Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь представлен протокол для производства и заднего CRISPR/Cas9 генома нокаут электрической рыбы. Изложены в деталях являются необходимые молекулярной биологии, селекции, и животноводство требования как для gymnotiform и mormyrid, и инъекционные методы для производства Cas9 индуцированных indel F0 личинок.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру. Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. За 50 лет, прошедших с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться, растущее сообщество ученых получило огромное понимание эволюции развития, систем и схем нейронауки, клеточной физиологии, экологии, эволюционной биологии и поведения. В последнее время наблюдается распространение геномных ресурсов для электрической рыбы. Использование этих ресурсов уже способствовало получению важных сведений о связи между генотипом и фенотипом этих видов. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики. Мы сообщаем здесь полный протокол для выполнения CRISPR/Cas9 мутагенеза, который использует эндогенные механизмы репарации ДНК в слабо электрических рыб. Мы демонстрируем, что этот протокол одинаково эффективен как в мормиридных видах Brienomyrus brachyistius, так и в gymnotiform Brachyhypopomus gauderio с помощью CRISPR/Cas9 для целевой indels и точечных мутаций в первом экзоне натриевый канал гена scn4aa. Используя этот протокол, эмбрионы обоих видов были получены и генотипированы, чтобы подтвердить, что прогнозируемые мутации в первом экзоне канала натрия scn4aa присутствовали. Плей-аут успеха фенотип был подтвержден с записями, показывающими снижение электрических амплитуды разряда органов по сравнению с невведенным размером соответствующих элементов управления.

Introduction

Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Две линии телеостных рыб, остеоглоссиформы и силуриформы, развивались электроприем параллельно, и пять линий телеост (гимназии, мормириды, и род Астроскопус, Малаптерурус, и Synodontis) развивался электрогенез параллельно. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру1,2,3.

Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. В 50 лет с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться4, растущее сообщество ученых получил огромное понимание эволюции развития1,5 ,6, системы и схемы нейробиологии7,8,9,10, клеточной физиологии11,12, экологии и энергетики13 ,14,15,16,17, поведение18,19, и макроэволюция3,20,21 .

В последнее время наблюдается распространение геномных, транскриптомических и протеомных ресурсов для электрической рыбы1,22,23,24,25,26, 27,28. Использование этих ресурсов уже дало важные идеи относительно связи между генотипом и фенотипом у этих видов1,2,3,28,29 ,30. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики31.

Одним из таких инструментов является недавно разработанный кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic Повторы в паре с Cas9 эндонуклеазы (CRISPR/Cas9, CRISPR) техники. CRISPR/Cas9 является инструментом редактирования генома, который вошел широкое применение в обеих моделей32,33,34 и не-модель организмов35,36,37, так. Технология CRISPR/Cas9 продвинулась до такой степени, что лаборатория, способная к базовой молекулярной биологии, может легко генерировать генно-специфические зонды, называемые короткими направляющими РНК (sgRNAs), по низкой цене с использованием метода неклонирования38. CRISPR имеет преимущества по сравнению с другими стратегиями нокаута/нокдауна, такими как морфолинос39,40, транскрипционный активатор-подобный эффектор nucleases (TALENs), и цинковый палец nucleases (ЗФНС), которые являются дорогостоящими и много времени для генерации для каждого целевого гена.

Система CRISPR/Cas9 функционирует для создания генных нокаутов, ориентируясь на определенную область генома, направленную последовательностью sgRNA, и вызывая двухцепочечный разрыв. Двухцепочечный разрыв обнаруживается клеткой и вызывает эндогенные механизмы репарации ДНК, преимущественно используя негомологичные конечные соединения (NHEJ). Этот путь очень подвержен ошибкам: во время процесса ремонта молекула ДНК часто включает вставки или удаления (индельи) в двухцепочечном месте разрыва. Эти indels могут привести к потере функции из-за либо (1) сдвиги в открытой раме чтения, (2) вставки преждевременной остановки кодона, или (3) сдвиги в критической первичной структуре гена продукта. В этом протоколе мы используем редактирование CRISPR/Cas9 для целевых точечных мутаций в генах-мишенях, используя NHEJ у слабо электрических видов рыб. Хотя проще и эффективнее, чем другие методы, этот метод мутагенеза, как ожидается, приведет к ряду фенотипических разрывов в F0, который приписывается генетический мозаичный41,42,43 ,44.

Выбор организмов
Для содействия будущим исследованиям по сравнительной геномике слабо электрических рыб необходимо было отобрать представительный вид как для гимназиформ, так и для мормиридов для разработки протокола. После обсуждения в ходе совещания «Электрические рыбы» в Монтевидео, Уругвай, в 2016 году был достигнут консенсус сообщества в отношении использования видов, которые уже могут быть выведены в лаборатории и которые имеют сявко. Тренажерный зал Brachyhypopomus gauderio и mormyrid Brienomyrus brachyistius были выбраны в качестве видов, которые соответствуют этим критериям. В обоих видах, естественные сигналы для индуцирования и поддержания условий размножения легко имитировать в неволе. B. gauderio, gymnotiform видов из южной Америки, имеет преимущество низких требований к животноводству: рыба может храниться при относительно высокой плотности в относительно небольших (4 L) танков. B. gauderio также имеет быстрый оборот поколений в условияхневоле. В лабораторных условиях, B. gauderio может развиваться от яйца к взрослому примерно в 4 месяца.

B. brachyistius, вид мормиридных рыб из Западно-Центральной Африки, легко размножается в неволе. B. brachyistius легко доступен через аквариум торговли, был широко использован во многих исследованиях, и в настоящее время имеет ряд геномных ресурсов. Их жизненный цикл составляет 1–3 года, в зависимости от лабораторных условий. Требования к животноводству несколько более интенсивны для этого вида, требуя средних размеров танков (50–100 л) из-за их агрессии во время размножения.

Лаборатории, изучающие другие виды электрических рыб, должны быть в состоянии легко адаптировать этот протокол до тех пор, пока вид может быть выведен, и одноклеточные эмбрионы могут быть собраны и воспитаны во взрослую жизнь. С другими видами, скорее всего, изменятся показатели жилищного строительства, личинки и экстракорпорального оплодотворения (ЭКО); однако, этот протокол может быть использован в качестве отправной точки для размножения попыток в других слабо электрических рыб.

Идеальный ген Целевой для доказательства концепции: scn4aa
Слабо электрические мормиридные и gymnotiform рыбы генерировать электрические поля (электрогенез) путем разрядки специализированного органа, называемого электрическим органом. Электрические разряды органов (EOD) являются результатом одновременного производства потенциалов действия в клетках электрических органов, называемых электроцитами. EODs обнаружены массив электрорецепторов в коже для создания высокого разрешения электрических изображений окружения рыбы45. Слабо электрические рыбы также способны обнаруживать особенности eOD волновых форм их conspecifics18, а также их скорость разряда46,что позволяет EODs функционировать дополнительно в качестве сигнала социальной связи, аналогичной пение птиц или лягушки вокализации47.

Основным компонентом действия потенциального поколения в электроцитах как мормирид, так и gymnotiform слабо электрической рыбы является напряжение-gated натриевый канал NaV1.42. Неэлектрические телеост выражают две паралогические копии генов, scn4aa и scn4ab, кодирование для натриевого канала NaV1.430. В обоих gymnotiform и mormyrid слабо электрических линий рыбы, scn4aa развивалась быстро и претерпела многочисленные аминокислотные замены, которые влияют на его кинетические свойства48. Самое главное, scn4aa стала разобщена в обеих линиях к электрическому органу2,3. Относительно ограниченное выражение scn4aa к электрическому органу, а также его ключевая роль в генерации EODs, делает его идеальной мишенью для экспериментов по нокауту CRISPR/Cas9, так как он имеет минимальные пагубные плейотропные эффекты. Поскольку слабо электрические рыбы начинают выгрузку своих личинок электрических органов 6-8 дней после оплодотворения (DPF), ориентация scn4aa идеально подходит для быстрого фенотипирования после микроинъекции эмбриона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Мичиганского государственного университета.

1. Выбор целей sgRNA

ПРИМЕЧАНИЕ: Предусмотрен протокол ручного проектирования сгРНВ в шаге 1.1. Это было использовано для выбора цели scn4aa. Для облегчения этого процесса (шаг 1.2) предусмотрен дополнительный протокол с помощью веб-портала EFISHGENOMICS. Рекомендуется, чтобы пользователи выбрали протокол 1.2, который включает в себя несколько автоматизированных "проверок", чтобы обеспечить успех в разработке sgRNAs для пользовательских целей.

  1. Проектирование sgRNA целей.
    1. Для генерации sgRNA руководство олиго, лучше всего целевой экзон 1, или другие 5' экзонов. 5' UTR может быть мишенью; однако лучше всего ориентироваться на последовательность кодирования 5. Использование геномной информации предпочтительнее, но можно развивать успешные sgRNA с использованием транскриптомных данных. Предпочтительны аннотации границ интронов/экзонов (геномные данные) или экзон/экзон.
    2. Кандидат геномных последовательностей от 1.1 ищутся для целевых последовательностей, которые соответствуют шаблону 5'-N (18)-NGG-3'. Это может быть автоматически выполнено с помощью программного обеспечения для анализа последовательности рабочего стола, пользовательских скриптов или с помощью ручного осмотра последовательностей.
    3. Последовательности могут быть приоритетными с помощью метода Doench et al.49 для целевой деятельности. Кроме того, целевые последовательности могут быть оценены по поиску BLAST по геномным/транскриптомическим базам данных для нецелевой привязки.
    4. Убедитесь, что стандартные праймеры ПЦР могут быть сгенерированы, что фланг целевой последовательности. Праймеры должны быть не менее 20 bp с обеих сторон участка разреза (три базы вверх по течению последовательности NGG). В идеале продукт ПЦР должен быть 150–200 базовых пар (bp).
    5. Дизайн олигомеров, отвечающих вышеуказанным критериям, используя ниже шаблон, который включает в себя T7 промоутер (5' N18) и дополнительный регион (3' N18) для аннулирования на постоянный олигомер (1.1.6): 5'-TAATACGACTACTATAGG-N18 -GTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность N18 не включает смежный мотив NGG (PAM). Не включайте это в олигомер.
    6. Закажите постоянный олигомер(Таблица 1), который будет использоваться для синтеза всех sgRNAs, олигомеры для целей sgRNA (шаг 1.1.5), и ПЦР праймеры (шаг 1.1.4) в качестве стандартного опресненных олигомеров от услуги по производству олигонуклеотидов. Олигомеры и ПЦР грунтовки могут быть заказаны в качестве стандартных озалитых олигомеров, никакой дополнительной очистки не требуется.
  2. Выполняйте автоматизированное проектирование целей sgRNA.
    1. Используя геномные данные, выберите ген-мишень. Транскриптомные данные могут быть использованы вместо этого, когда экзон / интрон границы известны. Цели можно определить с помощью портала EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). Идеальная цель будет в пределах exon 1; однако, другие 5' экзоны и 5' UTR могут быть рассмотрены.
    2. После того, как целевая последовательность будет определена, загрузите свободно доступный веб-инструмент EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). Этот веб-инструмент использует индивидуальную версию алгоритма CRISPOR для целевого поколения50,51.
    3. В поле для шага 1введите название последовательности и введите последовательность цели в соответствующую коробку.
  3. Выберите подходящий геном, из которого вытекает последовательность. В настоящее время геномные данные доступны для B. brachyistius и B. gauderio. Геномные последовательности не требуются для использования этого инструмента, но полезны для оценки потенциальных нежелательных вне целевых эффектов.
  4. Выберите подходящий PAM. Рекомендуется 20 bp-NGG PAM, хотя есть несколько дополнительных мотивов PAM на выбор, в зависимости от используемого белка Cas9.
  5. Отчет будет сгенерирован с расположением целевой последовательности в геноме с предлагаемыми последовательностями руководства. Выберите три цели с низким прогнозируемым эффектами вне цели, высокой определенностью и высокой эффективностью. Наивысший балл руководства последовательности выделены с зеленым цветом на левой стороне. По возможности следует избегать желтых и красных подсвеченных направляющих последовательностей.
  6. Нажатие на выбранные целевые последовательности генерирует всеобъемлющий отчет CRISPOR. Ключевая информация из этих докладов для "T7 in vitro выражение от перекрытия олигонуклеотидов". Из этого отчета, извлечь следующую информацию: рекомендуемые олигосы sgRNA, ПЦР праймеры для целевого сайта, и постоянный олигомер, который будет использоваться для синтеза всех sgRNAs.
  7. Закажите выбранные олигомеры (шаг 1.6) из производственной службы олигонуклеотида. Олигомеры и ПЦР грунтовки могут быть заказаны в качестве стандартных озалитых олигомеров, никакой дополнительной очистки не требуется.

2. Генерировать sgRNA

  1. Аннеал олигомеры в трубке ПЦР: добавить 1 зл и 100 мкм постоянный олигомер, 1 КЛ 100 ММ sgRNA специфический олигомер, и 8 Зл nuclease-бесплатно H2O
  2. Аннеал олигомеры в термоцикле со следующей программой: тепло при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин, прохладно до 85 градусов по Цельсию при -2 C/s, прохладно до 25 градусов по Цельсию при 0,1 градуса По Цельсию, и удерживайте при температуре 4 градуса По Цельсию.
  3. Для создания шаблона sgRNA добавьте 2,5 л смеси dNTP (10 мМ), 2 зл 10-кратного буфера, 0,5 л полимераза T4 ДНК и 5 зл нуклеазой H2O к анзапечатированным олигомерам со ступени 2.2. Инкубировать в течение 20 мин при 12 градусах По Цельсию.
  4. Очистите шаблон с помощью пЦР очистки столбца в инструкции производителя.
  5. Elute в 20-30 ЗЛ. Используйте спектрофотометр для оценки концентрации и чистоты. Шаблон должен быть 100-200 нг/Л и 1,8-1,9 A260/280.
  6. Проверить с помощью геля агарозы, запустив 1-5 Л. Доминирующая полоса должна быть 120 bp. См Рисунок 1A для репрезентативных результатов.
  7. Храните гель-проверенный шаблон sgRNA при -20 градусах по Цельсию (долгосрочный) или 4 C (короткий срок, 1-4 недели).
  8. Transcribe sgRNA с помощью комплекта транскрипции T7 RNA, добавляя в микроцентрифугную трубку 1,5 мл при комнатной температуре 8 л dNTP смеси (равные объемы dA, dT, dG, dC), 2 л 10x буфера (комнатная температура), 2 л T7 РНК-полимераза, 100-200 нг-х шаблона sRNA , и нуклеа-бесплатно H2O до 20 Л общего объема. Спин, чтобы собрать в нижней части. Инкубировать 2-4 ч при 37 градусах Цельсия.
  9. Добавьте 1 кЛ DNase и инкубировать дополнительные 15 минут при 37 градусах Цельсия.
    1. Очистите sgRNA путем добавления 1 зЛ гликогена, 30 зл и без нуклеазы H2O, 30 Зл из 5 М ацетата аммония и 180 Зл 100% EtOH к транскрибированной сгРНК. Хорошо перемешайте и инкубировать не менее 20 мин при -80 градусов по Цельсию (до заморозки) или при -20 градусов на ночь. Центрифуга при 4 градусах по Цельсию в течение 15 минут на максимальной скорости.
  10. Удалить и отбросить супернатант, не нарушая гранулы, и мыть с 1 мл RNase-бесплатно 70% EtOH охлажденный при -20 градусов по Цельсию. Спин дополнительные 5 минут на максимальной скорости на 4 градуса Цельсия.
  11. Удалите и отбросьте супернатант, не нарушая гранулы, и воздух сухой гранулы в течение 5 минут.
  12. Повторно езбитая в 30 л без нуклеаза H2O и определить чистоту и урожайность с помощью УФ-спектроскопии (минимальная урожайность 200 нг/Л).
  13. Проверьте наличие sgRNA на RNase-бесплатный гель. SgRNA появляется между 50 и 150 bp как две полосы из-за вторичной структуры(рисунок 1B).
  14. Aliquot в 3 qL и хранить при -80 градусах по Цельсию.

3. Проверка эффективности резки в Vitro

  1. Извлекайте геномную ДНК из целевого вида с помощью коммерческого комплекта для извлечения ДНК. Вентральные плавники можно использовать без необходимости жертвовать рыбой, потому что ткани регенерируются.
  2. Усиль область ДНК цели с помощью грунтовков, описанных в шагах 1.6 и 1.7 с использованием стандартного ПЦР. Проверить продукт с помощью геля электрофореза. Предлагается, но не требуется секвенирование фрагмента для обеспечения того, чтобы соответствующий регион был усилен. Результаты представительских результатов для шаблона scn4aa показаны на рисунке 2.
  3. Очистка фрагмента ПЦР с помощью установленного протокола лаборатории или компании.
  4. Храните усиленную ДНК при -20 градусах Цельсия. Рассмотрите возможность разделения его на аликвоты, чтобы уменьшить циклы замораживания-оттепели.
  5. Определите требуемые объемы и объемы каждого компонента. Рассмотрим запуск отрицательных элементов управления (за исключением либо sgRNA или Cas9) и положительный контроль (ранее испытанный sgRNA, который расщепляет свою целевую ПЦР усиленную ДНК), если таковая имеется, а также серию концентрации sgRNA.
  6. Настройка реакционной смеси ниже в указанном порядке в трубке ПЦР при комнатной температуре, добавляя белок sgRNA и Cas9 для достижения наилучших результатов: 50-100 нг целевого продукта ПЦР ДНК, 1 кЛ 10x буфера 3, 1 л 10x BSA (0,1 г/мл) , 50-200 нг белка Cas9 (1 мг/мл, 150 нг предложил), и 30-200 нг sgRNA (100 нг предложил).
    1. Инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию в течение 1 ч, а затем при 65 градусах по Цельсию в течение 10 мин, чтобы инактивировать белок Cas9.
    2. Запустите весь образец на 2%-3% агарозный гель (ожидаемый размер полосы между 30-200 bp) наряду с положительным и отрицательным контролем. Успешное расщепление может показать некоторые из продукта ПЦР, но также будет иметь две меньшие полосы. Результаты представительства показаны на рисунке 2.

4. Получение эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение эмбрионов слабо электрической рыбы может быть сложной задачей. Тщательный мониторинг качества воды, достаточное время для ухода за рыбой и регулярное кормление являются ключом к успешной программе разведения. Рыба должна быть сначала обусловлена в течение нескольких недель для размножения52, как описано в протоколе шаг 4.1. После этого, протокол увеличения естественного гаметогенеза (4.2) для использования в естественном нерестовом поведении (4.3), альтернатива недавно разработана в пробирке техники для получения точно приурочен эмбрионов (4.4) представлены. Протокол 4.3 одинаково эффективен для B. brachyistius и B. gauderio,а протокол 4.4 превосходит B. gauderio.

  1. Кондиционирования
    1. Держите B. brachyistius в парах/небольших группах (100-150 L-резервуаров) или в очень больших резервуарах (2 самца и 5-6 самок примерно в 475 L-танке), так как они становятся очень агрессивными в условиях размножения. Там должно быть по крайней мере 1-2 ПВХ трубки на рыбу, которая будет использоваться в качестве укрытия(рисунок 3A,B).
    2. B. gauderio можно вырастить при гораздо более высокой плотности. Держите до восьми человек в 100 L танк (2 мужчины и 6 женщин). Там должно быть по крайней мере 1 ПВХ трубки на рыбу, которая будет использоваться в качестве укрытия. Добавление запутанной пряжи увеличивает обогащение и укрытия пятен. Добавьте 50 мл центрифуговых труб окни с отверстиями диаметром 1 см, просверленными в них в верхней части бака, чтобы позволить взрослым естественным образом породить в трубки(рисунок 3C).
    3. Во время сезона размножения кормите рыбу ежедневно свежими черными червями, дополненными замороженными кровяными червями. Пища может быть обогащена витаминами и добавками, при желании.
    4. Домашняя рыба обычно в относительно высокой проводимости (300-600 зС), взвешенном растворе рН. Во время сезона размножения, постепенно снизить проводимость, по крайней мере наполовину в течение 1-3 недель, чтобы вызвать гонад recrudescence и нереста. Более низкая проводимость ежедневными добавлениями воды обратного осмоса (RO), сохраняя пристальное внимание к рН, когда проводимость низкая (pH злитро;6).
    5. Условия размножения могут сохраняться в течение 3–5 месяцев, при этом производство яиц со временем сужается. По истечение этого времени, вернуть рыбу к высокой проводимости медленно в течение 1-3 недель. Держите еще 3 месяца при высокой проводимости, прежде чем подвергаться воздействию условий размножения снова.
  2. Используйте нереститовый агент (SGnRHa и Domperidone) инъекции.
    1. Определить самку рыбы в условиях размножения, которые появляются gravid(Рисунок 4). В B. gauderio самка будет иметь опухшие гонады просто caudal к жерлу. B. brachyistius женщины будут иметь опухшие животы и появляются глубокие телесные(рисунок 4A). Мужчины, как правило, не имеют проблемы производства спермы. Однако, более большие мужчины предпочесть из-за более большого количества спермы собранного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нерестагент является коммерческим гормоном смесь, которая облегчает созревание гамет и координаты нереста. Если рыба была введена с нереста агента в прошлом, позволяют для йgt;4 недель отдыха и достаточно кормления между инъекциями. Мы предлагаем инъекционных по крайней мере 2 мужчин и 4-5 женщин, чтобы обеспечить несколько муфты яиц и много спермы.
    2. Анестезия рыбы в МС-222 (0,4 г/3 л) в течение нескольких минут, пока рыба не сможет сохранить свою осанку, не является неподвижным, но продолжает иметь оперкулярное движение (этап II53).
    3. Взвесьте рыбу (g) для расчета количества нерестового агента (0,5 л/г) и 0,5 л. Дополнительные 0,5 л приходится на ошибки трубачирования.
    4. Добавьте нерестилищ в 4-х объемов буфера (1x PBS или DPBS) в трубку ПЦР и хорошо перемешайте. Решение станет облачным. Это помогает обойтись нерестового агента на термопластик, а затем использовать пипетку для измерения расчетной дозы. Нерестящий агент вязкий, так что не забудьте обойтись всю дозу и будьте осторожны с пипеткой.
    5. Pipette инъекционный раствор на термопластик и втянуть в точный стеклянный шприц, избегая пузырьков воздуха. Мы рекомендуем 28 G, 19-25 мм длиной, сможенная игла.
    6. Введите раствор в мышцу туловища с плавной скоростью. Пусть игла сидеть в течение 2-4 с, а затем удалить. Немедленно положить рыбу в пресной системы воды для восстановления.
    7. Примерно через 24 ч подготовьтесь к сбору эмбрионов (см. 4.3 или 4.4). Соберите все необходимые материалы, включая то, что необходимо для одноклеточной микроинъекции (см. раздел 5).
  3. Получение эмбрионов путем естественного нереста.
    1. Дом нереста агента вводили взрослых (4,2) в больших 450 L танков. Наиболее эффективными соотношениями полов, как правило, были 1-2 самцов и 3-4 самки с адекватными укрытиями из трубок Из ПВХ и темным мраморным субстратом на дне бака, чтобы предотвратить потребление яиц. Мраморы, как правило, более важны для B. brachyistius, чем B. gauderio, которые предпочитают откладывать свои липкие яйца в щели или 50 мл центрифуговых труб, как описано выше.
    2. Поместите рыбу в обратный световой цикл, чтобы соответствовать ночному нересту обычным лабораторным рабочим часам. Используя систему безопасности потребительского класса на полке, следите за рыбой с помощью инфракрасного освещения, чтобы свести к минимуму помехи от удаленно подключенного ПК(рисунок 3).
    3. Рыба будет спонтанно нереста во время темного фотопериода примерно 24 ч после инъекции нерестового агента.
    4. Когда начинается нерест, собирать яйца ежечасно в то время как нерест поведение происходит. В B. brachyistius, собирать яйца с помощью малого диаметра сифон над тонкой сетки хлопка сетки, чтобы свести к минимуму ущерб свежевыращенных яиц. Соберите яйца B. gauderio из 50 мл центрифуговых трубок или танкового субстрата. Эффективно работайте с минимальными нарушениями нереста рыбы с помощью головной лампы с малоинтенсивным красным светом. Поскольку первое расщепление происходит примерно на 1 ч после оплодотворения (HPF), большая часть яйцеклеток будет подходить для микроинъекций одной клетки.
    5. Немедленно приступайте к микроинъекциям (см. раздел 5).
  4. Сожмите самцов для экстракорпорального оплодотворения B. gauderio.
    1. Подготовка сперматозоидов удлинитель раствор (SES), как описано в книге Зебрафиш54: 10 мм HEPES, 80 мм KCl, 45 мм NaCl, 45 мм натрия ацетат, 0,4 мм CaCl2, и 0,2 мм MgCl2.
      1. Используйте ddH2O, чтобы довести до объема и настроить рН до 7,7 с 1 M NaOH.
      2. Хранить в холодильнике.
      3. Фильтр через фильтр 0,22 мкм перед использованием.
    2. Анестезия рыбы в МС-222 (0,4 г/3 л) в течение нескольких минут, пока рыба не сможет сохранить свою осанку, не является неподвижным, но продолжает иметь оперкулярное движение (этап II53). Поместите 500 аликотов SES в лед.
    3. Сухие руки и рыба тщательно, особенно вокруг головы и вентиляции. Место вентральная сторона вверх, передняя влево (для правша лиц) в полистирола пены / губка держатель покрыты MS-222 пропитанной, влажное бумажное полотенце. Голова должна быть как можно более параллельной таблице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.4.4-4.4.6 должны быть сделаны как можно быстрее, а рыба должна быть из воды только в течение 30-60 с.
    4. Применить давление в каудальском к ростральной направлении с легким сжатием медиально над гонадами к жерлу. Рыба может изгнать отходы. Будьте осторожны, чтобы очистить вентиляцию с деликатной задачей протрите, если какие-либо отходы выбрасывается. Не собирайте отходы со спермой. В зависимости от размера самца, 10-60 ЗЛ является общим.
    5. Используя микропиптер с наконечником, тщательно собирать сперму, как это выдавливается из мужчины в 50 мл шагом. Поместите сперму непосредственно в 500 аликотов SES на льду. Это может быть полезно, чтобы другой исследователь помочь в сборе спермы в то время как другие сжимает. Сперма должна быть использована как можно скорее, но остается жизнеспособной, по крайней мере 1 ч.
    6. Сразу после сбора, положить рыбу в воду свежей системы для восстановления. Рыба должна быть из воды только в течение 30-60 с.
  5. Сожмите самок для экстракорпорального оплодотворения B. gauderio.
    1. Анестезия рыбы в МС-222 (0,4 г/3 л) в течение нескольких минут, пока рыба не сможет сохранить свою осанку, не является неподвижным, но продолжает иметь оперкулярное движение (этап II53). Поместите лист политетрафторотена на рабочую станцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 4.5.1-4.5.5 должны быть сделаны как можно быстрее, и рыба должна быть только из воды в течение 30-60 с.
    2. Сухие руки, инструменты, лист политетрафторотена и рыба тщательно, особенно вокруг головы и вентиляции. Поместите на бок с головой перед передней (для правша лиц).
    3. Применить давление в каудальском к ростральной направлении с легким сжатием медиально над гонадами к жерлу. Рыба может изгнать отходы. Будьте осторожны, чтобы очистить вентиляцию с деликатной задачей протрите, если какие-либо отходы выбрасывается. В зависимости от размера рыбы, 20-150 яиц является общим. Использование политетрафторетена покрытием шпатель / инструмент тщательно собирать яйца, как они выдавливаются из клоака. Быстро переместите яйца в небольшое блюдо Петри и накройте крышкой. Убедитесь, что яйца остаются сухими во время этого процесса. Кроме того, после сжатия, коснитесь яичной массы к основанию небольшой чашке Петри или к листу политетрафторотена, как они исключены из женщины.
    4. Сразу после сбора, положить рыбу в пресной системы воды для восстановления.
  6. Выполните оплодотворение яйцеклеток для экстракорпорального оплодотворения B. gauderio.
    1. Добавьте 100 л хорошо смешанной спермы в SES (см. шаг 4.4) непосредственно над яичной массой.
    2. Добавьте 1 мл системной воды (фильтруется через фильтр 0,22 мкм) и хорошо перемешайте по 30-60 с.
    3. Добавьте дополнительную воду системы 1-2 мл (оставьте некоторое место в чашке Петри) и поместите в инкубатор. Рекордное время ЭКО на чашке Петри и перейдите к инкубатору 29 градусов по Цельсию. Установите 50-минутный таймер, чтобы проверить ход развития (например, образование одной клетки на полюсе животных, см. Рисунок 6). За это время подготовьте материалы для микроинъекции.

5. Одноклеточная микроинъекция

  1. Потяните микроинъекционные иглы до инъекций нерестового агента (шаг 4.2) или естественного нереста (шаг 4.3). Используйте боросиликатный стеклянный капилляр с нитью (O.D. 1.0 мм, I.D. 0.58 мм, длина 10 см) и игольчатый выдвижной для вытягивания игл микроинъекционных игл. Подготовьте 2-4 иглы за запланированную инъекцию лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузочные иглы с нитью являются предпочтительными, потому что нить фитили решение к кончику и устраняет пузырьки. Тем не менее, иглы без нити могут быть использованы и фронт-загрузка не должна иметь никакого влияния на результат. Игла должна иметь длинный, но прочный конус. Используйте программу вытягивания иглы со следующими спецификациями в качестве отправной точки: тепло 500; Потяните 70; Скорость - 70; и время No 100. Репрезентативные морфологии иглы показаны на рисунке 5A.
  2. Подготовьте инъекционный раствор и подготовьте иглу.
    1. Добавьте 0,9 кЛ сгРНК и 0,9 л фермента Cas9 (1 мг/мл) до 0,2 л от 10% или 100% фенола красного (для 1% и 10% окончательной фенола красной концентрации, соответственно) в трубке ПЦР. Хорошо перемешайте и дайте сесть на лед 2х5 минут, чтобы сделать sgRNA и Cas9 сложными. Рассчитайте окончательную концентрацию сгРНК, Cas9 и фенола красного цвета в инъекционном растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть проблемы с иглой засорения или резки эффективности с помощью выше рецепта, это может быть полезно использовать 1x окончательной концентрации соли / буфера смесь для стабилизации Cas9 и предотвращения иглы засорения.
    2. Используйте наконечник пипетки микрозагрузчика, чтобы загрузить 2 злику раствора в иглу микроинъекций. Изгоните жидкость как можно ближе к кончику, как это возможно.
    3. Загрузите иглу в микроманипулятор и установите настройки давления (начните с 775 рi,0,1-0,2 с и 8-12 рс).
    4. Под прицелом, используйте пару тонких щипцы, чтобы сломать кончик иглы под скошенным углом. Перерыв туда, где конус иглы начинает иметь жесткость. Лучше всего, чтобы сломать ближе к кончику, проверить размер раствора инъекции, а затем разорвать дальше, если это необходимо. Отверстие иглы должно оставаться как можно меньше, сохраняя при этом жесткую конус(рисунок 5A).
    5. Используйте минеральное масло и микрометр для измерения размера раствора для инъекций. Обычно используется 1-2 нл; Диаметр 0,1 мм составляет 0,5 нл.
    6. Отрегулируйте наконечник иглы или настройки давления, чтобы получить объем инъекций в рамках спецификаций.
  3. Определите развивающиеся зиготы и подготовьте стадию инъекций. Настройка стадии инъекций. Возьмите 100 мм диаметром Петри блюдо. Перевернуть дно и поместить под перевернутый верх. Поместите стеклянный микроскоп слайд в перевернутой верхней части. В зависимости от того, как ваш микроманипулятор крепится к области, добавленная высота от перевернутой базы может оказаться ненужной.
    1. Посмотрите на развивающиеся яйца и определить предполагаемые оплодотворенные зиготы 50-60 мин после ЭКО. Полюс животного начнет формироваться и будет избыток мелких жировых капель вокруг желтока / животных клеточной интерфейс(рисунок 6).
    2. Соберите 10-20 яиц с как можно меньше воды, как это возможно с помощью пластиковой передачи пипетки (вырезать кончик немного, чтобы яйца пройти) и место на краю слайда. Вода будет злой под горкой и тянуть яйца к краю.
    3. Используйте деликатную задачу протрите и осторожно нажмите слайд, чтобы удалить избыток воды и позволить яйца твердо придерживаться края слайда. Там должно быть достаточно воды, чтобы держать яйца влажными, сохраняя мало стоя влаги, чтобы избежать движения яиц во время инъекции.
  4. Вводят непосредственно в одну ячейку.
    1. Выровнять яйца против слайда вертикально, перпендикулярно приближающейся иглы(рисунок 5B).
    2. Используя микроманипулятор, помещайте иглу против хориона. Под углом примерно 45 градусов вставьте иглу в хорион, а затем в одну клетку. Это может быть полезно, чтобы войти в одну клетку через желток. Перемещение как этап инъекции со свободной рукой и микроманипулятор может обеспечить больший контроль над процессом инъекции(Рисунок 5B).
    3. Введите sgRNA/Cas9/фенол красный раствор в одну клетку. Аккуратно снимите иглу. Приступить к следующему яйце и повторить шаги 5.4.1-5.4.3, пока все яйца вводят.
    4. Удалите любые яйца, разбитые во время инъекции с тонкими щипками. Используйте 0,22 мкм фильтроутой системной воды в бутылке шпристатель, чтобы аккуратно удалить яйца со стадии инъекции в новую тарелку Диаметром 100 мм.
    5. Повторите шаги 5.3.3-5.4.6 до тех пор, пока все яйца не будут введены или не развится в двухклеточную стадию. Убедитесь в том, чтобы выделить около 20 предполагаемых оплодотворенных яйцеклеток, как без инъекций контроля для определения темпов оплодотворения и инъекций успеха. Для больших сцеплений используйте неинъекционные эмбрионы, которые развились до двухклеточной стадии, а для небольших сцеплений откладывают предполагаемые оплодотворенные яйцеклетки.
    6. Кроме того, рассмотреть sgRNA / инъекции контроля путем введения 15-25 эмбрионов с Cas9 комплекс с sgRNA против гена, который не присутствует в геноме. Ген GFP рекомендуется для эмбрионов дикого типа. Запишите количество яиц, родителей, время ЭКО и дату на каждом блюде Петри. Включите цель sgRNA или ярлык как uninjected. Перейдите к инкубатору 29 градусов по Цельсию.

6. Муж по животным

  1. Уход за яйцами.
    1. Проверьте жизнеспособность яйцеклеток 4-6 ч после инъекций.
    2. Запись количество мертвых яиц, а также любые, которые не оплодотворены. Неоплодотворенные яйца будут арестовывать вокруг восьмиклеточной стадии и имеют рисунок розетки клеток на полюсе животных(рисунок 6). В зависимости от количества мертвых яиц и количества яичного мусора в воде, удалить по крайней мере 50%-80% воды и заменить фильтрованной воды системы. Это может быть полезно, чтобы вымыть дно чашки Петри, если клеточной пленки мусора или биопленки формы.
    3. В течение следующих 2-3 дней, проверить яйца 1-2x в день. Повторите шаги 6.1.2-6.1.3 каждый раз, когда яйца проверяются.
    4. Через 2–3 дня личинки вылупятся. Удалите все яичные оболочки, как они люк. Нежный пипетка может помочь освободить полувылупимых личинок.
  2. Уход за личинками.
    1. Проверяйте яйца в 1 х 2 раза ежедневно. Повторите шаги 6.1.2-6.1.3 каждый раз, когда личинки проверяются.
    2. От 6 до 14 DPF, кормить уксуса угрей для личинок. Небольшое избыток пищи хорошо, потому что уксус угрей останется в живых в блюдо. Добавить уксус угрей каждый раз, когда блюдо проверяется и очищается.
    3. От 11-14 DPF, добавить 5-10 свежевылупившихся Артемия на личинки в дополнение к уксусу угрей. За это время личинки научатся есть свободное плавание Артемия.
    4. В 15 DPF, переместить личинки в яичные чашки (см. раздел 6.2.5) в баке с проточной водой, фильтрации и аэрации. На чашку должно быть не более 25 эмбрионов. Яичные стаканчики пластиковые стаканчики с сеткой сетки на дне. 100 мм Петри блюдо сверху / дно могут быть добавлены в нижней части чашки яйца, чтобы помочь остановить пищу от падения через сетку. Яичные чашки позволяют рыбе быть размещены в большем объеме воды по причинам качества воды, сохраняя при этом дискретные группы. Продолжайте добавлять как уксус ные угри, так и 15-30 свежевылупившихся Артемия на личинки с 15–18 дней. Чистый Петри блюдо кусок ежедневно и использовать пипетку, чтобы удалить массы мертвых Артемия.
    5. С 18-30 дней корма только свежевылупившихся Артемия. Увеличьте количество кормления, как рыба растет, и если хвост кусаться видно.
    6. Примерно через 30 дней, переместить рыбу 10 L (2,5 галлона) танки, примерно 25 человек на танк. Убедитесь, что есть фильтрация, аэрация и места для укрытия. Рассмотрим цилиндрические биофильтрационные носители и ПВХ-трубки малого диаметра.
    7. Кормите свежевылупившихся Артемия и черных червей примерно 30-45 дней. Поддержание стандартной очистки и изменения воды для резервуара (т.е. как минимум 10%-20% изменения воды в 1 неделю).
    8. После 45 DPF, кормить только черные черви до 60 DPF.
    9. После 60 DPF, переместить когорты примерно 15 рыб до 40 L (10 галлонов) танки и начать взрослых процедур животноводства. Добавить ПВХ трубки и пряжи "швабра" (масса коричневой пряжи связаны друг с другом вокруг пробки) для укрытий(рисунок 3C). Рыба должна быть близка к размеру размножения (10–12 см) примерно через 3–4 месяца после оплодотворения.

7. Взрослый муж

  1. Кормите рыбу ежедневно с достаточным количеством черных червей, так что небольшое количество черных червей присутствуют при следующем кормлении. Это кормление ad libitum обеспечивает максимальный рост.
  2. Несколько раз в неделю, это может быть полезно для дополнения червя кормления с кровяными червями.
  3. Чистые резервуары каждые 2-4 недели с изменением воды на 20%-30%. Если пряжа швабра получает полный биопленки / водорослей, руб его чистой под ДРО воды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целевые объекты сгРНК были определены в пределах exon 1 scn4aa в обоих B. gauderio и B. brachyistius, как описано в разделе 1. СГРН были созданы, как описано в разделе 2. После успешного отбора и синтеза сгРНК(Рисунок 1),декольте в пробирке было протестировано(рисунок 2). SgRNAs демонстрируя в пробирке резки были затем выбраны для одноклеточных микроинъекций.

Взрослые рыбы были обусловлены для размножения (раздел 4.1), затем вводили нерестящимся агентом (раздел 4.2) и впоследствии сжали (B. gauderio) для ЭКО, как описано в разделе 4.4 или позволили нереститься естественным путем (B. brachyistius) как описано в разделе 4.3. Эти усилия дали одноклеточные эмбрионы для микроинъекций у обоих видов. Как описано в разделе 5, на одноклеточной стадии вводили 1,5-2,0 нл сек4аа sgRNA/Cas9/phenol red Complex (65-190 нг/уЛ sgRNA, 450 нг/uL Cas9, 1%-10% фенол красного цвета, конечные концентрации). Яйца из той же сцепления использовались в качестве неинъекционного элемента управления. Все эмбрионы были ухаживаны за тем, как описано в разделе 6. После ЭКО, 40%-90% яйцеклеток были оплодотворены, и 70%-90% эмбрионов выжили до вылупления после инъекции.

Около 75% рыбы дожили до 6-11 DPF и были затем фенотипом. Larval рыбы были помещены в 35 мм Петри блюдо встроенных в большую тарелку с Сильгард обездвиженных Ag / Cl записи электродов(рисунок 7A). Движение эмбрионов было ограничено с использованием 3% агарозных форм, сделанных с системной водой и вырезанными, чтобы соответствовать эмбриону(рисунок 7B). Одна и та же камера записи использовалась для обоих видов, и одна и та же агарозная плесень использовалась среди видововых сравнений. Эмбрионы были записаны на 60 с, что достаточно, чтобы захватить сотни EODs. Для сравнения были выбраны возрастные и размерные неинъекционные элементы управления. На данный момент, 10%-30% выживших эмбрионов показывают снижение амплитуды EOD. Эмбрионы, демонстрирующие уменьшение амплитуды EOD без каких-либо явных морфологических дефектов и контроля невведенных целых эмбрионов были переварены для экстракции ДНК и последующего ПЦР целевого участка scn4aa. Существовал часто диапазон penetrance фенотипа, с некоторыми лицами, имеющих более сильное снижение амплитуды EOD, чем другие.

После очистки пЧР и клонирования, 30 клонов из каждого эмбриона были выбраны для секвенирования Сэнгера. CRISPR/Cas9 индуцированных мутаций были выявлены в B. gauderio (Рисунок 8A,B) и B. brachyistius (Рисунок 9A,B) лиц с сильным снижением амплитуды EOD (Рисунок 8C и Рисунок 9C соответственно), где неинъекционные элементы управления имели только эталонные генотипы. Визуализация амплитуды EOD между подтвержденными мутантами ("CRISPR") и возрастом/размером, соответствующим неинъекционным элементам управления, показала, что оба scn4aa-мутанта B. brachyistius (рисунок 10A)и B. gauderio (рисунок 10B ) эмбрионы имели значительно более низкую амплитуду EOD, чем элементы управления (p qlt; 2.2 x 10-16, Уэлч два образца t-тест). CRISPR/Cas9 ориентации scn4aa был успешным в обоих B. brachyistius и B. gauderio и вовлечения scn4aa в личинки / ранний электроцит разряда в обоих видов.

Figure 1
Рисунок 1: синтез шаблона и транскрипции шаблонов sgRNA. (A) Гель изображение синтеза шаблона sgRNA. Этикетки соответствуют различным sgRNA для myod (MYO2, MYO1) и три sgRNA для scn4aa (S1-S3). После аннулирования олигомеров, вырабатывается шаблон в 120 bp. (B) Гель изображение транскрипции sgRNA для трех sgRNAs для B. gauderio (bg2017) и два для B. brachyistius (bb2016, 2017). SgRNA будет отображаться как две полосы из-за вторичной структуры и будет между 50-150 bp при использовании dsDNA лестницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель гель изображение успешного (sg1) и неудачных (sg2) в пробирке CRISPR анализы. Эквивалентное количество шаблона без компонентов CRISPR отображается в полосе scn4aa. Обратите внимание на дубликатполос в sg1, которые показывают, что резка произошла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Установки цистерн для слабо электрических рыб. (A) Схема типичная установка для беспроводного видеомониторинга нерестового поведения. Три коммерчески доступные камеры видеонаблюдения (Swann, Inc.), способные производить инфракрасный свет, направлены на верхнюю часть воды и подключены к цифровому видеорегистратору (DVR). Видео отслеживается в режиме реального времени для нереста поведения в соседней комнате с подключенного к сети компьютера (ПК). (B) Нерестовое поведение, захваченное с такой установкой в B. brachyistius. (C) Типичная установка разведения для B. gauderio с ПВХ прячет трубки и пряжи швабры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Разведение самцов и самок. (A) B. brachyistius и (B) B. gauderio. Оба вида сексуально диморфны и легко различимы визуально, когда сексуально зрелые. Обе женщины gravid в этих фотографиях, демонстрируя характерно опухшие животы, которые полны спелых яиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Микроинъекция. (A) Стеклянные капиллярные кончики иглы должны быть сломаны, чтобы доставить соответствующий объем микроинъекций. Наконечник слева непрерывный. Средние и правые кончики сломаны слегка угловой скосал, чтобы проколоть яичный хорион. (B) Яйца выложены против стеклянной горки (1%-10% фенол красный включен в качестве трассировщика для визуализации доставки инъекции) и вводят со стеклянными капиллярными иглами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Этапы развития. (A) B. gauderio и (B) B. brachyistius. Все яйца предполагается оплодотворенные и развитие контролируется до 24 HPF. В жизнеспособных яйцеклетках видны эмбрионы HPF от 12 до 24 гг., в противном случае яйца демонстрируют деградацию. Несколько отделов, как представляется, происходят на активации яйцеклеток, независимо от оплодотворения. Неоплодотворенные яйца демонстрируют необычные модели расщепления, которые гораздо более симметричны в оплодотворенных яйцеклетках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Фотография личиночной камеры записи, используемой в данном исследовании. (A) Электроды встроены в Sylguard, но распространяются на 35-мм блюдо, содержащее эмбрион ограничен оформить через 3% агарозной плесени. (B) Высшее увеличение изображения подчеркнув ограниченное движение эмбриона из-за агарозы. Обратите внимание на кусочки агарозы, которые могут быть удалены, как эмбрион изменения размера. B. gauderio эмбрион сталкивается с положительным электродом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: CRISPR/Cas9 индуцированных мутаций в B. gauderio(A) Тридцать две последовательности клонов из геномной ДНК Cas9 индуцированных мутаций в одном scn4aa целевых F0B. gauderio эмбриона (11 DPF). Ссылка последовательность подчеркивается с sgRNA целевой сайт выделен в серый цвет, протосканер-прилегающих мотив (PAM) последовательность выделена красным цветом, и Cas9 вырезать сайт отмечен "Я". Приводится изменение от ожидаемой последовательности дикого типа и количество клонов для каждой последовательности дается в скобках. (Аббревиативы: вставка, - удаление, и индель) Любые не-CRISPR связанных последовательности различия смелые. Рисунок, смоделированный по образцу Jao et al.60. (B) Аминокислота последовательность предсказал от последовательности клонов scn4aa нокдаун B. gauderio от (A). Cas9-индуцированные изменения от последовательности типа одичалые выделены в красном цвете и нуклеотид-индуцированное номер изменения дается. (C) Двадцать-секундные электрические записи из пяти размеров соответствующих личинок, все записаны 6 DPF в той же камере записи. Настройки усиления идентичны для всех следов. Следы в красном цвете взяты из личинок B. gauderio с подтвержденными мутациями (один человек показан на рисунке 8A, B выше), следы в черном от неинъекционных личинок B. gauderio. В целом, CRISPR/Cas9 редактирования scn4aa показали снижение амплитуды EOD, хотя эффект был неоднородным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: CRISPR/Cas9 индуцированных мутаций в B. brachyistius(A) Сорок две последовательности клонов из геномной ДНК Cas9 индуцированных мутаций в одном scn4aa целевых F0B. brachyistius эмбриона (11 DPF). Ссылка последовательность подчеркивается с sgRNA целевой сайт выделен в серый цвет, протосканер-прилегающих мотив (PAM) последовательность выделена красным цветом, и Cas9 вырезать сайт отмечен "Я". Приводится изменение от ожидаемой последовательности дикого типа и количество клонов для каждой последовательности дается в скобках. (Аббревиативы: вставка, - удаление, и индель) Любые не-CRISPR связанных последовательности различия смелые. Рисунок, смоделированный по образцу Jao et al.60. (B) Аминокислота последовательность предсказал от последовательности клонов из scn4aa нокдаун B. brachyistius в (A). Cas9-индуцированные изменения от последовательности дикого типа выделены красным цветом и нуклеотид индуцированного номера изменения дается. (C) Десять вторых электрических записей из четырех размеров соответствующих личинок, все записаны 10 DPF в той же камере записи. Настройки усиления идентичны для всех следов. Следы в красном от B. brachyistius личинок с подтвержденными мутациями (один человек показано в A, B выше), следы в черном от невведенных B. брахистий личинок. В целом, CRISPR/Cas9 редактирования scn4aa показали снижение амплитуды EOD, хотя эффект был неоднородным. Перевернутые EODs от рыбы изменения ориентации во время записи. Несмотря на это, нет различий между экспериментальной рыбой и элементами управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: Box участки среднего EOD амплитуды CRISPR и невводили размер / возраст соответствует братьев и сестер. (A)ЭОД амплитуда b. brachyistius личинок на 10 DPF. Записано с увеличением 100, CRISPR n no 56 EODs от двух лиц, uninjected n no 114 EODs от трех индивидуалов. (B) ЭОД амплитуда b. gauderio личинок на 6 DPF. Записано с увеличением 500, CRISPR n no 34 EODs от двух лиц, uninjected n no 148 EODs от трех индивидуалов. Амплитуда рыбы CRISPR была значительно меньше, чем неинъекционные элементы управления (p qlt; 2.2 x 10-16, Уэлч два образца t-тест). Все люди были записаны с камерой записи, описанной на рисунке 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Описание Последовательности
Постоянный олигомер 5'-AAAAGCGCGCGGTGCCACTTTtCAAGTGATAACGGACTAGCCTttTTTTTTAACTTGC TATTTTTTTTAAC
Целевой олигомер ный костяк (GG-N18, не PAM) 5'-TAATACGACTACTACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
Целевой олигомер ный костяк (N20, не PAM) 5'-TAATACGACTACTACTATAG-N20-GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
Бриеномирус брахистий
scn4aa Bb sgRNA цель (N18, с PAM): 5'-TCTTCCCCCCTTCAC- 3'
Scn4aa Bb sgRNA олигомер (GG-N18): 5'-TAATACGACTACTACTATAGG TCTTCCCCTCACCA GTTtTAGAGCTAGAAAATAGCAA-3'
scn4aa Bb PCR грунтовка (218 bp)
Scn4aa-bb-exon1-F: 5'-ATGGCCCCCCTCTCAATAA-3'
Scn4aa-bb-exon1'R: 5'-TCTTCCAGGGGAATATCATCATAACT-3'
Брахигипомс гаудерио
Scn4aa Bg sgRNA цель (N17, с PAM): 5'- CAAGAAGGATTGGAGG-3'
Scn4aa Bg sgRNA oligomer (GG-N17): 5'-TAATACGACTACTACTATAGG CAAGAAGGATTTGG GTTttagAGCTAGAAAATAGCAA-3'
Scn4aa Bg PCR грунтовая пара (204 bp)
scn4aa-bg-exon1-F: 5'-CGCCTGTCCCCTCAG-3'
scn4aa-bg-exon1-R: 5'-ATCTTCAGGTGGCTCTCTCTCTAT-3'

Таблица 1: Олигонуклеотиды, необходимые для протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фенотипическое богатство слабоэлектрической рыбы, наряду с недавним распространением ресурсов геномики, мотивирует острую потребность в функциональных геномных инструментах в слабо электрической модели рыб. Эта система особенно привлекательна из-за конвергентной эволюции многочисленных фенотипических признаков в параллельных линиях рыб, которые легко хранятся в лаборатории.

Описанный здесь протокол демонстрирует эффективность метода CRISPR/Cas9 в линиях слабо электрических рыб, которые развивались электрогенезом и электроприемником параллельно, и поэтому представляет собой важный шаг для решения обещания этой модели будущая работа в сравнительной геномике фенотипической эволюции.

Этот простой методологический подход требует только базовых навыков молекулярной биологии и подготовки, после базового принятия протокола Ганьон38, широко используется для зебры. Стоит отметить, что по мере развития технологий, Есть больше коммерческих комплектов для производства sgRNA, а также компаний, которые могут синтезировать руководство РНК, что делает этот протокол более доступным для лабораторий, которые не имеют опыта молекулярной биологии и оборудования. Сначала мы отмечаем, что высокая эффективность мутагенеза позволяет прямо проводить фенотипизирование инъекционных личинок. Тем не менее, существует значительная степень фенотипической мозаики, которая не является редкостью и согласуется с литературой41,42,43,44. Например, в этом исследовании scn4aa, некоторые люди, несущие мутации выставлены гораздо больше амплитуды EODs, чем другие, которые были сравнительно молчание(Рисунок 7, Рисунок 8). В настоящее время неясно, сколько из этих мутаций переносятся в зародышную линию. Ближайшие будущие усилия будут направлены на создание стабильных линий мутантов.

Использование NHEJ путь для нокаутов является лишь одним из нескольких потенциальных приложений CRISPR / Cas9 редактирования генов: методы, изложенные здесь являются ступенькой для более продвинутых приложений55,56. Будущие усилия должны быть направлены на разработку совместно впрыснутых шаблонов донора ДНК с комплексом sgRNA/Cas9. Эта простая модификация будет использовать эндогенные механизмы ремонта на основе шаблонов (т.е. гомология направлена ремонт, или HDR) и позволяют точные стук-модули. Хотя HDR происходит с более низкой эффективностью, чем NHEJ подходов, прогресс был достигнут для повышения его эффективности57,58. Это снижение эффективности потребует усилий по оптимизации дизайна шаблона донора ДНК/CRISPR/Cas9, повышению эффективности эндогенных механизмов ремонта и увеличению производства эмбрионов (см. ниже). Если этот вопрос эффективности может быть решен, knockins могут быть использованы для добавления флуоресцентных тегов, выразить мутировавшую форму гена продукта, или изменить промотор или усилитель последовательностей.

В то время как молекулярная биология, лежащая в основе этой техники, довольно проста, требования к животноводству являются существенными, но не непреодолимыми. B. gauderio широко доступны и размножаются достаточно быстро для любой исследовательской программы, чтобы иметь колонию в возрасте до года. В отличие от этого, B. brachyistius развивается медленно, и анатомические особенности доказали попытки ЭКО до сих пор безуспешны. Другие, более крупные виды, такие как Campylomormyrus59, могут быть более благоприятными для такого подхода. Для B. brachyistius,все инъекционные эмбрионы были собраны с использованием естественного нереста подход, который является значительно более трудоемким. Будущие усилия по повышению эффективности В. брахистиуса ЭКО позволят повысить урожайность эмбрионов для вопросов эффективности, описанных выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают героические усилия Моники Лукас, Кэтрин Шоу, Райана Тейлора, Джареда Томпсона, Николь Робишо и Хоуп Хили за помощь в размножеству рыб, сборе данных и разработке раннего протокола. Мы также хотели бы поблагодарить трех рецензентов за их предложения по рукописи. Мы считаем, что конечный продукт будет лучшего качества после рассмотрения их замечаний. Эта работа была профинансирована за счет поддержки Со стороны Национального научного фонда #1644965 и #1455405 JRG, а также Грант Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям DG для VLS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344, (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167, (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20, (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14, (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, Pt 10 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7, (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387, (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. Neural Nets in Electric Fish. (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114, (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109, (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62, (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, Pt 6 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34, (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216, (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212, (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, Pt 11 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58, (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14, (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1, (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. (2017).
  29. Futuyma, Evolution. Third Edition. Sinauer Associates Inc. (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31, (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26, (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10, (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9, (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32, (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12, (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445, (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393, (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199, (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G. Encyclopedia of Animal Behavior. Breed, M. D., Moore, J. 1, Academic Press. 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. Springer. 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32, (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17, (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31, (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. Univ. of Oregon Press. (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34, (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9, (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33, (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 3 Pt B 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, (34), 13904-13909 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics