグリカンピーク(GP)に分析した。N-グリカン構造は、以前の研究(表1)15に従った質量分析検出を通じて利用可能である。結果が同等であることを確認するために、各ピークのグリカン量を総集積面積に対するパーセンテージで表した総面積正規化が適用された。

この方法の再現性および安定性を評価するために、標準試料を6回並行して試験した。表2に示すように、24 GPの変動係数(CV)は1.84%-16.73%、15(62.50%)そのうち10%を下回った。比率が比較的小さい GP (≤1.16%)高い測定誤差(CVの10%以上)を示した。さらに、76個体から組み合わせたIgG N-グリカンプロファイル(図2)は、GPの位置が安定し、GPの形状が類似しており、サンプルの統合が同じ間隔を維持したことを示した。上記の結果は、この方法が安定しており、繰り返し可能であることを示しています。

表3に示すように、ガラクトシル化、シアリ化、二分GlcNAc、およびコアフコシル化の相対的な豊富さを記述する追加の36の導出形質を、残りの24個の直接測定グリカンによって計算した。例えば、G2/G0(GP12/GP2)は、コアフコシル化および二分GlcNAcを含まないガラクトシル化(di-/a-)のレベルを反映した。G2/G1(GP14/[GP8 + GP9])は、コアフコシル化とGlcNAcの二分を伴わないガラクトシル化(di-/モノラル)のレベルを反映しました。最後に、G1/G0([GP10 + GP11]/GP6)は、コアフコシル化と二分GlcNAcを有するガラクトシル化(モノ/a-)のレベルを反映しました。導出グリカンのこれらの計算は、1つのグリコシル化特性の変化を見るために、原理に従う。

Figure 1
図1:1人の個体のUPLCクロマトグラム。IgG N-グリカンをピーク位置と保持時間に基づいて24個の初期IgGグリカンピーク(GP)に分析した。GP8はGP8aとGP 8bの合計を表す。GP16はGP16aとGP16bの和を表す。各クロマトグラフィーピークにおけるグリカンの構造と個々の構造の平均パーセンテージを表1および表2に示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:76個体のUPLCクロマトグラム。IgG N-グリカンプロファイルを76個体から組み合わせて、この方法の再現性および安定性を実証した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Table 1
表1:24個の初期IgGグリカンの構造GP:グリカンピーク;F: フコース;A:コアシーケンスに取り付けられたアンテナの数(2つのNアセチルグルコサミン(GlcNAc)と3つのマンノース残基の存在)B: 二分 GlcNac;G: ガラクトース;S:シアル酸。構造スキームは次のように定義されます: 青い正方形: GlcNac;緑の円:マンノース;赤い三角形:コアフコース/アンテナフコース;黄色の円: ガラクトース;紫色の菱形:シアル酸。

グリカンピーク 平均 (SD) CV (%) グリカンピーク 平均 (SD) CV (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
GP2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
Gp4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

表 2: メソッドの精度標準サンプルは、方法の再現性と安定性を評価するために6回並行してテストされます。CV: 変動係数;GP:グリカンピーク;SD: 標準偏差。

導出グリカン 数式 導出グリカン 数式
ガラクトシル化 フコシル化
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8+ GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8+ GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10+ GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8+ GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10+ GP11)/GP6
シアリ化 ビセッキング・グランク
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10+GP11)/ (GP8+ GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

表3:派生グリカンの計算GP:グリカンピーク;F: フコース;B: 二分 GlcNac;G: ガラクトース;S:シアル酸。

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Discussion

UPLCは相対定量分析方法5、15として機能する。この結果は、UPLCが再現性と相対的な定量精度を備えた安定した検出技術であることを示しています。各ピークのグリカンの量は、UPLCを使用して総統合領域のパーセンテージとして表されます。相対定量は、試験サンプルの比較性を向上させます。さらに、96ウェルタンパク質Gプレートを使用して、一度に96サンプルでIgGを精製し、高スループット検出を行います。IgGに結合するタンパク質Gの能力は、タンパク質Aの能力よりも大きく、以前の研究15、16で説明したように。

また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。由来のIgGグリカンは、初期IgG N-グリカンによって計算されるガラクトシル化、シアリル化、二分GlcNAc、およびコアフコシル化のレベルを記述する。以前の研究では、いくつかの導出グリカン(FBn、FBG0n/G0 n、FBn / Fn/(Fn+FBn)、FBG2n / FG2n、FG2n / (BG2n + FBG2n))、BG2n/(FG2 n + FBG2n))の複数のグリコシル濃度の変化を反映することができ、特定のグリコシルレベルを反映しなかった。

最近、大規模な研究は、IgGガラクトシル化(Gal-ratioと呼ばれる)が複数の癌タイプ17における癌スクリーニングのための有望なバイオマーカーとして機能できることを示した。IgGガラクトシル化の分布は、アガラクトーシス化(G0)モノガラクトース化(G1)およびジガラキス化(G2)N-グリカンの相対強度を式(G0/[G1+ G2 x 2])に従って算出することによって測定される。 Gal比は、コアフコシル化とGlcNAcの二分を伴わないガラクトシル化のレベルを反映しています。したがって、複数の初期IgG N-グリカンを誘導グリカンと組み合わせ、特定のグリコシル化形質のレベルを表す。導出グリカンの計算は、他のグリコシル化形質に固定された1つのグリコシル化特性の変化のみを探求する原理に従います。

本プロトコルにおいて、pHはIgGおよびグリカン構造の安定性を維持するために、特に末端シアリル化を安定化するために重要である。したがって、溶液のpH値を厳密に制御する必要があり、IgGに曝露される溶液のpHは、中性pHレベルに保たれるグリカンと同様に復元されなければならない。さらに、このプロトコルではグリカンリリースステップが重要です。グリカン放出の鍵は、その効率を最大化するためにPNGase F酵素の活性を改善することです。例えば、PNGaseF消化に最適な18~20時間であることがわかった。このステップは完全に反応する必要があります。

この手法にはいくつかの制限があります。使用される方法は、FabおよびIgGのFc部分から放出されるグリカンを区別できない。ファブとFcのグリカンは異なることを知られている。グリコプロテオミクスの発展に伴い、検出技術はN-グリカンを組み合わせたIgGのレベルを測定し、疾患におけるIgG N-グリカンおよびN-グリコシル化の役割を探求することができる。機器のコストは比較的低いです。ただし、サンプルあたりのコストはかなり高くなります。

要約すると、このプロトコルは UPLC を導入し、広く使用できるようにします。大規模な研究に多大な時間とリソースを投資する前に、分析方法の包括的な評価と標準化が必要です。UPLCがより広く使用されるようになるにつれて、特定の疾患に対するIgG N-グリカンおよびN-グリコシル化の効果をより正確に決定することができ、グリコシル化バイオマーカーは臨床応用に使用することができます。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

この研究は、中国国立自然科学財団(81673247&81872682)とオーストラリア・中国共同補助金(NH&MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)からの助成金によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

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References

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