Studere effekter av tumor-utskilt paracrine ligander på macrophage aktivisering bruker co-kultur med gjennomtrengelig membran støtter

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en metode som bruker gjennomtrengelig membran støtter for å lette studiet av ikke-kontakt paracrine signalering brukt av tumorceller for å undertrykke immunrespons. Systemet er mottagelig for å studere rollen som tumor-utskilt faktorer i demping macrophage aktivering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tumor-avledet paracrine signalering er en oversett komponent i lokale immunsuppresjon og kan føre til en ettergivende miljø for fortsatt kreft vekst og metastasering. Paracrine signaler kan innebære celle-celle kontakt mellom ulike celletyper, for eksempel PD-L1 uttrykt på overflaten av svulster kommunisere direkte med PD-1 på overflaten av T-celler, eller utskillelsen av ligander av en svulst celle for å påvirke en immun celle. Her beskriver vi en co-kultur metode for å forhøre virkningene av tumor-utskilt ligander på immun celle (macrophage) aktivering. Denne enkle prosedyren benytter kommersielt tilgjengelige 0,4 μm polykarbonat-membran gjennomtrengelig støtter og standard vev kultur plater. I prosessen beskrevet, makrofager er kultivert i det øvre kammeret og tumorceller i nedre kammeret. Tilstedeværelsen av 0,4 μm barrieren åpner for studiet av intercellulære signalering uten forvirrende variabel av fysisk kontakt, fordi de to celletyper deler samme medium og eksponering for paracrine ligander. Denne tilnærmingen kan kombineres med andre, slik som genetiske endringer av macrophage (f. eks isolert fra genetiske Knock-Out mus) eller tumor (f. eks CRISPR-mediert endringer) for å studere rollen som spesifikke utskilles faktorer og reseptorer. Tilnærmingen gir også seg til standard molekylære biologiske analyser som kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (qRT-PCR) eller Western Blot analyse, uten behov for flyt sortering å skille de to celle populasjoner. Enzym-knyttet immunosorbentanalyse analyser (ELISAs) kan på samme måte utnyttes til å måle utskilles ligander å bedre forstå den dynamiske samspillet av celle signalering i flere celle type sammenheng. Varighet av co-kultur kan også varieres for studiet av timelig regulerte hendelser. Denne co-kulturen metoden er et robust verktøy som forenkler studiet av tumor-utskilles signaler i immun sammenheng.

Introduction

Nyere studier har fokusert på evnen til kreftceller for å unngå deteksjon av immunceller, undertrykke lokale immun aktivering, eller å produsere en tolerogenic svulst-ettergivende miljø i tumor mikromiljøet. To brede klasser av tumor og immun celle interaksjoner har blitt beskrevet som letter disse effektene: kontakt-mediert interaksjoner eller tumor-utskilt ligander. En av de mest godt studert og klinisk medgjørlig mekanismer for kontakt-mediert uimottakelig hemming utnyttet av svulster er uttrykk for PD-L1, som samhandler med PD-1 på T celler for å hemme deres aktivisering og funksjon1,2. Som svar på interferon-gamma (IFNγ), som uttrykkes av en rekke aktiverte immunceller, tumorceller kan øke uttrykk for PD-L1 å indusere utmattelse av PD-1-uttrykker aktivert T-celler, og dermed hindre dem fra effektivt å utrydde tumorceller3. Bruken av antistoffer for å blokkere samspillet mellom PD-L1 og PD-1 er i dag brukes til å behandle flere krefttyper hos mennesker4. I lys av denne kliniske suksessen og andre, har identifisering og målretting av tumor-avledet immunsuppressiv mekanismer fått økende oppmerksomhet.

Utover undertrykkelse av adaptive immunitet, svulster er også kjent for å skille ut faktorer som undertrykker Pro-inflammatoriske reaksjoner av medfødte immunceller. Tumor-avledet eller tumor-indusert sekreter, inkludert Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, og Colony stimulerende faktor (CSF-1), har vist å hemme antitumor reaksjoner av Natural Killer (NK) celler, granulocytter, og dendrittiske celler i svulsten mikromiljøet5,6,7. Tumorceller kan også skille ut faktorer som skew rekrutteringen og differensiering av myelogen-avledede celler i tumor mikromiljøet å fremme undertrykkelse av T celle aktivering8,9.

En type medfødt immun celle som har en dyp effekt på tumorprogresjon er macrophage. I mange år har tilstedeværelsen av tumor-assosiert makrofager (TAMs) blitt brukt som en negativ Prognostisk av pasienten overlevelse10. Konseptet som immunsuppressiv TAMs dempe immun celle-mediert clearance av svulster ble innført mer enn 40 år siden11. I den seneste tid, den har blitt vist det det macrophage Pro-opphissende svaret kan downregulated stund en Pro-svulst fenotype kan indusert inne det svulst mikromiljøet. Disse immunsuppressiv makrofager kan bidra til en tolerogenic respons, kjøring tumorprogresjon og motstand mot kjemoterapi-og immunterapi12. Gitt at makrofager er ofte en av de mest tallrike leukocytter med svulsten, representerer restaurering av deres tumor-spesifikke immun aktivitet et potensielt mål for anticancer legemiddel selskap13.

Mens kontakt-mediert interaksjoner mellom tumorceller og makrofager kan være modellert gjennom direkte coculture, kan bruk av gjennomtrengelig membran støtter belyse som tumor utskilles faktorer er immunmodulerende uten potensielt forvirrende påvirkning av tumor-immun celle-celle kontakt. Ved hjelp av noe lignende metoder, andre har vist potensialet for å identifisere utskilles faktorer i mikroglia/neuronal interaksjoner14 samt tumorceller med mesothelial celler15. Vi har også med hell brukt denne co-kultur teknikk for å karakterisere rollen som en tumor utskilles protein, Pros1, som en Suppressor av Pro-inflammatorisk genuttrykk etter stimulering av bukhulen makrofager med LPS og interferon-gamma16. Her beskriver vi en grei metodikk som kan brukes til å forhøre hvordan tumor-utskilt faktorer kan påvirke macrophage aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer knyttet til høsting og bruk av murine bukhulen makrofager ble gjennomført ved University of North Carolina i Chapel Hill (UNC) og ble godkjent av UNC institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).

1. macrophage kultur

Merk: denne prosedyren kan bruke primære bukhulen makrofager (beskrevet i detalj nedenfor), benmarg-avledet makrofager, eller macrophage cellelinjer som J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).

  1. Harvest bukhulen makrofager som tidligere beskrevet16,17 og plate direkte inn i øvre kammer (er) av en 0,4 μm polyester membran sette co-kultur 6 brønn plate (figur 1a).
    Merk: omtrentlig utbytte av makrofager fra hver isolasjon er 1 x 106 celler totalt, slik at gjennomsnittlig antall celler per brønn er ~ 1.5 – 1,6 x 105 celler i en 6 brønn plate.
  2. Kultur høstes makrofager i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM)/F12, 10% fosterets storfe serum (FBS), 1x penicillin/Streptomycin, 20 ng/mL macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) i 3 dager ved 37 ° c, 5% CO2.
    Merk: det øvre kammeret inneholder 1 ml kultur medium, mens det nedre kammeret er fylt med 1,5 ml. Mediet må legges til hvert kammer.

2. Coculture av tumorceller med makrofager

  1. Før bruk, kultur kommersielt tilgjengelig tumorceller i sine respektive medium etter ATCC-anbefalte vev kultur metoder.
  2. Vask tilhenger tumorceller en gang med fosfat bufret saltvann (PBS), tilsett 0,05% Trypsin + ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), og ruge ved 37 ° c til cellene løsner. Resuspend cellene i FBS som inneholder medium, quantitate det totale antall celler ved hjelp av en hemocytometer eller celle teller, og deretter sentrifuge i 5 min ved 220 x g til pellets.
  3. Under sentrifugering, aspirer mediet fra de øvre og nedre kamre av macrophage gjennomtrengelig membran støtte plater og erstatte med friskt medium.
    1. For lavere kamre der tumorceller vil bli belagt, fyll med 1 mL medium i stedet for 1,5 mL for å muliggjøre tilstrekkelig volum for celle tillegg.
  4. Aspirer medium fra pelleted tumorceller og resuspend celler i DMEM/F12 med 10% FBS, 1x penicillin/Streptomycin, og 20 ng/mL M-CSF ved en konsentrasjon på 3 x 105 celler/ml.
  5. Tilsett 0,5 mL av 3 x 105 celler/ml tumorceller til det nedre kammeret av ønskede brønner (figur 1B).
    Merk: celler kan behandles umiddelbart.

3. behandling av co-kultivert celler

  1. For å indusere macrophage Pro-inflammatorisk genuttrykk, behandle enkeltvis eller co-kultivert makrofager ved å legge 100 ng/mL IFNγ og 50 ng/mL LPS.
    1. Varier varigheten av behandlingstidene i kulturen etter behov. Macrophage aktivering skjer innen 2 t og noen tumor-mediert undertrykkelse skjer med 8 h. co-kultur for 24 h gir robust og konsistent tumor-avledet undertrykkelse.
      Merk: Alternativt kan makrofager bli overtalt til å vedta en Pro-sår healing fenotype gjennom tillegg av faktorer som interleukin-10 (IL10), og effekten av tumor-utskilt ligand vurdert.
  2. Som en negativ kontroll, kultur makrofager enkeltvis og la ubehandlet. Som en positiv kontroll, behandle enkeltvis kultivert makrofager med 100 ng/mL IFNγ og 50 ng/mL LPS.

4. nedstrøms analyse av co-kultivert celler

  1. Etter ønsket inkubasjonstid har gått, isolere cellen lysat eller betinget kultur medium som ønsket, avhengig av testing behov.
  2. For å isolere celle lysat for kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (qPCR) analyse, aspirer mediene fra begge kamre av brønnen og vask en gang med 2 mL PBS. Påfør RNA lyse buffer til øverste kammer som inneholder makrofager. Skrap membranen forsiktig for å løsne celle lysat, og Overfør til et oppsamlings rør for videre behandling i henhold til protokoll for den RNA-isolasjons sett produsenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å bestemme effekten av tumor-utskilt ligander på macrophage polarisering, prosedyren beskrevet ble utnyttet. Bukhulen kultur Fager i fravær av tumorceller ble brukt som negative (ubehandlet = lengst til venstre) og positive (IFNγ og LPS stimulert = 2nd fra venstre) kontroller (figur 2a). Alternativt var bukhulen makrofager co-kultivert med B16F10 melanom tumorceller (ATCC) (figur 1a). Umiddelbart etter plating, celler ble enten behandlet med IFNγ og LPS eller venstre ubehandlet. Etter 24 h av kulturen, makrofager ble høstet, RNA forberedt, og qRT-PCR utført for å måle uttrykk for Pro-inflammatoriske gener. Ved hjelp av co-kulturen systemet er beskrevet her, viser vi at IFNγ makrofager co-kultivert i nærvær av B16F10 tumorceller, men uten å aktivere stimuli (LPS +), ikke øke uttrykk for Pro-inflammatorisk-assosiert gener (figur 2a, B16F10 membran/ubehandlet). Dette innebærer at tumor-utskilles ligander er 1) ikke tilstrekkelig av seg selv for å indusere Pro-inflammatorisk genuttrykk eller 2) hvis det er immune aktivering av tumor sekreter, paracrine ligander er tilstrekkelig til å undertrykke det til naive nivåer. Denne co-kulturen metoden illustrerer at når makrofager polarisert av IFNγ og LPS er kultivert i nærvær av tumorceller, undertrykkelse av betennelse-assosiert genuttrykket ble redusert med så mye som 60% (figur 2a, B16F10 membran/IFNΓ + LPS). Et tilsvarende nivå av macrophage Pro-inflammatorisk gen undertrykkelse ble observert da murine macrophage cellelinje J774 ble erstattet av bukhulen (figur 2b).

Våre tidligere arbeid identifisert Pros1 som en svulst-utskilt faktor som kan hemme macrophage aktivisering16. Ved hjelp av gjennomtrengelig membran støtte co-kultur modell i forbindelse med ELISA, analyseres vi konsentrasjonen av Pros1 i betinget medium etter 24 h. Vi observerte at i betinget medium fra IFNγ og LPS behandlet B16F10 melanom celler Pros1 ble uttrykt på 475 ng/mL ± 120 ng/mL (Figur 3). Bukhulen behandles i de samme forholdene uttrykt Pros1 ved 61 ng/mL ± 5 ng/mL (Figur 3). Interessant, når co-kultivert, den Pros1 innenfor IFNγ og LPS behandlet godt var 86 ng/mL ± 15 ng/mL. Dette tyder på at 1) makrofager forbruke tumor-utskilt Pros1 eller 2) mengden Pros1 utskilles av B16F10 celler er betydelig redusert når du er i nærvær av makrofager. Resultater fra både figur 2 og Figur 3 Fremhev dyptgripende endringer av macrophage aktivisering og paracrine signalering når makrofager er co-kultivert med tumorceller.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk for gjennomtrengelig membran støtte co-kultur av tumorceller med makrofager. Positive og negative behandlings kontroller kan anvendes på enkeltvis kultivert macrophage brønner (A). For å bestemme effekten av tumor-utskilles signaler på macrophage aktivisering, makrofager er kultivert i øvre kammeret av gjennomtrengelig membran støtte co-kultur plater og tumorceller kultivert i det nedre kammeret (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Tumor paracrine signaler undertrykke macrophage Pro-inflammatorisk polarisering. Macrophage uttrykk for betennelse-assosierte gener ble analyseres av qRT-PCR i ubehandlet eller IFNγ og LPS stimulert makrofager i nærvær eller fravær av tumorceller. Uttrykk for Pro-inflammatoriske gener ble redusert i bukhulen makrofager (A) eller J774 macrophage cellelinje (B) når kultivert i nærvær av tumorceller atskilt med en gjennomtrengelig membran støtte slik at effekten ble overført av en paracrine løselig ligand. *p < 0,05 i forhold til ubehandlet, p < 0,05 i forhold til IFNγ og LPS stimulert. Data er gjennomsnittlig ± SEM; p -verdier beregnet av tosidige Student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Coculture av tumorceller og makrofager fører til endringer i mengden tumor utskilles paracrine ligander funnet i betinget medium. Elisa ble brukt til å bestemme konsentrasjonen av Pros1 i tumor alene, macrophage alene, eller co-kultivert conditioned medium etter 24 h. co-kultur fører til en nedgang i mengden av Pros1 i forhold til tumor celle bare kontroller. *p < 0,05 i forhold til ubehandlet. p -verdier beregnet av tosidig student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Co-kulturen analysen presenteres her er en modifikasjon av tidligere etablerte analyser som gjør det mulig for studiet av tumor-utskilt faktorer på immun celle aktivering. Mens celle-celle kontakt er kjent for å indusere endringer i immunforsvaret, er evnen til tumor-utskilles ligander til modulere immun aktivering mindre godt forstått. Vi beskriver en metode som, i motsetning til direkte co-kultur, kan brukes til å forhøre hvordan tumor-avledet utskilles faktorer innvirkning immun celle aktivering uten forvirrende natur kontakt-mediert signalnettverk. Gitt den potensielle kliniske betydningen av tumor-utskilt ligander i immunsuppresjon, denne metoden tilbyr en lett å bruke verktøyet til å studere disse mekanismene på måter ikke adressert av direkte co-kultur.

I hovedsak, co-kulturen metoden beskrevet her innebærer kulturen i makrofager (primære celler: bosatt, benmarg-avledet, eller en macrophage cellelinje) med tumorceller (cellelinje eller primære celler) uten fysisk kontakt. Det er viktig at makrofager være kultivert på en 0,4 μm pore størrelse polyester membran inn for å tillate fri permeabilitet av tumor-utskilt ligander samtidig hindre mulig macrophage celle migrasjon gjennom filteret. Det er også viktig å legge til den beskrevne mengden kultur medium til øvre og nedre kamre for å sikre riktig celle dekning. Eksperimentell design, for eksempel inkludering av en celle type bare kontroller, er en annen viktig faktor når du planlegger co-kultur eksperimenter. Flere andre faktorer, beskrevet i mer detalj senere, kan også ha effekter på resultatene av analysen, og det er viktig å holde hver i tankene under studien design.

To nyttige modifikasjoner til skissert protokollen til å vurdere er varigheten av co-kultur eller den relative forholdet mellom tumorceller til makrofager. I metoden beskrevet, makrofager og tumorceller er belagt på omtrent like konsentrasjoner. Et viktig poeng å vurdere er den relative andelen av makrofager til tumorceller som naturlig forekommer i tumor mikromiljøet. For å bedre etterligne svulsten mikromiljøet, kan den relative andelen av makrofager endres til speilet det som er funnet i svulsten i Vivo, men foreløpig arbeid kan være nødvendig å etablere riktig forhold.

Et annet kritisk punkt, og mulig begrensning av systemet, er at behandlinger brukes til å stimulere en celle type i analysen kan ha uventede eller utilsiktede virkninger på den andre cellen type. Som beskrevet her, tillegg av LPS og IFNγ er ment å stimulere Pro-inflammatorisk genuttrykk i makrofager. Men i Ubil et al. vi viste at IFNγ også induserer uttrykk og sekresjon av immunsuppressiv Pros116, og andre har vist effekten av LPS på tumorceller18. Det er derfor viktig å inkludere de aktuelle kontrollene for å overvåke potensielle off-mål eller utilsiktede virkninger på den andre celletypen for å verifisere eksperimentelle utfall. En metode som dette kan oppnås ved å behandle enkelte celletyper med agenter av interesse og overvåking effekter ved hjelp av standard molekylærbiologi analyser.

Når du utformer gjennomtrengelig membran støtte eksperimenter, er det også viktig å vurdere mulige diffusjon graderinger av utskilles ligander. Den relative rate av ligand sekresjon, varigheten av co-kultur og om kulturen plate opprettholdes i en stasjonær posisjon kan alle ha effekter på resultatene. I tillegg er det mulig for noen skilles ligander å holde seg til overflaten av kultur plater.

Mens representative resultatene som vises er karakteristisk for dette systemet, graden av Pro-inflammatorisk gen undertrykkelse observert når co-dyrking andre tumor linjer kan variere dramatisk. I Ubil et al., viser vi at noen menneskelige tumor linjer kan nesten helt undertrykke det Pro-inflammatoriske genet uttrykk for en menneskelig macrophage cellelinje16. Omvendt kan andre tumor celletyper eller cellelinjer variere betydelig i deres immunsuppressiv egenskaper. Årsaken til disse avvikene er uklart, men er et område for videre studier.

Gjennomtrengelig membran støtte co-kultur er en robust metodikk som lett kan endres for å løse en rekke spørsmål og kan tilpasses en rekke molekylærbiologi readouts inkludert qRT-PCR, Western Blot, og ELISA. Systemet kan brukes til å forhøre individuelle gen funksjoner, slik som ligander eller reseptorer, når genetiske endringer som de fra Gen-slettede mus eller CRISPR redigeringer er gjort til enten makrofager eller tumorceller. Systemet er også mottagelig for studiet av farmakologiske Aktivator eller hemmere og deres virkninger på paracrine signalering. Også, mens ikke diskutert her, kan systemet brukes til å studere virkningene av immun aktivering på tumor celle genuttrykk.

Denne metoden har blitt brukt med hell i oppdagelsen og karakterisering av en ny funksjon for en immunsuppressiv, tumor-utskilt ligand. Denne robuste verktøyet kan benyttes til å forhøre den mye bredere undergruppe av ikke-kontakt tumor/uimottakelig interaksjoner i håp om å oppdage nye terapeutiske mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Eric Ubil ble delvis finansiert av American Cancer Society postdoktor Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Verket ble støttet av et stipend fra NIH (R01-CA205398) og en bryst Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) til HMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192, (7), 1027-1034 (2000).
  2. Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8, (5), 765-772 (1996).
  3. Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8, (8), 793-800 (2002).
  4. Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19, (19), 5542 (2013).
  5. Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15, (2), 114-123 (2009).
  6. Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59, (4), 911-917 (1999).
  7. Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10, (1), 48-54 (2004).
  8. Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168, (2), 689-695 (2002).
  9. Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65, (8), 3044-3048 (2005).
  10. Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71, (6), 456-458 (1984).
  11. Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35, (6), 549-559 (1984).
  12. Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41, (1), 49-61 (2014).
  13. Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4, (1), 71-78 (2004).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
  15. Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
  16. Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128, (6), 2356-2369 (2018).
  17. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
  18. Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15, (3), 156-165 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics