En macrophage reporter cell assay att undersöka Toll-liknande receptor-medierad NF-kB/AP-1 signalering på adsorberat protein skikt på polymera ytor

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll ger forskare en snabb, indirekt metod för mätning av TLR-beroende aktivitet av transkriptionsfaktorn NF-кB/AP-1 i en murin makrofag-celllinje som svar på en mängd polymera ytor och adsorberade protein skikt som modellerar mikromiljön med biomaterial implantat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den ihållande inflammatoriska värd svar på en implanterad biomaterial, känd som den främmande kroppen reaktion, är en betydande utmaning i utvecklingen och genomförandet av biomedicinska enheter och vävnad Engineering konstruktioner. Makrofager, en medfödd immun cell, är viktiga aktörer i den främmande kroppen reaktion eftersom de finns kvar på implantatplatsen för livslängden på enheten, och är vanligen studeras för att få en förståelse för denna skadliga värd svar. Många biomaterial forskare har visat att adsorberade protein skikt på implanterade material påverka makrofagbeteende, och därefter påverka värd svaret. Metoderna i detta dokument beskriver en in vitro-modell med hjälp av adsorberade protein skikt som innehåller cellulära skador molekyler på polymer biomaterial ytor för att bedöma makrofag svar. En NF-кB/AP-1 reporter makrofager cellinjer och den tillhörande kolorimetriska alkaliska fosfatasanalysen användes som en snabb metod för att indirekt undersöka aktiviteten av transkriptionsfaktorn NF-кB/AP-1 som svar på komplexa adsorberade protein skikt som innehöll blodproteiner och skadeassocierade molekylära mönster. som modell av komplexa adsorberade protein skikt bildade på biomaterial ytor in vivo.

Introduction

Den främmande kropp reaktionen (FBR) är en kronisk värd svaren så pass kanna negativ påverka den utförande av en implanterat material eller anordning (e.g., läkemedel leveransen anordningen, bio sensoren), igenom den ihållande frige av upphetsande medlare och vid hindra integrationen emellan den implanterat material och den omgivande vävnad1. Detta medfödda immunsvar initieras av implantation förfarandet och kännetecknas av den långsiktiga närvaron av medfödda immunceller och fibrösa kapselbildning runt implantatet1. Inom ramen för material värd svar, makrofage-material interaktioner har en betydande inverkan på utvecklingen av värd svar och utveckling av en FBR1. Makrofager är en diversifierad medfödda immunceller population, rekryteras till implantatstället antingen från vävnad bosatt makrofagpopulationer eller från blodet som monocyte-härledda makrofager. De börjar ackumuleras på implantatstället strax efter implantation, och inom några dagar bli den dominerande cellpopulationen i implantatet microenvironment. Material-anhängare makrofager, tillsammans med främmande kropp jätteceller (fbgc) bildas genom makrofagfusion, kan kvarstå på materialets yta för livslängden på implantatet2,3. Följaktligen, makrofager anses vara viktiga aktörer i den främmande kroppen svar på grund av deras roller Iscensätt de karakteristiska stegen i FBR: akut inflammatorisk reaktion, vävnad remodeling, och bildandet av fibrotisk vävnad1.

Toll-liknande receptorer (TLRs) är en familj av mönsterigenkänning receptorer som uttrycks av många immunceller, inklusive makrofager, och har visat sig spela en viktig roll i inflammation och sårläkning. Förutom patogen-härledda ligander, TLRs kan binda endogena molekyler, känd som skador-associerade molekylära mönster (DAMPs), som frigörs under cell nekros och aktivera inflammatoriska signalering vägar som resulterar i produktionen av proinflammatoriska cytokiner4. Vi och andra har föreslagit att skador som uppkommit under mjuk vävnad biomaterial implantation förfaranden release damps, som sedan adsorberas till biomaterial ytor förutom blodproteiner och modulera efterföljande cell-material interaktioner5,6. När makrofager interagerar med adsorberat protein skikt på ett implantat, deras yta TLRs kan känna igen adsorberade DAMPs och aktivera proinflammatoriska signalering kaskader, vilket leder till NF-κB och AP-1 transkription faktor aktivering och produktion av proinflammatoriska cytokiner. Vi har tidigare visat att murina makrofager har signifikant ökad NF-κB/AP-1 aktivitet och tumörnekrosfaktor α (TNF-α, proinflammatorisk cytokin) sekretion som svar på fuktig-innehållande adsorberat protein skikt på en mängd olika polymera ytor jämfört med ytor med adsorberat serum eller plasma endast (dvs inga DAMPs närvarande), och att detta svar är till stor del förmedlas av TLR2, medan TLR4 spelar en mindre roll5.

NF-κb/AP-1 reporter makrofager cellinjer (tabell över material) som används i detta protokoll är en bekväm metod för att mäta relativ NF-κb och AP-1 aktivitet i makrofager5,7,8. I kombination med TLR väg hämmare, denna cell linje är ett användbart verktyg för att undersöka TLR aktivering och dess roll i inflammation som svar på en mängd olika stimuli5,7,8. Reportern celler är en modifierad mus makrofage-liknande cellinjer som stabilt kan producera utsöndras embryonala alkaliska fosfatas (SEAP) vid NF-κB och AP-1 transkriptionsfaktor aktivering9. Den kolorimetriska enzymatiska alkaliska fosfatasanalys (tabell över material) kan sedan användas för att kvantifiera relativa mängder av Seap uttryck som ett indirekt mått på NF-κb/AP-1 aktivitet. Eftersom NF-κB och AP-1 är nedströms från många cell signalvägar, neutraliserande antikroppar och hämmare riktade till specifika TLRs (t. ex., TLR2) eller TLR adapter molekyler (t. ex. MyD88) kan användas för att kontrollera rollen av en viss väg. Den metod som beskrivs i denna artikel ger en enkel och snabb metod för att bedöma bidraget av TLR signalering i murina makrofag svar på en mängd polymera ytor med adsorberat protein skikt som innehåller både blodproteiner och damps som en in vitro-modell av implanterade biomaterial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. media och REAGENSBEREDNING

  1. Förbered fibroblast media. Kombinera 450 mL av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM), 50 mL av foster bovint serum (FBS), och 5 mL av penicillin/streptomycin. Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
  2. Förbered reportern makrofagtillväxtmedia i 50 mL-aliquoter. Kombinera 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/mL Mycoplasma elimination reagens (tabell över material) och 200 μg/ml phleomycin D1 (tabell över material). Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
  3. Förbered reporter makrofag assay media i 50 ml alikvoter. Kombinera 45 mL DMEM, 5 mL Värmeinaktiverade FBS (HI-FBS), 5 μg/mL Mycoplasma elimination reagens och 200 μg/mL phleomycin D1. Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.

2. beläggning cell kultur ytor med poly (metylmetakrylat)

  1. Lös upp poly (metylmetakrylat) (PMMA) i kloroform vid 20 mg/mL (t. ex. 100 mg PMMA i 5 mL kloroform) i en 20 mL glas scintillationskampull. Placera en magnetisk rör bar i flaskan och låt röra om i minst 2 h, tills alla fasta ämnen löses upp.
    Försiktighet: Kloroform är skadligt vid inandning. Se till att använda lösningsmedel i en draghuv medan du bär PVA-handskar.
  2. Pipettera över 400 μL PMMA-lösning på mitten av ett glas Mikroskop i borosilikatglaset i en spinn-coater och snurra med 3000 rpm i 2 minuter. Förbered det antal bilder som krävs för analysen, samt 3 − 5 extra för mätning av vattenkontakt vinkel. Förvara diabilder i en ren låda (sprayas och torkas med 70% etanol) för framtida bruk.
    Anmärkning: Spin beläggning används ofta för att sätta in en tunn, enhetlig beläggning på en plan yta. En spin bestrykare roterar ett substrat vid höga hastigheter, med hjälp av centrifugalkraft för att sprida beläggnings lösningen över ytan.
    1. Mät vattenkontakt vinkel vid två slumpmässiga positioner på ytan av extra belagda diabilder (dvs inte de bilder som används för cellkultur) med en goniometer för att säkerställa glasytan var helt belagd med polymeren.
      Anmärkning: Endast vatten av högsta renhet (t. ex. glas Triple destillerat) bör användas för vattenkontakt vinkel mätningar.
  3. I ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC) bifoga 8-kammare klibbiga brunnar till PMMA belagda-glider med hjälp av sterila pinpett och efter aseptisk teknik. Tryck hårt på toppen av den klibbiga brunnar för att se till att de är starkt knutna. Inkubera bilderna med bifogade klibbiga brunnar vid 37 ° c över natten för att säkra tätningen.
    1. Testa tätningen av de klibbiga brunnarna genom att tillsätta 200 μL cell odlings grad (endotoxin-fritt) vatten till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur (RT) för 60 min och säkerställ inget läckage innan du fortsätter. Sug upp vattnet och var noga med att inte störa PMMA-beläggningen.
  4. Utför endotoxin-fritt vatten tvättar genom att tillsätta 300 μL av endotoxin-fritt vatten till varje brunn och inkuberande för 1 h (tre gånger), 12 h, och 24 h före användning för att avlägsna eventuella kvarvarande lösningsmedel.
  5. Test endotoxin koncentrationen av de diabilder som skall användas för cellodling. Inkubera 200 μL endotoxin-fritt reagensvatten (tabell över material) i en brunn på varje bild i 1 h. Mät endotoxin koncentrationen i extraktet med hjälp av en Endpoint kromogen endotoxin analys (tabell över material).
    Anmärkning: Följande protokoll är specifikt för endotoxin assay kit som anges i tabellen av material.
  6. Använd endast vatten och förbrukningsartiklar (t. ex. pipettspetsar, mikrocentrifugrör och bra plattor) som är certifierade pyrogenfria (dvs. endotoxin-fria) för detta arbete. Dessutom bör alla glas som används i beredningen av polymerbelagda ytor depyrogenated med hjälp av torr värme sterilisering (250 ° c i 30 min) före användning10. Mätning av endotoxin i extrakt lösningen, som beskrivs här, kan resultera i en underskattning av endotoxin på materialets yta11,12. Det rekommenderas därför att vid utveckling av ett polymerbeläggnings protokoll utföra endotoxinanalysreaktionen (dvs. steg 2.5.4 − 2.5.6 för prov prov [reagensvatten] eller spik kontroller) direkt i brunnar som innehåller det belagda provet för att säkerställa att inga källor till endotoxin oavsiktligt förs in i systemet under beläggningsprocessen.
    1. Ta med alla testprover (t. ex. extrakter) och reagenser för endotoxanalys till RT. Rekonstituera kromogenreagens i analysbuffert och endotoxin standard i reagensvatten, låt den lösas upp i 5 min och försiktigt snurra innan du använder. Täck alla flaskor med paraffin film när de inte används.
    2. Skapa en 5 − 8-punktstandardutspädnings kurva för endotoxin som sträcker sig från den nedre till den övre gränsen för analysen genom att utföra en seriell utspädning av endotoxinhalten i reagensvatten.
    3. För att kontrollera för förbättring eller hämning av endotoxin analysen i prover, förbereda en positiv kontroll (även kallad en Spike kontroll eller spetsiga prov) genom att späda en känd mängd endotoxin i oanvänt test provlösning.
      Anmärkning: Koncentrationen av den positiva kontrollen bör vara samma koncentration som en standard i mitten av standardkurvan. Om det återvunna beloppet av endotoxspetsen (dvs. koncentrationen av den positiva kontrollen minus koncentrationen av det ej spikade provet) ligger inom 50 − 200% av den nominella koncentrationen av endotoxspetsen, kan extraktionslösningen anses inte påtagligt störa analysen.
    4. Lägg till 50 μL av standarder, prover eller Spike kontroller till varje brunn av en 96-bra tallrik i två eller tre exemplar. Använd reagensmedels vatten som en negativ kontroll.
    5. Tillsätt 50 μL kromogent reagens till varje brunn. Tillsätt snabbt reagens till alla brunnar. Använd en timer för att registrera hur mycket tid det tar att lägga till reagens i alla brunnar. Täck plattan med en självhäftande tätning och inkubera vid 37 ° c (inkubationstiden är mycket beroende och anges på analysintyg som ingår i kromogena reagenssatsen). Alternativt, kontrollera på plattan var 15 min under inkubering tills färgförändring observeras i alla standard brunnar.
    6. Tillsätt 25 μL 50% ättiksyra i varje brunn efter inkubering (slutlig koncentration på 10% ättiksyra per brunn) för att stoppa reaktionen. Tillsätt ättiksyra i samma ordning som den kromogena reagensen lades till. Läsplattans absorbans med en Plattläsare vid 405 nm. Aspirera vätska och kassera plattan.
      Anmärkning: Ättiksyra tillägg bör ta lika lång tid att lägga till varje brunn som kromogen reagens tog (± 30 s).
  7. Ultraviolett (UV) sterilisera bilderna i 30 min före cellodling experiment.

3. beläggning cell kultur ytor med Polydimetylsiloxan

  1. Blanda Polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer i ett 10:1 viktförhållande (bas: härdningsmedel). I ett biologiskt säkerhetsskåp, Pipettera ca 10 mL polydimetylsiloxanbas i ett sterilt rör. Väg röret och tillsätt långsamt härdnings medlet tills 10% har tillsatts.
    Försiktighet: Använd PDMS-reagens på ett väl ventilerat område och Undvik ögonkontakt genom att bära skyddsglasögon.
  2. Blanda elastomeren noggrant genom att röra om med en steril serologisk pipettspets och Pipettera upp och ner. Tillsätt cirka 200 μL av lösningen till varje brunn på en 48-brunn-platta. Luta väl plattan långsamt för att säkerställa fullständig täckning av brunnar med elastomerlösning.
  3. Placera brunnen plattan med elastomer i en vakuumugn inställd på 50 cmHg, 40 ° c. Ta bort locket och locket med en enda skikt torka för att förhindra att annat skräp faller in i brunnarna. Låt Inkubera i minst 48 h.
    1. Kontrollera att brunnarna är helt belagda via visuell inspektion. Se till att elastomeren är helt botad genom att försiktigt prodding med en steril pipett spets innan du tar bort.
  4. Tillsätt 300 μL 70% etanol (tillverkat med absolut etanol och endotoxin-fritt vatten) och inkubera vid RT för 1 h. ta bort etanol och utför endotoxin-fri vatten tvättar genom att tillsätta 300 μL av endotoxin-fritt vatten till varje brunn och inkuberande för 1 h (tre gånger), 12 h och 24 timmar före användning för att avlägsna eventuellt kvarvarande lösningsmedel.
    1. Inkubera 200 μL av endotoxin-fritt vatten i tre brunnar på varje platta i 1 h. Mät endotoxin koncentrationen av vattenextrakt med hjälp av en Endpoint kromogen endotoxin analys (steg 2.5.1 − 2.5.6).

4. beläggning cell kultur ytor med fluorerade poly (tetrafluoreten)

  1. Gör en 1 mg/mL lösning av fluorerad poly (tetrafluoreten) (fPTFE) (t. ex. Tillsätt 10 mg fPTFE till 10 mL fluorerad spädningsvätska [tabell över material]) i en 20 ml glas scintillationsflaska. Placera en magnetisk rör bar i injektionsflaskan och låt röra i minst 24 h, tills alla fasta ämnen löses upp.
  2. Tillsätt cirka 150 μL av polymerlösningen till varje brunn av en polystyren 48-brunn-platta (dvs. inte vävnadskultur behandlad). Luta väl plattan långsamt för att säkerställa fullständig täckning av alla brunnar med polymerlösning. Sätt tillbaka locket.
    1. För att säkerställa effektiv fPTFE-beläggning av brunnar, bör glas täckband vara belagda i fPTFE och används för vattenkontakt vinkelmätning (steg 4.3.1). Placera täckglas inuti brunnarna på en 24-brunnsplåt. Tillsätt cirka 400 μL av polymerlösningen till varje brunn som innehåller en täckslip. Skjut täckplattorna ner med hjälp av sterila pinpett, se till att de är helt täckta i polymerlösning, och täcka brunnen plattan med ett lock.
  3. Placera brunnen plattan med polymerlösning och/eller täckglas i en vakuumugn inställd på 50 cmHg, 40 ° c. Ta bort locket och locket med en enda skikt torka för att förhindra att annat skräp faller in i brunnarna. Låt Inkubera i minst 48 h.
    1. Mät vattenkontakt vinkel av fPTFE-belagda täckband med en goniometer för att säkerställa en effektiv beläggning.
      Anmärkning: Endast vatten av högsta renhet (t. ex. glas Triple destillerat) bör användas för vattenkontakt vinkel mätningar.
  4. Tillsätt 300 μL 70% etanol (tillverkat med absolut etanol och endotoxin-fritt vatten) och inkubera vid RT för 1 h. ta bort etanol och utför endotoxin-fri vatten tvättar genom att tillsätta 300 μL av endotoxin-fritt vatten till varje brunn och inkuberande för 1 h (tre gånger), 12 h och 24 timmar före användning för att avlägsna eventuellt kvarvarande lösningsmedel.
    1. Inkubera 200 μL av endotoxin-fritt vatten i tre brunnar på varje platta i 1 h. Mät endotoxin koncentrationen av vattenextrakt med hjälp av en Endpoint kromogen endotoxin analys (steg 2.5.1 − 2.5.6).
  5. UV sterilisera brunnen plattorna för 30 min före cellodling experiment.

5. göra lysate från 3T3 celler

  1. Odla 3T3 celler i flera T150 kolvar till 70% Confluence. För att lossa celler, aspirera media, tvätta ytan med 5 mL PBS och aspirera PBS. Tillsätt 5 mL animaliskt ursprung fritt, rekombinant cell dissociation enzym (tabell över material) och inkubera vid 37 ° c i 3 − 5 min.
  2. Lossa cellerna genom att försiktigt luta kolven fram och tillbaka. Tillsätt 5 mL PBS för att neutralisera det rekombinanta enzymet som används för cell dissociation. Överför de fristående cellerna från kolvar till ett centrifugeringsrör och blanda via pipettering. Utför en levande cell räkna med hjälp av en hemocytometern och cell livskraftig färg.
    Anmärkning: En cell dissociation enzym som kan neutraliseras genom utspädning i PBS valdes för att undvika införandet av serum-baserade proteiner i lysate preparatet. Om trypsin används för att separera celler, det bör neutraliseras med en serum-innehållande lösning, och en extra PBS tvätta bör utföras för att minska mängden av serumproteiner transporteras över till lysate preparatet.
  3. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna i ursprunglig volym (D.v.s. 10 ml x antal flaskor) av PBS för att tvätta bort kvarvarande material. Upprepa.
  4. Centrifugera cellerna igen vid 200 x g i 5 min och Aspirera supernatanten. Tillsätt den volym PBS som krävs för att uppnå en slutlig cell koncentration av 1 x 106 celler/ml. Placera cellen lösningen i en-80 ° c frys tills provet är helt fryst (minst 2 h).
  5. Thaw cell lösning i en 37 ° c vattenbad. När helt tinat, placera lösningen tillbaka i-80 ° c frys tills helt fryst. Upprepa för totalt 3 frys-Tina cykler.
  6. Utför en mikrobicinchoninic syra (BCA) analys på cellen lysate vid olika utspädningar (t. ex., 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) för att bestämma protein koncentrationen. Späd cellen lysate till en proteinhalt på 468,75 μg/mL, alikvot, och förvara vid-80 ° c för framtida bruk.
    Anmärkning: Slutlig proteinkoncentration i en 48-brunn plattan är 125 μg/cm2 (baserat på ytan av en brunn, 0,75 cm2).
  7. Utför en Western blot för att bedöma förekomst av DAMPs i lysate (t. ex. värme chock protein 60 [HSP60], hög rörlighet grupp Box 1 [HMGB1]) genom att lasta 40 − 60 μg lysat protein i lastbuffert på en 1,5 mm tjock 10% polyakrylamidgel och följ standard Western blot Förfaranden.

6. bedöma effekten av adsorberade protein skikt och Toll-liknande receptorer på NF-κB aktivitet av makrofager

Anmärkning: För en schematisk bild av det experimentella arbetsflödet och plattlayouten, se figur 1a och kompletterande figur 1.

  1. Grow reporter makrofager i en lämplig storlek kolv till 70% Confluence. Aspirera media, tvätta ytan med PBS och aspirera PBS. Tillsätt det rekombinanta cell dissociationsenzymen och inkubera vid 37 ° c i 8 minuter.
  2. Lossa cellerna genom att trycka hårt på kolvens sidor. Inaktivera rekombinant cell dissociation enzym genom att lägga till en lika volym av tillväxtmedia (som innehåller 10% FBS). Utför en levande cell räkna med hjälp av en hemocytometern och cell livskraftig färg.
    Anmärkning: Förväntad lönsamhet för reportern makrofager efter en 8 min inkubation i cell dissociation enzymet är 90%.
  3. Centrifugera celler vid 200 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera i ursprunglig volym av PBS för att tvätta celler. Centrifugera igen och Omsuspendera cellerna vid 7,3 x 105 celler/ml i analys medier (innehållande VÄRMEINAKTIVERADE FBS).
  4. Separera cellsuspensionen i 3 olika rör: TLR4 inhibitor, anti-TLR2, och obehandlad. Inkubera celler med 1 μg/mL TLR4-hämmare för 60 min vid RT eller med 50 μg/mL anti-TLR2 i 30 minuter vid RT.
  5. Tillsätt 200 μL lysat, 10% FBS, 10% kommersiell mus plasma (tabell över material), eller en blandning av proteinlösningar till en 48-brunn-platta (eller motsvarande) och låt proteinet adsorberas vid 37 ° c för önskad tid (dvs. 30 min, 60 min eller 24 h). Aspirera proteinlösningar från brunnar, med hjälp av en färsk Pastapipett för varje proteinlösning, och tvätta ytor med 250 μL PBS i 5 min. Aspirera PBS. Upprepa för totalt 3 tvättar.
    Anmärkning: Det här steget kan behöva startas tidigare i protokollet beroende på önskad adsorptionstid. Justera protokollet därefter.
  6. Efter inkubationstiden med TLR4-hämmare eller anti-TLR2, Pipettera celler att Omsuspendera. Tillsätt 200 μL cell lösning i varje brunn.
  7. För TLR2 positiva kontroll tillstånd, tillsätt Pam3CSK4 till en slutlig koncentration av 150 ng/mL. För TLR4 positiva kontroll tillstånd, tillsätt lipopolysackarid (LPS) till en slutlig koncentration av 1,5 μg/mL. Inkubera cellerna vid 37 ° c i 20 h.
  8. Prov 20 μL av supernatanten från varje brunn och platta i två exemplar till en 96-brunn tallrik. Innehålla tre brunnar med 20 μL analysmedia som bakgrundskontroll. Tillsätt 200 μL av SEAP reporter assay reagens till varje brunn. Täck plattan med en självhäftande tätning och inkubera i 2,5 h vid 37 ° c.
    Anmärkning: Inkubationstiden kan variera beroende på Försöksförhållanden och bör optimeras för en stark skillnad i absorbans mellan positiva och negativa kontrollbrunnar.
    1. Överför återstoden av supernatanten till en 1,5 mL tub (per brunn). Centrifugera vid 1 000 x g i 10 min för att pelleten något skräp. Överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub och förvara vid-80 ° c. Analysera supernatanten för förekomst av proinflammatoriska cytokiner (t. ex., TNF-α, interleukin 6) via enzymkopplad immunosorbent assay (ELISA).
  9. Ta bort självhäftande plåt tätning. Läsplattans absorbans med en Plattläsare vid 635 nm. Aspirera vätska och kassera plattan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rengöringsmetoder för polymerbelagda ytor testades för att säkerställa att beläggningen inte stördes, vilket skulle ses som en förändring i vattenkontakt vinkeln till en obestruket glas täckslip (figur 2). Blötläggning PMMA-belagda Mikroskop diabilder i 70% etanol för 1 h konstaterades för att ta bort PMMA beläggning (figur 2, vänster panel), sannolikt på grund av lösligheten av pmma i 80 WT% etanol13, därför PMMA-belagda ytor rengjorts med 30 min av UV-sterilisering ensam. Koncentrationen av PMMA för beläggning optimerades tidigare5. En 1 h 70% etanol blöt användes för att rengöra PDMS, och UV-sterilisering försummades eftersom UV-ljus kan orsaka kedje-uppdelning och påverka ytan vätning egenskaper PDMS14. Både 70% etanol blöt och UV-sterilisering påverkade inte vattenkontakt vinkeln för fPTFE-belagda täckglas (figur 2, högra panelen), därför de två metoderna, i följd, användes för att rengöra fptfe beläggningar. Metoden för fPTFE beläggning beskrevs tidigare av Grainger Group15.

En Western blot utfördes på 3T3 lysate att se till att fuktiga arter var närvarande i den komplexa molekylära blandningen. Resultaten visade att både HMGB1 och HSP60, två väldokumenterade damps16,17, var närvarande i lysatet (figur 1B). Adsorptionen av TLR-ligander från lysatet på polymerytorna bekräftades genom odling av reporter makrofager (obehandlad, TLR2 neutraliseras, eller TLR4 hämmas) för 20 h på proteinadsorberade polymerytor (dvs. vävnadsodling-behandlad polystyren [TCPS], PMMA, PDMS, fPTFE), och sedan indirekt bedöma NF-кB/AP-1 verksamhet baserad på SEAP produktion med hjälp av en enzymatisk analys (figur 1C och figur 3). Dessutom hade reportern makrofager signifikant ökat NF-кb/AP-1 aktivitet på adsorberat lysat jämfört med adsorberat FBS eller plasma och inget föradsorberat protein (Media) (figur 4). TLR ligander syntetisk triacylated lipopeptid (Pam3CSK4, TLR2 ligand) och lipopolysackarid (LPS, TLR4 ligand) ingick som positiva kontroller för att bekräfta antikroppen eller inhibitor och analysen fungerade korrekt. TLR2 neutralisering hade en märkbart starkare reduktion av NF-кB/AP-1 responsen hos reporter makrofager för att adsorberat lysat jämfört med TLR4 hämning. Samt, små mängder av lysat utspädd i serum (baserat på totalt protein) inducerade signifikant ökat NF-кB/AP-1 svar jämfört med serum ensam, med den lägsta effektiva utspädning beroende på polymerytan (figur 5). Dessa resultat visar styrkan av de adsorberade lysathärledda molekylerna på inducerande TLR-beroende NF-кB/AP-1 aktivitet i reportern makrofager på en mängd olika polymera ytor.

Figure 1
Figur 1: metoder och resultat för den alkaliska fosfatasanalysen av NF-кB/AP-1 reporter makrofager på TCPS, PMMA, PDMS och fPTFE. A) diagram över arbetsflödet för det alkaliska fosfatastestet av reportern makrofage. B) västra blot av lysat som bekräftar förekomst av fuktiga arter HMGB1 och HSP60, med β-Actin som lastnings kontroll. C) NF-кb/AP-1-verksamhet (representerad genom absorbans) av rapportörer som odlas på medier (negativ kontroll), 10% FBS, lysate, och PAM3CSK4 (TLR2 ligand, positiv kontroll) för 20 h. data visar resultaten av ett experiment och är representativt för resultaten från minst 2 separata experiment, visas som medelvärdet ± standardavvikelse (SD). Varje experiment används n = 3 separata brunnar per skick, och varje brunn var klädd i två exemplar för den enzymatiska analysen. Analyseras med enkelriktad ANOVA och Tukey post-hoc-test. p < 0,001. Denna siffra har anpassats med tillstånd från McKiel och Fitzpatrick5. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: optimering av Rengöringsmetoder för PMMA-och fPTFE-belagda ytor, bedömda med hjälp av vattenkontakt vinkel (WCA). Mätningar har skett på 2 separata ställen med minst 3 täckglas. Data visas som medelvärdet ± SD. analyseras med enkelriktad ANOVA och Tukey post-hoc-test. * p < 0,05. Denna siffra har anpassats med tillstånd från McKiel och Fitzpatrick5. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: TLR-medierad NF-кB/AP-1 aktivitet (representerad av absorbans) av reportern makrofager odlade på 10% FBS (kontroll), lysate, och positiv kontroll för 20 h. (A) påverkan av TLR2 neutralisering på reporter makrofager svar på adsorberat lysat. Positiv kontroll är pam (Pam3CSK4, TLR2 ligand). (B) påverkan av TLR4 hämning på reporter makrofagrespons på adsorberat lysat. Positiv kontroll är LPS (TLR4 ligand). Data visar resultaten av ett experiment och är representativt för resultaten från minst 2 separata experiment, som visas som medelvärde ± SD. Varje experiment används n = 3 separata brunnar per skick, och varje brunn var klädd i två exemplar för den enzymatiska analysen. Analyseras med enkelriktad ANOVA och Tukey post-hoc-test. * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Denna siffra har anpassats med tillstånd från McKiel och Fitzpatrick5. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: NF-кB/AP-1 aktivitet (representerad av absorbans) av reportern makrofager odlade på media (negativ kontroll), 30 min och 24 h adsorberat protein skikt, och Pam3CSK4 (positiv kontroll) på TCPS för 20 h. Data kombineras från 3 separata experiment och visas som medelvärde ± SD. Varje experiment används n = 3 separata brunnar per tillstånd, och varje brunn var klädd i två exemplar för den enzymatiska analysen (dvs., n = 9 icke-oberoende cellkultur brunnar och n = 18 icke-oberoende enzymatisk assay brunnar). Analyseras med enkelriktad ANOVA och Tukey post-hoc-test. p < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: reporter makrofag NF-кb/AP-1 aktivitet (företrädd av absorbans) efter 20 h som svar på utspädningar av lysat i FBS (totalprotein = 280 μg/brunn) adsorberat till polymerytor i 30 min. aTCPS. B) PMMA. (C) PDMS. D) fptfe. Data visar resultaten av ett experiment och är representativt för resultaten från minst 2 separata experiment, som visas som medelvärde ± SD. Varje experiment används n = 3 separata brunnar per skick, och varje brunn var klädd i två exemplar för den enzymatiska analysen. Analyseras med enkelriktad ANOVA och Tukey post-hoc-test. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Denna siffra har anpassats med tillstånd från McKiel och Fitzpatrick5. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 1
Kompletterande figur 1: exempel layouter som används för NF-кB/AP-1 reporter makrofager cellkultur analys i 8-kammare och 48-well plåtformat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett primärt fokus i vårt labb är värd svaret på solida biomaterial mjukvävnads implantat, och i synnerhet hur de cellulära skador som uppstått under implantations proceduren påverkar värd svaret. Det arbete som presenteras här beskriver preliminära experiment med hjälp av en reporter makrofag cellinjer och in vitro-genererade fuktig-innehållande cellulära lysat, att undersöka påverkan av molekyler som frigörs vid cellulära skador (dvs. från implantatkirurgi) på makrofagrespons på biomaterial. Fibroblast cell lysate användes för att modellera cellulära skador och frisättning av DAMPs på grund av biomaterial placering. Fibroblaster valdes för att skapa lysate på grund av prevalensen av fibroblaster i mjuk vävnad, samt deras förmåga att utsöndra en mängd olika extracellulära matrix (ECM) proteiner, inklusive Fibronektin18. Frys-Tina cykling valdes som metoden för lysis att producera både intracellulära och ECM-härledda DAMPs, liknande vad som skulle vara närvarande i implantat miljön. Proteashämmare användes inte för att göra detta lysat. Även okontrollerad celllys som frysning-Tina cykling kan resultera i frisättning av proteaser som kan försämra DAMPs, dessa enzymer skulle också sannolikt förekomma i biomaterial implantat miljö när celler skadas under implantation förfarande. Närvaron av DAMPs i den komplexa molekylära blandningen av lysat bekräftades av Western blot (figur 1B; HMGB1 och HSP60) och SEAP reporter assay (figur 1C; NF-кB/AP-1 som svar på adsorberade lysat). Vi har också utfört analyser där lysate späddes i FBS baserat på totalprotein koncentration och adsorberat på cellkultur ytor (figur 5) för att bättre återspegla komplexiteten i implantat miljön, eftersom det kommer att innehålla ett överflöd av blodproteiner samt damps6. Reportern makrofag NF-кb/AP-1 aktivitet förblev signifikant ökat på adsorberade lager från lysate utspädd i FBS, och den lägsta utspädning för att uppnå betydande aktivering var ytan beroende, från 0,1% (TCPS) till 10% (PDMS och fptfe).

Polymererna PMMA, PDMS och PTFE valdes för detta arbete eftersom de är icke nedbrytbara och har använts i stor utsträckning i litteraturen för att bedöma proteinadsorption och makrofagrespons på biomaterial19,20,21,22,23,24,25. TCPS användes också för jämförelse eftersom det är ett vanligt substrat som används för in vitro-makrofage och TLR signalering arbete21,26,27,28. De material som används i vårt arbete är representativa exempel på icke-nedbrytbar, solid biomaterial. Men många andra material kan användas med denna modell, förutsatt att materialet kan beläggas på cellodling plattor eller Mikroskop diabilder och ordentligt dekontamineras. NF-κb/AP-1 reporter makrofag cellinjer valdes för denna in vitro-modell eftersom det möjliggör snabb, indirekt mätning av NF-κb/AP-1-aktivitet genom det inducerbara uttrycket NF-κb/AP-1 i Seap. NF-κB/AP-1 reporter makrofager kräver användning av phleomycin D1 i kulturen media som en selektiv antibiotika för att säkerställa att endast celler med NF-кB/AP-1 inducerbara SEAP genen är närvarande29. För alkaliskt fosfatasanalys är det viktigt att använda HI-FBS i cell odlingsmediet för att undvika potentiellt falskt positiva resultat som genereras av alkaliska fosfataser i serum. Vår forskning hittills tyder på att FBS-adsorberade ytor inte genererar ett detekterbart falskt positivt resultat, sannolikt eftersom serum molekylerna är starkt adsorberade till kulturen ytan och inte släpps ut i supernatanten. Kulturen tidspunkt för reportern makrofager (20 h), assay inkubering tidpunkten (2,5 h), och absorbans läsning våglängd (635 nm) för alkaliska fosfatas analysen optimerades med detta system för att säkerställa robusta och reproducerbara mätningar för alla förhållanden.

En initial protein adsorption tid av 30 min valdes för detta arbete på grund av dess gemensamma användning i protein adsorption litteratur (figur 1C)30,31,32,33,34. Vi har dock också utforskat längre adsorptionstider (dvs. 60 min och 24 h, figur 4) för att bättre representera det adsorberade protein skiktet som makrofager skulle interagera med in vivo, vilket sannolikt kommer att inträffa 4 − 24 h efter implantation1. Det har postulerat att majoriteten av proteinadsorption och utbyte sker i den första 60 min av exponering för en yta26,35,36, därför en 60 min adsorption tid kan vara en mer relevant timepoint. Vi har också flyttat från att använda FBS som en negativ kontroll för närvaron av DAMPs i adsorberat protein skikt till kommersiell mus plasma. Motivet för att använda plasma istället för serum är att plasmaproteiner är kända för att spela betydande roller i proteinadsorption och makrofagrespons1, och att plasma ger en bättre representation av proteinerna i sårmiljön. Plasma som används i proteinadsorptionsexperiment bereds vanligen som en 1 − 10% utspädning26,36,37, vilket motiverade vår användning av 10% plasma. Human plasma används ofta26,36, eftersom det är lättare att få i stora mängder och mer kliniskt relevant, jämfört med mus plasma. Men vi valde att använda kommersiell mus plasma för i denna modell för att hålla arten av de proteinlösningar som överensstämmer med den av reportern celler.

Användningen av reportern makrofag cell linjen infört vissa begränsningar i studien. Först, med hjälp av en murina leukemi makrofage cellinjer har inneboende begränsningar, eftersom fenotyp och beteende kan variera från primära makrofager kulturer. Även om denna begränsning kommer att åtgärdas i framtida arbete med primära makrofager, var föräldrarnas makrofage cellinjer visat sig nära efterlikna mus benmärg-härledda makrofager i termer av deras cellytan receptorer och svar på mikrobiella ligander för TLRs 2, 3 och 438. Dessutom gav NF-κb/AP-1 reporter makrofager liknande resultat som svar på HMGB1 och LPS stimulering jämfört med peritonealdialys primära murina makrofager39. Det bör noteras att NF-κB/AP-1 reporter makrofager, och deras föräldra stam, inte uttrycker TLR540. Forskare har visat att HMGB1 kunde aktivera NF-κb transkription faktorer via TLR5 signalering vägar i hek-293 celler stabilt transfekterade med mänskliga TLR541. Därför har bidraget från HMGB1-TLR5-signalering till övergripande NF-κB-aktivitet på lysatbelagda ytor försummats i denna modell. Dessutom, reportern makrofager och deras föräldra stam inte uttrycka ASC adapter protein, och därmed inte utgör de flesta typer av inflammasomes och kan inte behandla inaktiva IL-1 β eller inaktiv IL-18 till sina mogna former42. Därför, den modell som vi har använt inte står för bidraget av ASC-beroende inflammasomen aktivitet och efterföljande autokrin Il-1 β och Il-18 signalering i makrofag svar på lysate-adsorberade ytor. Följaktligen, denna analys är avsedd som en preliminär undersökning av TLR-beroende NF-κB aktivering, och efterföljande forskning med primära makrofager rekommenderas att ge en mer fullständig och representativ förståelse av makrofagaktivering och fenotyp på material ytor av intresse.

Den alkaliska fosfatasanalysen mäter indirekt aktiviteten NF-кB/AP-1 hos reportern macrophages. Emellertid, det finns många signalering vägar än TLRs som involverar NF-кB/AP-1 (t. ex., interleukin-1 receptor [IL-1R]43 och tumörnekrosfaktor receptor [tnfr]44). Därför var det nödvändigt att bedöma bidraget från TLR2 och TLR4 signalering i det ökade NF-кB/AP-1-svaret på lysatadsorberade ytor med hjälp av inhibitionsanalyser (figur 3). Den logiska grunden för att välja dessa två yta TLRs var att minst 23 DAMPs som har visat sig signalera genom TLR2 och TLR445, inklusive väl kännetecknas HMGB1, och båda receptorerna uttrycks på cellytan och kan interagera direkt med biomaterial yta6. Hämning av TLR2 och TLR4 visade att när TLR2 eller TLR4 signalering blockerades, reducerades NF-кB/AP-1-responsen hos reportern-makrofagerna till adsorberade lysat, vilket indikerar att båda vägarna är inblandade. Emellertid, det fanns en märkbart större minskning av NF-кB/AP-1 aktivitet när TLR2 signalering neutraliserades, vilket tyder på att TLR2 kan spela en primär roll i svaret av reporter makrofager att adsorberat lysate. Vi inser att det kan finnas vissa off-Target hämning med TLR signalering väg neutraliserande antikroppar och hämmare. En neutraliserande antikropp användes för att hämma den TLR2 vägen eftersom det inte fanns kommersiellt tillgängliga TLR2 hämmare molekyler vid tidpunkten för detta arbete.

De metoder som presenteras här använder lysate, som en komplex källa till DAMPs, och NF-κB/AP-1 reporter makrofager som en in vitro-modell för makrofager svar på DAMPs och andra proteiner adsorberat till polymera biomaterial (figur 1). Vi räknar med att vårt protokoll kan användas för att snabbt analysera NF-κB/AP-1 svar och uppströms TLR signalering av reporter makrofager till en mängd olika material (inklusive nedbrytbart material, porösa ställningar eller hydrogels) och adsorberat protein skikt (figur 3). Användningen av porösa material och hydrogeler kommer dock att introducera komplexiteten i systemet, eftersom det kan vara svårt att skilja mellan adsorberade molekyler och entränade molekyler. Vi räknar också med att detta protokoll lätt kan anpassas för att undersöka bidraget från andra signalvägar uppströms NF-кb/AP-1 (t. ex. C-typ lektin receptorer46 och nukleotid-bindande oligomerisering domän (nod)-liknande receptorer47) med lämpliga hämmare. Dessutom kan NF-κB/AP-1 svar av reporter makrofager jämföras mellan olika material, förutsatt svar är normaliserade till baseline cell aktivitet (dvs celler i media på varje yta utan föradsorberat protein) och alla material har omätbara endotoxin nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner tacksamt operativa finansiering från kanadensiska institut för hälso-forskningsprojektet (PTJ 162251), Queen ' s University senaten rådgivande forskningskommittén och infrastrukturstöd från den kanadensiska Stiftelsen för innovation John Evan: s ledarskaps fond (Project 34137) och ministeriet för forskning och innovation Ontario forskningsfonden (projekt 34137). L.A.M. stöddes av en Queen ' s University R. Samuel McLaughlin Fellowship, en naturvetenskap och teknik forskningsråd Kanada kanadensiska Graduate stipendium Master ' s Award och en Ontario Graduate stipendium. Författarna vill tacka Dr Myron szewczuk för hans generösa gåva NF-κb/AP-1 reporter makrofag cellinje och DRS. Michael blennerhassett och Sandra lourenssen för användning av deras gel Imaging system och plattan läsare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20, (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5, (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81, (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20, (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88, (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49, (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286, (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26, (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24, (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23, (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63, (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254, (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17, (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279, (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164, (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156, (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21, (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22, (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23, (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30, (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7, (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5, (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31, (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57, (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280, (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5, (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25, (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29, (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44, (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25, (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15, (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33, (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98, (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170, (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17, (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180, (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107, (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281, (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87, (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10, (4), 775-782 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics