Immunglobulin G N-Glycan analyse av ultra-gjennomførelse flytende kromatografi

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakterisert ved hjelp av hydrofile INTERAKSJON kromatografi UPLC. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert. Presentert her er en introduksjon til denne eksperimentelle metoden slik at den kan bli mye brukt i forskning innstillinger.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glycomics er en ny subspecialty i omics system forskning som gir betydelig potensial i å oppdage neste generasjons biomarkører for sykdoms mottakelighet, narkotika mål oppdagelse, og presisjons medisin. Alternativ IgG N-glykaner har blitt rapportert i flere vanlige kroniske sykdommer og foreslo å ha stort potensial i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører for diagnostisering og prediksjon av sykdommer). IgG N-glykaner er viden karakterisert ved hjelp av metoden for hydrofile interaksjon KROMATOGRAFI (HILIC) Ultra-ytelse flytende KROMATOGRAFI (UPLC). UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og høy relativ kvantitativ nøyaktighet. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert, og glycan sammensetning og relativ overflod i plasma er karakterisert.

Introduction

N-glykosylering av humane proteiner er en felles og viktig post-translational modifikasjon1 og kan bidra til å forutsi forekomsten og utviklingen av sykdommer relativt nøyaktig. På grunn av kompleksiteten i sin struktur, er det forventet at det er mer enn 5 000 glycan strukturer, gir stort potensial som diagnostiske og prediktiv biomarkører for sykdommer2. N-glykaner knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist å være avgjørende for IgG funksjon, og IgG N-glykosylering deltar i balansen mellom Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differensial IgG N-glykosylering er involvert i sykdomsutvikling og progresjon, som representerer både en predisposisjon og funksjonell mekanisme involvert i sykdoms patologi. Den inflammatoriske rollen som IgG N-glykosylering har vært assosiert med aldring, inflammatoriske sykdommer, autoimmune sykdommer, og kreft4.

Med utviklingen av gjenkjennings teknologi er følgende metoder mest brukt i høy gjennomstrømming glycomics: hydrofile interaksjon kromatografi (HILIC) Ultra-ytelse flytende kromatografi med fluorescens deteksjon (UPLC-FLR), multiplex kapillær gel elektroforese med laser indusert fluorescens deteksjon (xCGE-LIF), Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering time-of-Flight Mass massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og flytende kromatografi electrospray Mass massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metodene har overvunnet tidligere mangler av lav Flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhet spesifisitet5,6.

UPLC er mye brukt til å utforske foreningen mellom IgG N-glykosylering og visse sykdommer (dvs. aldring7, fedme8, dyslipidemi9, type II diabetes10, hypertensjon11, iskemiske hjerneslag12, og Parkinsons sykdom13). Sammenlignet med de tre andre ovennevnte metoder, har UPLC følgende fordeler5,14. For det første gir det en relativ kvantitativ analysemetode, og dataanalysen som involverer totalareal normalisering, forbedrer sammenlignbarhet for hvert utvalg. For det andre er kostnaden av utstyr og nødvendig ekspertise relativt lav, noe som gjør det enklere å implementere og transformere glykosylering biomarkører til kliniske anvendelser. Presentert her er en introduksjon til UPLC så det kan bli mer utbredt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle emnene som inngår i protokollen har blitt godkjent av etikk Committee of The Capital Medical University, Beijing, Kina12. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert emne i begynnelsen av studien.

1. IgG-isolasjon

  1. Forbered kjemikalier inkludert bindende buffer (fosfat bufret saltvann, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), nøytralisere buffer: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), eluent: 0,1 M maursyre syre (pH = 2,5), nøytralisere løsning for eluent: 1 M ammonium bikarbonat, lagret buffer: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), rengjøringsmiddel for protein G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-OL.
    Merk: pH-nivået er kritisk i denne protokollen. Eluering av IgG krever en svært lav pH, og det er en risiko for tap av Sialic syrer på grunn av syre hydrolyse. Derfor oppstår eluering i løpet av sekunder, og pH er raskt restaurert til nøytralitet, bevare integriteten til IgG og Sialic syrer.
  2. Forbered prøvene: tine den frosne plasma prøven deretter sentrifuge ved 80 x g i 10 min, og la proteinet g monolittisk plate og ovennevnte kjemikalier i 30 min ved romtemperatur (RT).
  3. Overfør en 100 μL prøve (som kan brukes til å oppdage 2x for å forhindre den første feilen) i en 2 mL oppsamlings plate (her, totalt seks standard prøver, en kontroll prøve [ultra-rent vann] og 89 plasmaprøver ble designet for 96 brønn plater og tilfeldig tildelt til platen).
  4. Fortynne prøvene med 1x PBS av 1:7 (v/v).
  5. Rengjør en filter plate med 0,45 μm hydrofile polypropylen (GHP) med 200 μL ultra-rent vann (gjenta 2x).
  6. Overfør de fortynnede prøvene inn i filter platen og Filtrer prøvene inn i oppsamlings platen ved hjelp av en vakuumpumpe (kontroll vakuumtrykk på 266.6-399.9 pa).
  7. Utarbeidelse av proteinet G monolittisk plater
    1. Forkast lagrings bufferen.
    2. Rengjør monolittisk platene med 2 mL ultra-rent vann, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M maursyre syre, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (sekvensielt), og fjern flytende væske ved hjelp av en vakuumpumpe.
  8. Overfør de filtrerte prøvene til proteinet G monolittisk plate for IgG-binding og rengjøring, og rengjør deretter monolittisk platene med 2 mL 1x PBS (gjenta rengjøringen 2x).
  9. Eluere IgG med 1 mL 0,1 M maursyre syre og Filtrer prøvene inn i oppsamlings platen ved hjelp av en vakuumpumpe, tilsett deretter 170 μL av 1 M ammonium bikarbonat i oppsamlings platen.
  10. Oppdage IgG konsentrasjon ved hjelp av en absorpsjon spektrofotometer (optimal bølgelengde = 280 NM).
    1. Åpne programvaren og velg protein-CY3-modus.
    2. Tegn 2 μL av ultra-rent vann og legg det inn i skjermen, og klikk deretter blank i programvaren for å tømme skjermen (gjenta 1x).
    3. Tegn 2 μL av ultra-rent vann og legg det inn i skjermen, og klikk deretter sample i programvaren for å oppdage det ultra-rent vann.
    4. Tegn 2 μL av IgG og Last den inn i skjermen, og klikk deretter sample i programvaren for å gjenkjenne prøven.
    5. Tegn 2 μL av ultra-rent vann og legg det inn i skjermen, og klikk deretter blank i programvaren for å tømme skjermen.
    6. Lukk programvaren.
      Merk: formelen for beregning av IgG-konsentrasjonen er som følger:

      CIgG = absorbansen x utryddelse koeffisient (13,7) x 1 000 μg/ml
  11. Sett den utpakkede IgG tørr i en ovn ved 60 ° c og bevare den utpakkede IgG (300 μL ekstrahert IgG for 4 h).
    1. Fjern 300 μL av utvunnet IgG hvis konsentrasjonen er større enn 1 000 μg/mL.
    2. Fjern 350 μL av utvunnet IgG hvis konsentrasjonen er mellom 500-1000 μg/mL.
    3. Fjern 400 μL av utvunnet IgG hvis konsentrasjonen er mellom 200-500 μg/mL.
    4. Fjern 600 μL av utvunnet IgG hvis konsentrasjonen er mindre enn 200 μg/mL.
      Merk: konsentrasjonen av IgG bør fortrinnsvis > 200 μg/mL for senere deteksjon. Den gjennomsnittlige mengden IgG bør fortrinnsvis > 1200 μg, som kan testes 2x i tilfelle den første testen mislykkes.
  12. Rengjøring av proteinet G monolittisk plate for gjenbruk
    1. Vask platen med 2 mL ultra-rent vann, 1 mL 0,1 M NaOH (for fjerning av forårsaket proteiner), 4 mL ultra-rent vann, og 4 mL 1x PBS (sekvensielt), og fjern deretter flytende væske ved hjelp av en vakuumpumpe.
    2. Vask platen med 2 mL ultra-rent vann, 2 mL 30% propan-2-OL (for fjerning av bundne hydrofobe proteiner), 2 mL ultra-rent vann, og 4 mL 1x PBS (sekvensielt), og fjern deretter flytende væske ved hjelp av en vakuumpumpe.
    3. Vask platen med 1 mL buffer (20% etanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) og tilsett 1 mL buffer (20% etanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) til platen, og la deretter platen stå ved 4 ° c.

2. Glycan utgivelse

  1. Klargjør tørket IgG og oppbevar kjemikaliene inkludert 1,33% SDS, 4% Igepal (Oppbevares adskilt fra lys), og 5x PBS ved RT.
  2. Forbered PNGase F-enzym ved å fortynne 250 U-enzym med 250 μL av ultra-rent vann.
  3. Denaturering av IgG
    1. Tilsett 30 μL av 1,33% SDS og bland med virvlingen, overføre prøven til en 65 ° c ovnen i 10 min, og deretter fjerne den fra ovnen og la hvile i 15 min.
    2. Tilsett 10 μL av 4% Igepal og plasser den på den skjelvende inkubator i 5 min.
  4. Fjerning og frigjøring av glykaner
    1. Tilsett 20 μL av 5x PBS og 30-35 μL av 0,1 mol/L NaOH for å regulere en pH på 8,0, og bland med virvlingen. Tilsett 4 μL av PNGase F-enzym og bland med virvlingen. Deretter ruge for 18-20 h i en 37 ° c vannbad.
    2. Sett den frigitte glykaner tørke i en ovn ved 60 ° c for 2,5-3,0 h.
    3. Lagre den frigitte glykaner ved-80 ° c inntil videre måling.
      Merk: dette trinnet er kritisk. Nøkkelen til glycan utgivelse er å forbedre aktiviteten til PNGase F-enzymet for å maksimere dens effektivitet.

3. Glycan merking og rensing

  1. Klargjør 2-aminobenzamide (2-AB) merking av reagens med 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL av eddiksyre, 6 mg natrium cyanoborohydride (NaBH3cn) og 24,50 μL av dimethyl SULFOXIDE (DMSO) (totalt volum = 35 μL). Deretter legger eddiksyre, 2-AB, og NaBH3cn i DMSO i orden.
  2. Merk glykaner med 35 μL av 2-AB merkings reagens, overfør den merkede glykaner til oscillator i 5 min, Overfør til ovnen i 3 timer ved 65 ° c, og Overfør deretter til RT i 30 minutter.
    Merk: hele det glycan merkings trinnet må utføres samtidig som det beskyttes mot lys.
  3. Forbehandle en 0,2 GHP filter plate med 200 μL av 70% etanol, 200 μL av ultra-rent vann, og 200 μL av 96% acetonitril (4 ° c), deretter fjerne avfall ved hjelp av en vakuumpumpe.
  4. Rensing av 2-AB merket glycan
    1. Tilsett 700 μL av 100% acetonitril til 2-AB merket glycan og Overfør til en risting inkubator i 5 min.
    2. Sentrifuger ved 134 x g i 5 min (4 ° c).
    3. Overfør prøven til en 0,2 på GHP filter platen i 2 minutter, og fjern Filtrer (flytende væske) ved hjelp av en vakuumpumpe.
  5. Vask 2-AB merket glycan med 200 μL av 96% acetonitril (4 ° c) og fjern Filtrer (flytende væske) med en vakuumpumpe 5x-6 ganger.
  6. Eluere 2-AB merket glycan med 100 μL av ultra-rent vann 3x.
  7. Overfør 2-AB merket glycan til en ovn for å tørke ved 60 ° c for 3,5 h.
  8. Lagre merket N-glykaner ved-80 ° c inntil videre måling.

4. hydrofile samhandling kromatografi og analyse av glykaner

  1. Condition av UPLC instrumenter og utarbeidelse av mobile faser
    1. Klargjør mobile faser inkludert løsemiddel A: 100 mM ammonium formiat (pH = 4,4), løsemiddel B: 100% acetonitril, løsemiddel C: 90% ultra-rent vann (10% metanol) og løsemiddel D: 50% metanol (Ultra-rent vann).
    2. Åpne programvaren for å kontrollere de mobile fasene.
    3. Vask UPLC instrumenter ved strømningshastighet på 0,2 mL/min (50% løsemiddel B og 50% løsemiddel C) balansere i 30 minutter, deretter ved en strømningshastighet på 0,2 mL/min (25% løsemiddel A og 75% løsemiddel B) balansere i 20 minutter, deretter en strømningshastighet på 0,4 mL/min balansering.
  2. Løs opp merket N-glykaner med 25 μL av en blanding av 100% acetonitril og ultra-rent vann i et 2:1-forhold (v/v). Deretter sentrifuge ved 134 × g i 5 min (4 ° c) og Last 10 μL av den merkede N-glykaner i UPLC instrumenter.
  3. Skill den merkede N-glykaner ved strømningshastighet på 0,4 ml/min med en lineær gradering på 75% til 62% acetonitril i 25 min. Utfør deretter en analytisk utførelse av dextran kalibrerings stige/glykopeptid søyle på en UPLC ved 60 ° c (her ble prøvene oppbevart ved 4 ° c før injeksjon).
  4. Oppdag N-glycan fluorescens ved eksitasjon og utslipps bølgelengder på henholdsvis 330 nm og 420 NM.
  5. Integrer glykaner basert på topp posisjon og oppbevaringstid.
  6. Beregn den relative verdien av hver Glycan Peak (GP)/alle Glycan Peaks (GPs) (prosentandel,%) som følger: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 1ble IgG N-glykaner analysert i 24 innledende IgG-glycan topper (GPS) basert på topp posisjon og oppbevaringstid. N-glycan strukturer er tilgjengelig gjennom masse massespektrometri deteksjon i henhold til en tidligere studie (tabell 1)15. For å sikre at resultatene var sammenlignbare, ble totalareal normalisering brukt, der mengden av glykaner i hver topp ble uttrykt som en prosentandel av det totale integrerte området.

For å vurdere repeterbarhet og stabilitet i metoden, ble standard prøven testet parallelt seks ganger. Som vist i tabell 2varierte variasjonskoeffisienten (CV) på 24 GPS fra 1.84%-16,73%, 15 (62,50%) som var under 10%. GPs med relativt små proporsjoner (≤ 1,16%) viste høye målingsfeil (mer enn 10% av CV). I tillegg indikerte IgG N-glycan profilene fra 76 individer (figur 2) at posisjonen til GP var stabil, form av GP var lik, og integrering for prøvene opprettholdt de samme intervallene. Resultatene ovenfor indikerer at metoden er stabil og repeterbar.

Som vist i tabell 3ble ytterligere 36 avledede trekk som beskriver den relative forekomster av galactosylation, sialylation, halverer GlcNAc og kjerne fucosylation, beregnet av de resterende 24 direkte målte glykaner. For eksempel, G2/G0 (GP12/GP2) reflekterte nivået av galactosylation (di-/a-) uten kjerne fucosylation og halverer GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) reflekterte nivået av galactosylation (di-/mono-) med kjerne fucosylation og uten halverer GlcNAc. Endelig, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) reflekterte nivået av galactosylation (mono-/a-) med kjerne fucosylation og halverer GlcNAc. Disse beregningene av avledede glykaner følger et prinsipp, for å se endringen av bare én glykosylering egenskap.

Figure 1
Figur 1: UPLC kromatogram av en enkelt person. IgG N-glykaner ble analysert i 24 innledende IgG-glycan topper (GPS) basert på topp posisjon og oppbevaringstid. GP8 representerer summen av GP 8a og GP 8B. GP16 representerer summen av GP 16A og GP 16B. Strukturen av glykaner i hver kromatografiske topp og gjennomsnittlig prosentandel av individuelle strukturer er vist i tabell 1 og tabell 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: UPLC kromatogram av 76 individer. IgG N-glycan profilene ble kombinert fra 76 individer til å demonstrere repeterbarhet og stabilitet av metoden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: struktur for de 24 første IgG-glykaner. GP: glycan peak; F: fucose; A: antall antenne er festet til kjernen sekvensen (eksisterende av to NAcetylglucosamine (GlcNAc) og tre mannose rester); B: halverer GlcNac; G: galaktose; S: Sialic syre. Strukturelle ordninger er definert som følger: blå firkant: GlcNac; grønn sirkel: mannose; rød trekant: kjerne fucose/antennary fucose; gul sirkel: galaktose; lilla rhomb: Sialic syre.

Glycan topp Gjennomsnitt (SD) CV (%) Glycan topp Gjennomsnitt (SD) CV (%)
GP1 0,23 (0,017) 7,28 GP13 0,50 (0,043) 8,64
GP2 0,24 (0,034) 13,97 GP14 19,54 (0,36) 1,84
GP3 0,96 (0,16) 16,73 GP15 1,16 (0,14) 11,63
GP4 19,52 (0,58) 2,98 GP16 2,79 (0,19) 6,93
GP5 0,17 (0,024) 13,86 GP17 1,29 (0,13) 9,78
GP6 3,19 (0,26) 8,22 GP18 13,16 (0,51) 3,85
GP7 0,29 (0,033) 11,51 GP19 2,12 (0,21) 9,76
GP8 16,45 (0,62) 3,77 GP20 0,12 (0,018) 14,91
GP9 8,97 (0,52) 5,74 GP21 1,05 (0,17) 16,09
GP10 2,97 (0,22) 7,34 GP22 0,18 (0,025) 14,16
GP11 0,30 (0,041) 13,82 GP23 2,14 (0,14) 6,45
GP12 1,27 (0,026) 2,08 GP24 1,43 (0,13) 9,12

Tabell 2: presisjon av metoden. Standard prøven testes parallelt seks ganger for å vurdere repeterbarheten og stabiliteten til metoden. CV: Variasjonskoeffisient; GP: Glycan peak; SD: standard avvik.

Avledet glykaner Formler Avledet glykaner Formler
Galactosylation Fucosylation
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8 + GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8 + GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10 + GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8 + GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10 + GP11)/GP6
Sialylation Halverer GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

Tabell 3: beregning av den avledede glykaner. GP: glycan peak; F: fucose; B: halverer GlcNac; G: galaktose; S: Sialic syre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

UPLC fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultatene tyder på at UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og relativ kvantitativ nøyaktighet. Mengden av glykaner i hver topp er uttrykt som en prosentandel av det totale integrerte området ved hjelp av UPLC, som er den relative verdien. Den relative kvantifisering forbedrer sammenlignbarhet til testprøvene. I tillegg brukes 96 brønn protein G-plater til å rense IgG med 96 prøver på én gang for påvisning av høy gjennomstrømming. Evne til protein G å binde IgG er større enn protein A, som beskrevet i tidligere studier15,16.

I tillegg er strukturene i IgG N-glycan klart adskilt. Det avledede IgG-glykaner beskriver nivået av galactosylation, sialylation, halverer GlcNAc og kjerne fucosylation, som beregnes av den første IgG N-glykaner. I en tidligere studie, noen avledet glykaner (FBn, FBG0n /G0n, FBn /Fntotal, Bn /(Fn + FBn), FBG2n /FG2n, FG2n /(BG2n + FBG2n), BG2n /(FG2n + FBG2n)) kan gjenspeile endringen i flere glykosylering nivåer, men ikke gjenspeile nivået på bestemte glykosylering15.

Nylig, en storstilt studie viste at IgG galactosylation (referert til som gal-ratio) kan tjene som en lovende biomarkør for kreft screening i flere krefttyper17. Fordelingen av IgG-galactosylation måles ved å beregne den relative intensiteten av agalactosylated (G0) vs. Monogalactosylated (G1) og Digalactosylated (G2) N-glykaner i henhold til formelen (G0/[G1 + G2 x 2]). Den gal-ratio reflekterer nivået av galactosylation med kjerne fucosylation og uten halverer GlcNAc. Derfor ble flere innledende IgG N-glykaner kombinert med en avledet glycan, som representerer nivået av en bestemt glykosylering egenskap. Beregningene av avledede glykaner følger et prinsipp som utforsker endringene i bare ett glykosylering trekk som er festet over andre glykosylering trekk.

I denne protokollen er pH viktig for å opprettholde stabiliteten til IgG og glycan strukturer, spesielt for å stabilisere Terminal sialylation. Derfor må pH-verdien av løsningen være strengt kontrollert, og pH i løsningen eksponert for IgG må gjenopprettes samt glykaner holdt på et nøytralt pH-nivå. I tillegg er glycan Utgivelses trinn kritisk i denne protokollen. Nøkkelen til glycan utgivelse er å forbedre aktiviteten til PNGase F-enzymet for å maksimere dens effektivitet. For eksempel ble det funnet at 18-20 h er optimal for PNGaseF fordøyelsen. Dette trinnet må være fullt reagerte.

Det er noen begrensninger av denne teknikken. Metoden anvendt kan ikke skille ut glykaner befridd fra det fab og det FC deler av IgG. Glykaner fra fab og FC er kjent for å være annerledes. Med utviklingen i glycoproteomics, kan deteksjon teknikker måle nivåene av IgG kombinere n-glykaner å utforske rollen som IgG N-glykaner og N-glykosylering i sykdommer. Kostnaden av utstyr er relativt lav; Imidlertid er kostnaden per prøve ganske høy.

Oppsummert, denne protokollen introduserer UPLC slik at det kan bli mye brukt. Omfattende verdivurdering og standardisering av analytiske metoder er nødvendig før betydelige mengder tid og ressurser er investert i stor skala studier. Som UPLC blir mer utbredt, kan effekten av IgG N-glykaner og N-glykosylering på visse sykdommer være mer nøyaktig bestemmes, og glykosylering biomarkører kan brukes til kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative Grant (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21, (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics