赫连图斯安努斯大型热成像筛选装置新稳压器的鉴定

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Biology

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Summary

通过对化合物库进行大规模筛选,提供一种识别叶面蒸腾调节器的方法。

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Guo, K., Mellinger, P., Doan, V., Allen, J., Pringle, R. N., Jammes, F. Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus. J. Vis. Exp. (155), e60535, doi:10.3791/60535 (2020).

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Abstract

植物对生物和非生物胁迫的适应受多种因素的制约,其中,针对水缺乏或病原体调节气孔孔起着至关重要的作用。因此,识别调节口腔运动的小分子有助于了解植物适应其环境的生理基础。用于识别口腔运动调节器的大规模筛查方法具有潜在的局限性:有些方法严重依赖腹酸 (ABA) 激素信号通路,因此排除了 ABA 独立的机制,而另一些则依赖于对植物生长和发育等间接长期生理影响的观察。这里介绍的筛选方法允许对具有化学库的植物进行大规模处理,并通过热成像直接定量其蒸腾。由于通过蒸腾蒸发的水会导致叶片表面冷却,热成像提供了一种非侵入性的方法来研究口腔电导随时间的变化。在此协议中,Helianthus 年幼幼被水培生长,然后通过根部喂养进行处理,其中主要根被切割并浸入被测试的化学品中。热成像,然后统计分析随时间变化的粘结温度变化,可以识别生物活性分子调节造血孔径。我们的概念验证实验证明,一种化学物质可以在10分钟内从切根带到向日葵幼苗的幼苗。此外,当植物被ABA视为阳性对照时,可以在几分钟内检测到叶片表面温度升高。因此,我们的方法能够高效、快速地识别调节口腔孔径的新型分子。

Introduction

植物耐应力性是一种多基因性特征,受各种分子、细胞、发育和生理特征及机制的影响在波动环境中的植物需要不断调节其口腔运动,以平衡碳的光合需求,同时保持足够的水,防止病原体入侵2;然而,这些权衡"决定"的机制被人们所理解的还很薄弱将生物活性分子引入植物可以调节其生理,并有助于探索新的调节机制。

大规模筛选小分子是抗癌药物发现和药理学测定的有效策略,用于在短时间内测试数百至数千个分子的生理效应在植物生物学中,高通量筛选在鉴定合成分子皮拉巴辛6以及发现长期寻求的抗性酸受体(ABA)7、8)方面已显示出其有效性。从那时起,ABA受体的激动剂和拮抗剂,以及能够调节ABA诱导报告基因表达的小分子,已经识别了9、10、11、12、13、14、15。目前可用于识别可调节孔径的小化合物的高通量筛选方法有一些缺点:(i) 围绕 ABA 信号通路旋转的协议可能妨碍识别新的 ABA 独立机制;(ii) 用于鉴定生物活性小分子的体内策略主要依赖于其对种子发芽或幼苗生长的生理影响,而不是植物蒸腾的调节。

此外,虽然有许多方法可以用生物活性分子治疗植物,但大多数方法并不适合大规模研究口腔运动。简而言之,三种最常见的技术是通过喷洒或浸渍、根系处理和根灌来应用叶面。叶面应用与测量孔径的最常用和快速的方法不兼容,因为叶表面存在液滴会干扰大规模数据收集。根灌的主要局限性是样品量要求大,根圈中元素对化合物的潜在保留,以及对主动根的采集的依赖。

在这里,我们提出了一种大规模的方法,以识别调节植物蒸腾的新化合物,这些化合物不一定涉及ABA或已知的抗旱机制,并允许对植物进行高效和可靠的处理。在此系统中,使用根喂养方法处理Helianthus 年幼植物,该方法包括切割水培生长的幼苗的主要根部,并将切地浸入样品溶液中。一旦处理,使用红外热像仪测量每种化合物对植物蒸腾的影响。由于叶片表面温度的一个主要决定因素是叶片的蒸发速率,热成像数据可与口腔电导率直接相关。因此,化学处理后叶面温度的相对变化为工厂蒸腾提供了直接的量化手段。

H. 年金是世界五大油籽作物之一直接在该工厂上进行的发现可能促进未来的技术转让。此外,H. 年幼苗有大而平坦的幼苗,以及厚厚的原根,这是开发该协议的理想选择。然而,这种方法可以很容易地适应其他植物和各种化合物。

该协议可用于有效识别能够触发气孔闭合或促进气孔开口的分子,这对理解调节气孔传导和植物适应环境的信号具有重大影响应力。

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Protocol

1. 种植植物

  1. 将 4 厘米厚的细玉层添加到标准 10 英寸 x 20 英寸(254 毫米 x 501 毫米)无孔的植物托盘中。
  2. 将种子支架(见材料表)分开2厘米放在植物托盘中。
  3. 用紫石填充种子支架。
  4. 在每个种子持有人中放置一个尖端的葵花籽,向下推,使一半的种子仍然暴露。
    注:向日葵种子是不对称的,从辐射出现处的尖端应指向向下。正确的种子放置很重要,因为根茎和茎在种子持有人内不可能重新定向。种子的圆角端应延伸到种子持有人的顶部。
  5. 一旦种子就位,用另外2厘米厚的细玉层覆盖它们。水从上面雾化。一小时后,表面应保持湿润。如果是这种情况,用盖子盖住托盘。
  6. 在生长室或温室中种植植物。推荐条件为光强为140μmol光子μm-2μs-1,光周期为16小时,在22°C下为16小时,在20°C下为9小时黑暗,持续5天。
    注:除非表面明显干燥,否则无需浇水。

2. 水培系统的设置

  1. 找到适合水培植物生长的合适尺寸容器。容器的大小应适应生长室或温室中可用的空间。建议最小深度为 15 厘米。
  2. 按照制造商的标调,向容器中加入蒸馏水,并加入一般水培肥料。由此产生的水培溶液应加气,并持续运动,这可以通过使用空气和水泵来实现。
  3. 准备水培浮子。
    1. 将一块 2 厘米厚的膨胀聚苯乙烯泡沫(参见材料表)切成容器的尺寸。该板材应覆盖容器的大部分表面,以限制藻类的生长。木材燃烧工具可有效切割聚苯乙烯泡沫,并适合此协议。
      注意:聚苯乙烯泡沫热切割过程中释放的烟雾或蒸汽会对健康造成严重危害。使用适当的呼吸保护。用户还可以通过在烟罩下切割泡沫来满足通风要求。
    2. 使用木材燃烧工具在聚苯乙烯泡沫片中打孔(直径 1-2 厘米)。两个孔的中心之间的距离可以根据实验的需要进行调整。但是,建议最小距离为 2.5 厘米。

3. 将幼苗转移到水培和植物生长中

  1. 轻轻地从紫石中抽出5天老幼苗,并立即转移到装满水的容器中30分钟。此步骤将去除多余的紫石,并软化剩余的围痕。新兴主根应可见。
  2. 如果需要,请用手清除围壁,以优化粘合器的未来扩展。
  3. 将种子支架内的幼苗转移到聚苯乙烯泡沫浮子上。在22°C下生长光强为140μmol光子的植物,相对湿度为65%,光周期为16小时,在20°C下为9小时黑暗,持续2天。

4. 治疗前的准备

注:本程序用于测试三联体小化合物库中的20种化学品,其中10m MES-KOH(pH = 6.2)和10 mM MES-KOH(pH = 6.2)中的100μM ABA分别含有1%(v/v)二甲基磺酸(DMSO)作为正对照和阴性对照。

  1. 确保有足够的植物可供治疗。准备治疗的工厂应该足够成熟,以完全展开的科蒂莱顿,但足够年轻,横向根增增是最小的。为了进行标准筛选,需要69种这样的植物。
  2. 从 -80 °C 冰柜中取出含有小化合物的 96 孔板。在室温下解冻。
  3. 准备 80 mL 的 10 mM MES-KOH 缓冲液,调整到 pH 6.2,带 1 M KOH。
  4. 标签无盖 2 mL 微管。至少准备六管进行负控制处理(10 mM MES-KOH (pH = 6.2),包含 1% (v/v) DMSO)。使用三管进行ABA治疗(10m MES-KOH pH = 6.2,正控制)100 μM ABA。使用剩余的 60 管分析三联成中 20 种化学物质的影响。
  5. 将每种化学品的 10 μL(DMSO 中为 10 mM)转移到三个适当标记的管中。管液 10 μL 的 10 mM ABA 溶解在 DMSO 中,将 DMSO 溶解到三个管中,将 10 μL 的 DMSO 溶解到六个控制管中。
    注意:从性质上,某些化合物可能会造成严重的健康影响,用户必须采取适当的保护措施。
  6. 在 69 个管中每根添加 990 μL 的 10 mM MES-KOH(pH = 6.2)。分配MES缓冲液,用足够的力将化学物质与MES缓冲液混合,但要小心不要使用太多的力,使化学品和MES缓冲液喷出管。或者,低速涡旋。

5. 设置热像仪

  1. 将热像仪安装在复印支架上。将所有电缆连接到笔记本电脑。
    注:记录是在温度(20°C至25°C)、湿度(50%至70%)条件下完成的和光质量(110至140μmol光子\m-2μs-1)类似于用于种植植物的光子。
  2. 打开相机,然后打开笔记本电脑,打开热成像分析软件。
    注: 后续的录制说明适用于所使用的特定软件(参见材料表)。
  3. 调整录制设置。
    1. 将鼠标悬停在中央窗口顶部的记录红色按钮上。将显示下拉菜单。单击扳手图标"记录设置"。
    2. 选择适当的记录模式和选项。记录定期选项,每分钟捕获一帧,可以使用手动停止。请注意软件将保存视频的文件目标。关闭"记录设置"窗口。

6. 植物制备和治疗

  1. 将含有化学品的无盖管放入管架中。或者,可以使用步骤 2.3 中描述的木材燃烧工具切割和戳出聚苯乙烯泡沫板,以制作定制管架。每个孔的直径应非常接近无盖管的外部直径,以便牢固地握住它们。
    注: 摄像机的视野是一个限制因素,在决定如何保持无盖管时,应考虑这些因素。
  2. 均匀分配正负控制管以及机架中的实验管,以考虑与位置相关的偏差17。
  3. 准备以下材料旁边的植物种植水培:微解剖剪刀,一个浅水盘与水,微妙的任务湿巾,69个无盖管含有不同的化学品。
  4. 对要处理的每个工厂重复以下步骤。向日葵芽将始终留在种子持有人中。
    1. 小心地抬起种子支架,迅速将根浸入含水的浅盘中。
    2. 将主根切在水下,以防止气穴。切口应发生在种子持有人最基底下 0.8-1 厘米以下。
    3. 将刚切割的植物插入一个含有化学物质的管中。
    4. 如果水滴在水滴上,用细腻的任务擦拭轻轻擦干。
      注:必须尽快完成这四个步骤(10 分钟或更少),以防止动力学研究中的不一致。
  5. 将植物移到热像仪下,确保所有设备都在摄像机的视野内。根据需要调整摄像机高度和机架位置。

7. 录制

  1. Ctrl + Alt + A,将相机聚焦到胶卷的表面。
  2. 将鼠标悬停在红色按钮上,然后单击"录制影片"选项。应打开确认录制的新窗口。
  3. 1-2 小时后停止录制。
    注: 可以在此处暂停该协议。

8. 数据收集

  1. 转到文件 |打开 |浏览正确的 。SEQ 文件并打开它。
  2. 停止播放影片。
  3. 在主窗口的左侧,单击添加测量光标 ROI(3x3 像素)图标。ROI 代表感兴趣的区域。
  4. 鼠标悬停在第一株植物的中心,左键单击一次。光标 1 现已就位。通过重复该过程,标记第一工厂的第二个粘合装置。应注意标签的顺序。
  5. 重复此过程。所有植物都应用两个光标标记。
  6. 单击"编辑 ROIs"图标。在主窗口中,左键单击并按住左上角,然后滚动到右下角以选择所有 ROIs。
  7. 将鼠标悬停在"统计查看器"图标上,然后选择"时态图"。将打开一个新窗口。
  8. 运行影片。图形将填充数据。
  9. 在此窗口中,单击右上角的双箭头以打开新菜单。
  10. 单击"保存"图标。在绘图 (.csv) 中保存为 X 和 Y 值。导出数据后关闭软件。

9. 数据分析

  1. 使用数据分析软件(例如,Microsoft Excel)打开 .csv 文件。请注意,前三列(A 到 C)提供有关帧编号、绝对时间和相对时间的信息。其余列提供随时间而给出每个 ROI 的温度。
  2. 决定使用的统计工具的性质;这个决定取决于不同的因素,包括实验设计。
    注: 在我们的示例中,根据总体平均值和总体标准差为每个样本计算标准分数或 z 得分。然后,从 z 得分计算 p 值。该方法允许确认正负控制以及进一步测试新化合物的识别。

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Representative Results

使用红色染料Erythrosine B(0.8 kDa)的实验表明,在10分钟内,通过切根将化学物质吸收到向日葵幼苗的幼苗中,这种化学物质能够被明显吸收(图1)。

当植物使用ABA处理时,在几分钟内检测到向日葵的叶温升高。叶片温度的升高与口腔孔径和口腔电导率的下降有关。使用 10 μM ABA(p 值 = 0.02)和 20 分钟(5 μM ABA(p 值 = 0.003)进行处理后 15 分钟观察到叶面温度升高(图 2)。总体而言,这些结果表明,通过热成像测量叶片温度是测量孔径和电导率的良好指标。

图 3显示了使用 NatProd 集合中的 20 种化学品的子集进行的概念验证实验,该实验具有正(100 μM ABA)和负对照。在这个具有代表性的实验中,基于标准评分的统计处理允许识别促进口腔闭合的化学品,或者,虽然测定应针对该特定目的进行优化,但化学品可促进口腔开口。在给定的示例中,标准分数的热图可视化允许快速识别化学品#02,并#16作为潜在候选项。

图 4总结了工作流的重要步骤。

Figure 1
图1:切根喂养方法的有效性。A) 与对照仪(左图)相比,在 10 mM MES-KOH(pH = 6.2)中用红细胞B喂养1小时的幼苗明显为红色(右图)。这些图像是在切根喂养后拍摄的,随后在绝对乙醇中过夜孵育,以去除天然植物色素。棒 = 10 毫米 (B) 随着时间的推移,在粘合子中累积的红素 B。在将切根向日葵幼苗转移到染料后,通过分光光度法在植物提取物中检测出红素B,从粘膜提取物中提取8分钟(p值= 0.032)。误差柱指示 SEM. = 指示 p 值 < 0.05 (n = 3)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:叶片温度、孔径和电导的关系,以显示实验设计的灵敏度。A) 代表性图像显示 100 μM ABA 处理 (+ABA) 与未处理(对照)向日葵幼苗之间的叶片温度差异,通过热成像显示 30 分钟后。(B) 左侧:使用 100 μM ABA 处理 30 分钟的植物表明,与对照植物相比,温度升高(* 表示 p 值 < 0.01),n = 3)。右图:对同一植物表皮剥离的气孔孔径的测量显示,气孔孔径(宽度/长度)减少(* 表示 p 值 < 0.01,n = 3,每株的气孔数 = 162)。(C) 用叶孔测量仪测量的叶片电导率,加上叶片温度测量表明,叶表面温度与孔径传导之间存在很强的相关性(皮尔森系数 = -0.89,n = 6)。与控制植物相比,使用 100 μM ABA 处理 30 分钟的植物表现出更高的温度和降低的电导率(n = 6)。(D) 剂量反应研究表明,经过20分钟的处理后,ABA浓度低至5μM的植物的叶片温度降低(p值 = 0.0037,n = 3)。错误栏表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:20种化合物筛选的代表性结果。A) Z-Scores 的热图,反映植物对在三元中测试的 20 种化合物的反应。深红色和深蓝色表示孔口闭合和开口的置信度分别为 >99%。6种植物用DMSO(控制)处理,3个用100μM ABA处理,其他植物用100μM的化学三元处理。对化合物16(C+16)作出反应的植物表现出类似于ABA处理植物的口腔闭合。使用化合物02(C+02)处理的三个植物中有两种表明,口腔开口明显增加。(B) 植物对化合物02和16的反应动力学。对于对控制处理(n = 6)、100 μM ABA (n = 3) 或 100 μM 每个化合物(n = 3)作出反应的植物,显示温度随时间变化的平均变化。误差条表示 SEM. 与对照相比,在 ABA 处理 10 分钟后(p 值 = 0.026,n = 3),C+16(p 值 = 0.030,n = 3)和 C=02(p 值 = 0.044,n = 3)15 分钟处理后,温度变化在统计上始终显著。由于生长室中环境温度的动态控制,所有样品共享的波动是背景噪声。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:筛选工作流摘要。请注意,图像表示重要步骤,彼此独立。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

在给定一天可以测试的化合物数量主要取决于(i) 可用于种植植物和执行屏幕的环境控制空间,以及 (ii) 可以参与协议步骤 6 的人数。我们建议使用三个实验复制来合并统计处理后对结果的解释。在典型的一天中,一到两个人可以通过测试(例如[60 种化学品 + 6 个阴性 (DMSO) 控制 + 3 个阳性 (ABA) 控制] 在早上、中午和下午进行测试,从而毫无困难地筛选出 60 种化合物。

这种方法依赖于健康的幼苗与完全发达的科蒂莱顿。当成像从上面发生时,理想的幼苗应在下皮叶和胆小刀片之间显示90°的角度,以便收集尽可能多的信息。此角度主要由光线调节,因此应通过调整生长条件进行优化。我们的结果表明,一种化学物质到达球菌大约需要10分钟,对ABA等化学物质作出反应需要几分钟的时间。此观察使步骤 6.4 成为协议中时间最敏感的步骤。因此,在给定的测定中,在15分钟内处理所有植物,以避免植物反应之间的差异至关重要。在被动影响叶面温度测量的外部因素中,通风可能会在复制体之间引入与位置相关的偏差或显著变异。用户应谨慎控制通风流量,并在记录前随机分配样本,以限制与位置相关的偏差。为了考虑其他潜在因素,记录应在与种植植物时相似的温度、湿度和光照条件下进行,因为这些条件的任何变化都可能影响气孔闭合和/或叶面温度。最后,应评估能够调节溶性闭合的化合物的毒性。如果化合物触发口腔闭合,情况尤其如此,因为已知它是工厂经历的剧烈压力的间接后果。

通过提供有效的生物活性分子传递方法和直接测量植物蒸腾的方法,该协议解决了与当前筛选方法相关的一些缺点,如导言所述。我们的协议并非对向日葵幼苗独有,可应用于大多数低粘度至90°角的二角。阿拉伯树热成像是18,19有效的,因此我们的方案可以适应具有类似小木鸡的幼苗。此外,叶绿素荧光成像可用于结合测量光合性能。虽然时间效率较低,但如果没有热像仪,则每种化学品中加入的Erythrosine B的粘动量的蒸腾驱动累积量可能可用于评估蒸腾率。总之,这种大规模筛选方法可有效地评估植物叶面对生物活性分子的反应,并易于适应各种应用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了波莫纳学院创业基金和赫希研究启动赠款基金(对FJ)以及波莫纳学院分子生物学项目的支持,该计划通过恒星暑期研究助理计划(到KG)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 plastic growing trays without drain holes Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless Genesee Scientific 22-283NC
Abscisic acid (ABA) Sigma-Aldrich A1049
Air pump Active Aqua AAPA7.8L 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library MicroSource Discovery Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool) Nasco 9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested Sigma-Aldrich D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds Outsidepride.com
Erythrosin B Sigma-Aldrich 200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) General Hydroponics GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Laptop Dell
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel Microsoft
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
ResearchIR Software FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board Insulfoam
Seedholders Araponics N/A
Super Tub (plastic utility tub) Maccourt ST3608 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera FLIR FLIR-T62101 Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter SunSun HW-304B Pro Canister Filter

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