Ткань-инженерный трансплантат для обрезанной реконструкции пищевода у крыс

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Реконструкция пищевода является сложной процедурой, и развитие тканевого пищевода, который позволяет регенерации слизистой оболочки пищевода и мышц, и которые могут быть имплантированы в качестве искусственного трансплантата необходимо. Здесь мы представляем наш протокол для создания искусственного пищевода, в ключая производство эшафота, выращивание биореакторов и различные хирургические методы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, I. G., Wu, Y., Park, S. A., Cho, H., Shin, J. W., Chung, E. J. Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats. J. Vis. Exp. (156), e60349, doi:10.3791/60349 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Использование биосовместимых материалов для окружной реконструкции пищевода является технически сложной задачей у крыс и требует оптимальной техники имплантата с питательной поддержкой. В последнее время было много попыток в пищеводной ткани инженерии, но успех был ограничен из-за трудностей в ранней эпителизации в специальной среде перистальты. Здесь мы разработали искусственный пищевод, который может улучшить регенерацию слизистой оболочки пищевода и мышечных слоев через двухслойную трубчатую эшафот, мезенхимальную систему биореактора на основе стволовых клеток и метод шунтирования с модифицированным гастростомия. Эшафот изготовлен из нановолокна полиуретана (ПУ) в цилиндрической форме с трехмерной (3D) печатной нитью поликапролактона, обернутой вокруг внешней стены. До трансплантации, человеческие стволовые клетки мезенхимальных были посеяны в просвет эшафот, и биореактор выращивания было выполнено для повышения клеточной реактивности. Мы улучшили выживаемость трансплантата, применив хирургический анастомоз и покрыв имплантированный протез лоскутом щитовидной железы, за которым последовало временное кормление от неоррорной гастростомии. Эти трансплантаты смогли резюмировать результаты первоначальной эпителиализации и регенерации мышц вокруг имплантированных участков, о чем свидетельствует гистологический анализ. Кроме того, на периферии трансплантата наблюдались повышенные эластинные волокна и неоваскуляризация. Таким образом, эта модель представляет собой потенциальную новую технику для окружной реконструкции пищевода.

Introduction

Лечение заболеваний пищевода, таких как врожденные пороки развития и карциномы пищевода, может привести к потере структурного сегмента пищевода. В большинстве случаев, аутологичные замены трансплантатов, таких как желудочного подтягивания каналов или толстой кишки межпозиций, были выполнены1,2. Тем не менее, эти эндофагеальные замены имеют различные хирургические осложнения и риски повторной операции3. Таким образом, использование тканевых эшафот пищевода имитируя родной пищевод может быть перспективной альтернативной стратегией для в конечном итоге регенерации потерянных тканей4,5,6.

Хотя ткань-инженерный пищевод потенциально предлагает алтернативу к в настоящее время обработка дефектов пищевода, будут значительно барьеры для своего применения in vivo. Послеоперационная анастомотическая утечка и некроз имплантированных эшафот пищевода неизбежно приводят к смертельной инфекции окружающего асептического пространства, такого как средостений7. Поэтому крайне важно предотвратить пищевые или слюнные загрязнения раны и назогастральной трубки. Гастрономия или внутривенное питание следует рассматривать до тех пор, пока первичное заживление раны не будет завершено. На сегодняшний день, пищеводных тканей инженерии была выполнена в крупных животных моделей, потому что крупные животные могут питаться только путем внутривенной гипералименции в течение 2-4 недель после имплантации эшафота8. Однако такая модель неорального кормления не была создана для раннего выживания после пересадки пищевода у мелких животных. Это потому, что животные были чрезвычайно активны и неконтролируемы, поэтому они не могли держать кормления трубки в желудке в течение длительного периода времени. По этой причине было несколько случаев успешной трансплантации пищевода у мелких животных.

С учетом обстоятельств инженерии тканей пищевода мы спроектировали двухслойную трубчатую эшафот, состоящую из электрострунна нановолокна (внутренний слой; Рисунок 1А) и прядь 3D-печати (внешний слой; Рисунок 1B) включая модифицированную методику гастростомии. Внутреннее нановолокно изготовлено из ПУ, неразлагаемого полимера, и предотвращает утечку пищи и слюны. Внешние 3D печатные нити изготовлены из биоразлагаемого поликапролактона (PCL), который может обеспечить механическую гибкость и адаптироваться к перистальтическим движениям. Человеческие жировые стволовые клетки (hAD-MSCs) были посеяны на внутреннем слое эшафота для содействия реэпителизации. Структура нановолокна может облегчить начальную регенерацию слизистой оболочки, обеспечивая структурную внеклеточную матрицу (ECM) среду для миграции клеток.

Мы также увеличили выживаемость и биоактивность привитых клеток за счет выращивания биореакторов. Имплантированная эшафот была покрыта щитовидной железой лоскут для обеспечения более стабильной регенерации слизистой оболочки пищевода и мышечного слоя. В этом отчете мы описываем протоколы для методов инженерии тканей пищевода, включая изготовление эшафотов, мезенхимальные стволовые клетки на основе биореактора, метод питания шунтирования с модифицированной гастростомией, и модифицированный хирургический анастомоз техники для окружной реконструкции пищевода в крысиной модели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC No 17-0164-S1A0) Сеульской национальной университетской больницы.

1. Производство леса

ПРИМЕЧАНИЕ: Двухслойные эшафот пищевода производятся путем объединения электроспиннинга и 3D-печати. Внутренняя мембрана трубчатых эшафот был изготовлен электроспиннинг полиуретана (ПУ) с вращающимися мандрами из нержавеющей стали, как коллекционеры9.

  1. Для приготовления трубчатых нановолокон PU приготовьте 20% (w/v) раствор из полимера ПУ, помешивая в N,N-диметилформамид (DMF) для 8 ч при комнатной температуре.
  2. Поместите раствор PU на шприц с тупой металлической иглой (22 G) и электроспин на вращающихся мандристах из нержавеющей стали (диаметр 2 мм) на расстоянии 30 см между кончиком иглы и вращающимся коллектором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блок питания настроен на высоковольтный прямой ток мощностью 15 кВ. Скорость кормления раствора фиксируется на уровне 0,5 мл/ч с помощью шприского насоса.
  3. Сделайте трубчатый слой нановолокна на поверхности мандрии, вращающийся со счетом 3,14 м/с.
  4. Сухие PU нановолокна в вакуумной печи при температуре 40 градусов по Цельсию на ночь, чтобы полностью удалить остаточный растворитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать внешней стены эшафот пищевода готовится с помощью системы быстрого прототипирования. Оборудование для 3D-печати состоит из диспенсера, сопла, контроллера сжатия/тепла, этапа преобразования 3 оси и программной системы.
  5. Гранулы PCL растворяются при 100 градусах Цельсия в нагревательном цилиндре, а затем печатаются на поверхности нановолокон при высоком давлении (7 бар) под контролем системы биоплотничества. Размер сопла составляет 300 мкм, а расстояние пряди - 700 мкм.
  6. После удаления двухслойной эшафот из мандри, стерилизовать путем замачивания в 70% этанола под ультрафиолетовым светом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные характеристики эшафот были зарегистрированы в предыдущих исследованиях10.

2. Посев клеток на прививках и выращивании биореакторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Человек adipose полученных мезенхимальных стволовых клеток (HMSCs), приобретенных у компании были использованы без изменений.

  1. До пересадки клеток, стерилизовать 3D печатных эшафот пищевода в течение 1 ч под ультрафиолетовым светом, мокрый его в течение 10 минут с этанолом, и мыть его 3x с фосфат-буфером солив (PBS).
  2. Культура и расширить ГМСК в среде роста (базальная средняя/ добавка роста). Двухслойные трубчатые леса были перенесены в непридерживаемые 24 хорошо ткани культуры пластин.
  3. Чтобы прикрепить клетки к внутренней поверхности эшафота, аккуратно добавьте hMSC подвески при плотности 1 х 106 клеток / мл в подвале мембраны матрицы, содержащей среды роста.
  4. Равномерно откладывать подвальную мембранную матримную подвеску на внутреннюю поверхность двухслойной трубчатой эшафота.
  5. Твердо исправить hMSC-посеянных трубчатых эшафот акрилового держателя в камере культуры биореактора с помощью пульсатилного потока биореакторной системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанная биореакторная система состоит из насоса, пузырьковой ловушки, камеры потока, датчика давления, управляемого клапана и среднего резервуара. При применении сдвига стресс в камере культуры, позволяют время отдыха 1-2 мин11.
  6. Добавить рост среды в культурную камеру и применять 0,1 dyne/cm2 потока индуцированной сдвига стресс под увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO210.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение потока индуцированной сдвига стресс был рассчитан путем имитации перистальты ткани пищевода, полученных из человеческого тела из предыдущих исследований10.
  7. Определите реакции клеток на внутренних поверхностях двухслойных трубчатых эшафотбезов без выращивания биореактора после 5 дней с помощью набора LIVE/DEAD Viability Assay Kit в соответствии с инструкциями производителя. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии с помощью инструмента стек.
  8. На третий день, наблюдать поверхностную морфологию hMSC-посеянной трубчатой эшафот через сканирующий электронный микроскоп (SEM).
    1. Исправить эшафот, который был инкубирован с hMSC с 2,5% глютаральдегида и OsO4 для 24 ч и обезвоживание с этанолом.
    2. Пальто фиксированных hMSCs с платиной с помощью распылителя пальто в атмосферных условиях аргона и получить SEM изображения на ускорение напряжения 25 кВ.

3. Хирургическая подготовка для хирургии животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические препараты применяются как перед гастростомией и пересадки пищевода.

  1. Настройка стерильных хирургических инструментов: Scalpel лезвие, Weitlaner втягиватель, микроиглы держатель, микросумп щипцы, микроткань щипцы, микросцы, Майо-Хегар держатель иглы, операционные ножницы, ножницы радужной оболочки, повязка щипцы, ткани щипцы, осколок щипцы, щипцы радужной оболочки, 5 мл шприца (21 G иглы), 10 мл шприца (22 G иглы), 9-0 полиамидшовый шов, 4-0 полигактина шов.
  2. Анестезия животного с внутримышечной инъекции плитки / золазепама (50 мг/г дозы) и 2% гидрохлорид ксилазина (2 мг/кг дозы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые крысы Спраг-Доули (SD) весом 398-420 г использовались для трансплантации пищевода.
  3. Перед переходом на хирургическую драпировку проверьте соответствующее обезопадевое состояние животного, защищая хвост щипками.
  4. Поместите животное в положение на спине на стерильной драпировке и использовать клиперы для удаления волос с шеи (для пересадки пищевода) или живота (для гастростомии). Затем скраб хирургического сайта с бетадином и 70% этанола.
  5. До разреза, подкожно вводят анальгетик, такие как бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) для облегчения боли.

4. Хирургия гастростомии С помощью Т-трубки у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная гастростомия была выполнена у всех экспериментальных животных, чтобы позволить временное шунтирование неорального кормления трубки (n No 5).

  1. У крыс быстро за день до операции. Подготовка хирургии, как в разделе 3.
  2. Разоблачить желудок через разрез средней линии кожи и мышц живота анестезируют крыс.
  3. Создайте 3 мм в передней стенке желудка с ампелонным лезвием.
  4. Вставьте кончик силиконовой T-трубки в дефект сайта, чтобы исправить его к стенке желудка.
  5. Шов правильно, чтобы Т-трубка не отсоединила от стенки желудка.
  6. Выньте дистальный конец имплантированной Т-трубки через подкожный туннель в задней части шеи.
  7. Вставьте крышку гепарина в конец Т-трубки, чтобы содержимое желудка не текла назад.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ангиокатетер, чтобы соединить конец Т-трубки с крышкой гепарина.
  8. Шов все слои брюшной стенки и кожи с помощью 4-0 полиплактиновых швов.
  9. Держите всех экспериментальных крыс отдельно в метаболической клетке после гастростомии была завершена.

5. Трансплантация пищевода

ПРИМЕЧАНИЕ: Пересадка пищевода двухслойной трубчатой эшафотпроводит проводится через неделю после гастростомии (n No 5). Перед трансплантацией, прививать HMSC (плотность клеток: 1 х 106 клеток / мл в подвале мембранной матрицы) во внутреннюю стену каждого эшафота и инкубировать в течение 3 дней в биореакторной системе. Хирургическая процедура заключается в следующем.

  1. Удалить волосы на шее модели животных и выполнять стандартные драпировки хирургического сайта для асептической хирургии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создать большую область бритья рекомендуется для поддержания аскетической хирургии на животном.
  2. После переднего медианного разреза шеи отделите мышцы ремешка и разоблачите трахеоэзофагеальную структуру.
  3. Грубо вскрыть блуждающий нерв из пищевода, прежде чем резекции сегмента, в противном случае дыхание животного скомпрометирована.
  4. Под увеличением изолируйте левую сторону пищевода от трахеи и тщательно отделите верхнюю часть от щитовидной железы.
  5. Создайте 5 мм длинный полный окружной дефект, содержащий все слои пищевода с помощью хирургических ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До пересадки пищевода, сократить подготовленные леса с помощью хирургических ножниц, чтобы соответствовать длине места трансплантации.
  6. Под микроскопом, выполнять микроанастомоз на обоих концах дистального дефекта пищевода с помощью 9-0 шов нить. Поместите первый шов между правой inferoposterior края остатков пищевода и эшафот. Продолжайте зашивать справа налево между верхним остатком пищевода и эшафотом. Анастомоз эшафот так же, как верхний край нижней части остатка пищевода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните микрососудистый анастомоз, используемый в клинической хирургии для трансплантации пищевода. Работайте с микроскопом для точного, водонепроницаемого зашвивания места имплантации.
  7. После этого, положите окружающий щитовидной железы лоскут над пересаженный сайт для обеспечения стабильного поддержания и сосудистой поставки трансплантатов.
  8. После трансплантации сшивать подкожную мышцу и ткани кожи с 4-0 vicryl шов.
  9. Держите всех экспериментальных крыс индивидуально в метаболических клетках.

6. Послеоперационные процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационные процедуры выполняются после гастростомии и пересадки пищевода.

  1. После закрытия брюшной раны, положить крыс в отдельные метаболические клетки и поместить клетки на инфракрасное потепление устройств для предотвращения переохлаждения.
  2. Мониторинг животных до тех пор, пока они не достигнут и поддерживать суровый recumbency (т.е., лежа в вертикальном положении на груди).
  3. Чтобы свести к минимуму воспаление в хирургическом месте, вводят антибиотик гентамицин (20 мг/кг) ежедневно крыс.
  4. Начните перорное жидкое кормление на третий послеоперационный день до конечной точки исследования. Поставка всей формулы питания (20,6 г/100 мл углеводов, 3,8 г белка, 0,2 г% жира) через гепарин крышка 3x в день, начиная день после операции.
  5. Ежедневно проверяйте внешний вид животных и массу тела. Проверьте, чтобы управлять поведением, таким как самоповреждение места разреза или сопротивление потребление межени трубки, а также различные хирургические осложнения. Когда масса тела крыс модели быстро уменьшается на 20% или более, выполнять эвтаназии co2 ингаляции.

7. Гистология и иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологического анализа, все пищевеливая ткань эвтаназии животных извлекается с помощью хирургических ножниц. Гематоксилин и эозиновые окрашивания и трихромное окрашивание Массона были выполнены с использованием стандартных гистологических методов. Иммуногистохимия проводилась по следующему протоколу.

  1. Исправить весь пищевод, содержащий пересаженные участки в 4% параформальдегида. Создайте парафин блок и вырезать 4 мкм толщиной разделов.
  2. Депараффинизуите участки тканей и обезвожжают их в серии этанола. Погрузите ткань слайды в цитрат буфера и тепла в течение 10 минут в микроволновой печи. Охладите клетки холодными PBS в течение 20 мин. Погрузите в перекись водорода 3% в течение 6 мин, и промойте PBS в течение 10 мин.
  3. Инкубировать в 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифические реакции тканевых секций.
  4. Вымойте 3x с PBS в течение 5 мин. Инкубировать с первичными антителами против Desmin (разбавленный до 1:200), кератин 13 (разбавленный до 1:100), и фон Willebrand фактор (vWF; разбавленный до 1:100) ночь при 4 градусах по Цельсию.
  5. Вымойте 3x с PBS в течение 15 мин. Инкубировать с соответствующимвторичным антителом в концентрации 1:500 для Desmin и Кератин 13 при комнатной температуре. Затем дважды промойте горки PBS в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань разделы для vWF были инкубированы с использованием хрена peroxidase-конъюгированный комплект (см. Таблица материалов), а затем визуализированы с помощью 3,3'-диаминобензидин (DAB).
  6. Гора с использованием стеклянного покрывала и 4',6-диамидино-2-фенолиндоль (DAPI), содержащий монтаж среды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показана схематическая схема производственного процесса двухслойной трубчатой эшафота ПУ-ПКЛ. Раствор PU был электроспуном из 18 G иглы, чтобы сделать цилиндрическую внутреннюю структуру толщиной 200 мкм. Затем расплавленный PCL регулярно печатался на внешней стене нановолокна ПУ. Поверхностную морфологию внутренних и внешних стенок завершенной трубчатой эшафота можно увидеть на сканирующем электронном микроскопии.

На рисунке 2 показан процесс вставки гастрономии трубки в крысу для внешнего питания питательных веществ(рисунок 2A). Т-образная силиконовая трубка была вставлена в стенку желудка и зашивалась(рисунок 2B). Затем трубка была перемещена через подкожный туннель к задней части шеи и соединена с крышкой гепарина(рисунок 2C). Трубка облегчает инъекцию жидкой пищи. Он также запрещает обратный поток содержимого желудка через трубки.

На рисунке 3 показан процесс клеточной прививки на внутренней стене эшафота, выращивание биореакторов и трансплантация пищевода. HMSC-встроенный подвал мембраны матрицы была применена равномерно к внутренней стенке эшафота черезинъекцию (Рисунок 3A). Изображение SEM показывает морфологию внутренней поверхности, прикрепленной к клетке. Live / мертвые окрашивания для анализа жизнеспособности клеток на двухслойной трубчатой эшафот (светящейся поверхности) показали, что большинство клеток были жизнеспособными, и они хорошо распространяются на структуру нановолокна в 5 дней. Эшафот привитые с клетками был зафиксирован на биореактор, и сдвига стресс был применен насос(Рисунок 3B). HMSC-посеянные трубчатые леса, в том числе выращивание биореактора, были пересажены крысам с полными окружными дефектами пищевода с помощью методов микросавитуры. Трансплантат был покрыт щитовидной железы лоскут для стабильной фиксации и сосудистой поставки имплантированного сайта(рисунок 3C). Изменение веса крыс после трансплантации наблюдалось до конца эксперимента. Пересаженные пищеводные крысы оставались на уровне 340 г до 9-го дня, но затем быстро уменьшались в весе по различным причинам(рисунок 3D). В результате большинство животных погибло в течение 15 дней.

На рисунке 4 показана регенерация пищевода после имплантации трансплантата. Хотя у большинства крыс развилась неоэзофагеальная обструкция, вызванная волосяными шариками, не было никаких валовых доказательств перфорации, утечки анастомоза с свищей, накопления серомы, образования абсцесса или окружающего некроза мягких тканей у любой экспериментальной крысы. Реэпителилиализация места трансплантации была подтверждена иммунофлуоресценцией окрашивания кератина 13. Морфология коллагенового слоя и эластина волокон была четко подтверждена на месте регенерации. Наличие обильных эластин и коллагеновых волокон может способствовать улучшению механических свойств. Регенерация мышечного слоя пищевода была проодена десмин иммуногистохимии, и обильные неоваскуляризации наблюдалась на этом сайте.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация процесса, используемого для изготовления 2-слойных трубчатых лесов. После изготовления внутренней мембраны с помощью электроспиннинга с помощью PU(A),структурная прочность трубчатой эшафота была усилена путем добавления прядей на внешнюю поверхность мембраны с помощью 3D-печати системы без растворителя (B). На снимке SEM показана морфология внутреннего и внешнего слоев 2-слойной трубчатой эшафот. (Аббревиатуры: ПУ и полиуретан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Гастростомия. (A) Схемаическая диаграмма, показывающая методы гастростомии через Вставку Т-трубки в стенке желудка. (B) Прокол отверстие производится в середине переднего желудка, и T-трубка отзыв вставляется в передний желудок. (C) Входная часть Т-трубки расположена с крышкой гепарина в середине occiput. На рисунке ниже представлен аппарат гастростомии Т-трубки с различными компонентами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: трансплантация пищевода. (A) HMSCs инкапсулированные в подвале мембраны матрицы были посеяны на внутренние слои двухслойных трубчатых эшафот. На снимке SEM показана морфология гМСК на внутренней стене. Жизнеспособность привитых клеток также была подтверждена живым окрашивающим (зелеными и живыми клетками). HMSC-посеянные леса были немедленно инкубированы в биореакторной системы (B), а затем ткани инженерии пищевода были имплантированы в шейный пищевод (C). Имплантированный участок был покрыт щитовидной железой лоскут для стабильной реконструкции пищевода (стрелки). (D) Исследования потери веса после пересадки пищевода. Потеря веса была определена как абсолютное изменение от первоначального веса крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Вся гистология реконструироваемого пищевода через 2 недели после имплантации ортотопических лесов. Трихромное окрашивание Массона показывает осаждение коллагена вокруг имплантированных участков. Регенерация мышц пищевода и слизистых слоев была подтверждена десмин (зеленый) и кератин 13 (красный) иммуностоинга, соответственно. Кроме того, вокруг регенерированного слизистого слоя отчетливо наблюдалась неоваскуляризация (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существующие исследования на животных искусственных эзофаги по-прежнему ограничены несколькими критическими факторами. Идеальная искусственная эшафот пищевода должна быть биосовместимой и иметь отличные физические свойства. Он должен быть в состоянии регенерировать слизистой эпителия в раннем послеоперационном периоде, чтобы предотвратить анастомотические утечки. Регенерация внутренних круговых и внешних продольных мышечных слоев также важна для функционального перистальты12,13.

Механические характеристики пищевода имеют важное значение, потому что пищевод разрушается во время дыхания и открывается во время глотания, с постоянным воздействием максимального растяжения с отдачей явление14. Имплантированные эшафот должны иметь эти механические характеристики, а также. Вязкеуластичность имплантированного пищевода должна быть адекватной для повторяющихся рампы-расслабления перистальтического движения через пищевод. Слишком слабые леса могут разрываться или протекать и вызывать тяжелые состояния (например, медиастинит) у получателя. В отличие от этого, эшафот, который является слишком жесткой может выпуклость в пищевод просвет и предотвратить прохождение пищи. Электроспунные нановолокна обладают очень благоприятными физическими свойствами для реконструкции пищевода. Топографская природа ECM обеспечивает среду, благоприятную для миграции и дифференциации эпителиальных клеток в слоях пищевода15. Он также имеет нанопор структуры, которая предотвращает утечку слюны и различных патогенов16. Тем не менее, леса из электроспунных нановолокон имеют ограниченное использование из-за их мягких механических свойств. Чтобы решить эту проблему, мы улучшили их механическую прочность с помощью технологии 3D-печати. 3D печатная прядь на внешнем слое нановолокна имеет ширину 780 мкм, а внутренняя структура пор довольно широка. Он обеспечивает физическую поддержку для пищеводного вмешательства, а не руководство регенерации окружающих тканей.

В этом исследовании, окружной дефекты пищевода были полностью исцелены в биореакторкульт культивированных трансплантатов в течение 2 недель, но все экспериментальные крысы умерли в течение 15 дней после операции. Большинство случаев смерти были вызваны перитонитом и недоеданием, вызванным утечками пищи и слюны, проксимальной для анастомоза. Все животные свободно потребляли жидкую диету в течение недели, но, как заживление раны прогрессировал, непреднамеренное механическое препятствие произошло в реконструированный пищевод из-за проглатывания волос. Это явление было показано, вызывают полное расстройство пищеварения в имплантированных нединамических эшафот. Есть несколько вариантов преодоления этих технических проблем. Во-первых, развитие высокоупругого пищеводного имплантата, который может имитировать перистальтализ пищевода. Во-вторых, исследования на животных с использованием лысых крыс, чтобы предотвратить проглатывание волос. В-третьих, желчный стент может быть применен одновременно с эшафот, чтобы свести к минимуму коллапс имплантата и повреждения анастомоза. Кроме того, применение микрососудистого анастомоза к имплантации эшафота пищевода важно, чтобы полностью предотвратить утечку слюны. Обычная техника шва с использованием невооруженным глазом чрезвычайно трудно сделать водонепроницаемым в крысиных моделях.

Надежное сосудистое средство необходимо для питательных веществ, факторов роста и кислорода на ранних стадиях регенерации. Щитовидная железа является сосудистой ткани, расположенной вблизи пищевода. Мы использовали щитовидной железы лоскут после окружной пищеводэктомии из-за его легкой доступности в модели крыс. В заключение мы предлагаем различные доклинические методы для преодоления трудностей реконструкции пищевода в крысиной модели. Это исследование представляет собой хорошую альтернативу для преодоления ограничений обычных малых трансплантации пищевода животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Биореакторная система, предназначенная для этого исследования, была коммерциализирована (номер модели: ACBF-100).

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Корейским проектом по исследованиям и разработкам технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI16C0362) и фундаментальные научные исследования Программа через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемая Министерством образования (2017R1C1B2011132). Биоспеционы и данные, использованные в этом исследовании, были предоставлены Биобанком Сеульской национальной университетской больницы, членом Корейской сети биобанков.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic cage TEUNGDO BIO & PLANT JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose) Virbac 1000000188
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
1 mL Syringe BD 309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) Byely Q-0615-035
4% paraformaldehyde BIOSOLUTION BP031
4-0 Vicryl ETHICON W9443
9-0 Vicryl ETHICON W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal). Septopal 0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X Sigma C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT VECTOR SK4100
Desmin Santa Cruz sc-23879
Elastic stain kit ScyTeK ETS-1
Ethanol Merck 100983
Ethanol Merck 64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS) Gibco 16000-044
Glutaraldehyde Sigma 354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A-11001
Heparin cap Hyupsung Medical HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium
(MesenPRO RSTM)
Invitrogen R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) VECTOR PK7800
Hydrogen peroxide JUNSEI 7722-84-1
Keratin13 Novus NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit Molecular Probes L3224
Matrigel Corning 354262
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma 227056
Nonadherent
24-well tissue culture plates.
Corning 3738
OsO4 Sigma O5500
Petri dish Eppendorf 3072115
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X BIOSOLUTION BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer Sigma 440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer Lubrizol 2363-80AE
Power Supply NanoNC HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931
Rumpun Bayer Q-0615-035
Silicone T-tube Sewoon Medical 2206-005
Terramycin Eye Ointment Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) Virbac Laboratories Q-0042-058
Trichrome stain kit ScyTeK TRM-1
von Willebrand Factor (vWF) Santa Cruz sc 14014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30, (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36, (1), 107-121 (2016).
  3. Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96, (21), e6942 (2017).
  4. Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
  5. Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503, (1), 271-277 (2018).
  6. La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8, (1), 4123 (2018).
  7. Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5, (2), E58-E60 (2013).
  8. Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26, (12), 1831-1839 (2017).
  9. Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, (5), 2996-2999 (2015).
  10. Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. (2019).
  11. Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
  12. Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468, (18), 30685-30687 (2018).
  13. Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, (4), 850-859 (2008).
  14. Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140, (1), 82-90 (2011).
  15. Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7, (1), 10291 (2017).
  16. Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9, (9), 1540-1555 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics