Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen genererer biopartikkelmikroarrayer som gir romlig kontrollert nøytrofil oppvarming. Det gir enkel tilgang til meklerne som nøytrofiler slipper under migrasjon og gir mulighet for kvantitativ bildeanalyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Walters, N., Reátegui, E. Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro. J. Vis. Exp. (156), e60544, doi:10.3791/60544 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nøytrofil svermer er en samarbeidsprosess der nøytrofiler forsegler et infeksjonssted og fremmer vevsomorganisering. Svermer har klassisk blitt studert in vivo i dyremodeller som viser karakteristiske mønstre for cellemigrasjon. In vivo-modellene har imidlertid flere begrensninger, inkludert intercellulære meklere som er vanskelige å få tilgang til og analysere, samt manglende evne til å analysere menneskelige nøytrofiler direkte. På grunn av disse begrensningene er det behov for en in vitro-plattform som studerer svermer med menneskelige nøytrofiler og gir enkel tilgang til molekylære signaler som genereres under sverming. Her brukes en mikrostemplingsprosess med flere trinn til å generere en biopartikkelmikroarray som stimulerer svermen ved å etterligne en in vivo-infeksjon. Biopartikkelmikroarrayet induserer nøytrofiler for å sverme på en kontrollert og stabil måte. På mikroarray øker nøytrofiler i hastighet og danner stabile svermer rundt biopartikkelklynger. I tillegg ble supernatant generert av nøytrofiler analysert og 16 proteiner ble oppdaget å ha blitt differensialt uttrykt i løpet av svermer. Denne in vitro svermende plattformen forenkler direkte analyse av nøytrofil migrasjon og proteinfrigjøring på en reproduserbar, romlig kontrollert måte.

Introduction

Nøytrofiler, den mest rikelig hvite blodlegemer i blodet1, får oppmerksomhet som potensielle diagnostiske og terapeutiske mål2,3 fordi de kan være involvert i en rekke medisinske tilstander inkludert gikt4, sepsis3, traumer5,6, kreft1,7,8, og ulike autoimmune sykdommer5,9. Nøytrofil svermer er en flertrinns, tett regulert prosess med en kompleksitet som gjør det til et spesielt interessant fokus på studie5,10,11. Under svermende isolerer nøytrofiler et sted for betennelse fra det omkringliggende friske vevet5,10,11. Riktig regulering av nøytrofil swarming er avgjørende for å fremme sårheling og til slutt betennelse oppløsning5,12. Nøytrofil svermer har primært blitt studert in vivo i gnager12,13,14,15 og sebrafisk10,11,12,15 modeller. Men arten av disse in vivo dyremodeller gir opphav til begrensninger5. For eksempel er meklerne utgitt av nøytrofiler under svermer ikke lett tilgjengelig for analyse5. I tillegg er det mange potensielle kilder for en gitt mekler in vivo, så et in vivo-eksperiment må introdusere en genetisk mangel for å hemme cellulær produksjon og / eller interaksjon for å undersøke rollen til den mekleren i en gitt prosess13. Et in vitro eksperiment omgår denne komplikasjonen ved å aktivere nøytrofil observasjon uten sammenheng med flere celler. I tillegg er forskning som beskriver menneskelig nøytrofil koordinert migrasjon begrenset16. På en in vitro-svermende plattform kan menneskelige nøytrofiler analyseres direkte. En in vitro swarming plattform kan utvide på kunnskapen fra in vivo studier ved å gi muligheter til å fylle hullene igjen av begrensningene i in vivo studier.

For å løse behovet for en in vitro-plattform som etterligner in vivo nøytrofil sverm, utviklet vi en mikrostemplingsplattform som gjør oss i stand til å mønstre biopartikkelmikroarrayer som stimulerer nøytrofil svermpå en romlig kontrollert måte. Vi genererer biopartikkelmikroarrayer på glasssklier i en totrinnsprosess. For det første bruker vi mikrostempling for å generere en mikroarray av kationiske polyelektrolyttflekker (CP). For det andre legger vi til en løsning av biopartikler som holder seg til CP-flekkene via elektrostatisk interaksjon. Ved først å mønstre CP-laget, kan vi selektivt mønstre negativt ladede biopartikler for å generere ønsket nøytrofil svermende mønster. Det positivt ladede laget holder de negativt ladede biopartiklene gjennom det kraftige vasketrinnet som fjerner biopartiklene fra områdene på glasssklien som ikke har CP. I tillegg er CP som brukes her, en kopolymer av akrylamid og kvartærisert kationisk monomer, biokompatibel, så det induserer ikke et svar fra nøytrofiler. Den har en svært høy overflateladning som immobiliserer mikron-størrelse biopartikler til glasslysbildet, og dermed hemmer nøytrofiler fra å fjerne partiklene fra mønstret posisjon på glasslysbildet. Dette resulterer i biopartikkelklynger arrangert i en mikroarray. Da vi la nøytrofiler til mikroarrayet, dannet de stabile svermer rundt biopartikkelklyngene. Gjennom sporing nøytrofil migrasjon, fant vi at svermende nøytrofiler aktivt migrere mot biopartikkelklynger. Videre brukte vi denne plattformen til å analysere visse meklere som nøytrofiler slipper under sverm. Vi fant 16 meklere som er differensialt uttrykt under sverm. Deres konsentrasjoner følger tre generelle trender over tid: økning, reduksjon eller pigg. Vår in vitro nøytrofil svermende plattform forenkler analysen av romlig kontrollert menneskelig nøytrofil sverm, samt innsamling og analyse av meklere utgitt av nøytrofil sverm. I en tidligere publikasjon viste vi at pasienter med visse medisinske tilstander (traumer, autoimmun sykdom og sepsis), hadde nøytrofiler som fungerte annerledes enn de fra friske donorer5. I fremtidige forskningsstudier kan plattformen vår brukes til å analysere nøytrofilfunksjon blant en rekke pasientpopulasjoner. Denne plattformen kan kvantitativt analysere den komplekse koordineringen som er involvert i nøytrofil oppvarming. Ytterligere studier kan gjøres for å gi innsikt i nøytrofilfunksjonen til en bestemt pasientpopulasjon eller nøytrofil respons på et patogen av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forfatterne erkjenner de friske frivillige som vennlig donerte sitt blod. Blodprøver ble innhentet etter informert frivillig samtykke i henhold til institusjonell gjennomgang styret (IRB) protokollen #2018H0268 gjennomgått av Biomedical Sciences Committee ved The Ohio State University.

1. Mikrofabrikasjon av biopartikkel mikroarray

  1. Bruk standard fotlitografiprosedyrer, generer hovedsilisiumwaferen.
    1. Generer et bevis på ønsket design ved hjelp av en dataassistert design (CAD)-programvare, og send deretter til en fotomaskeprodusent for å produsere en kromfotomaske. Designet som brukes her er 4 mm x 4 mm rektangulære arrayer på 30 μm diameter fylt i sirkler med en 150 μm senter-til-senter avstand. Denne utformingen kan endres etter ønske for ulike applikasjoner.
    2. Spincoat en 40 μm tykt lag av en negativ photoresist på en silisium wafer. Stek wafer ved 65 °C i 5 min og 95 °C i 10 min.
    3. Utsett wafer for UV-lys gjennom en krom fotomaske med 150–160 mJ/cm2 (figur 1A).
    4. Stek wafer ved 65 °C i 5 min og 95 °C i 10 min. Nedsenk wafer i fotoresist utvikler i 10 min og skyll med isopropylalkohol. På dette stadiet skal mønsteret være synlig på wafer (Figur 1B).
  2. Bland grundig et 10:1-forhold med polydimetylsiloxanprepolymer og herdemiddelet (dvs. 20 g prepolymer og 2 g herdingsmiddel) og hell den uherdede polydimetylsiloxanblandingen over masterwaferen i en Petriskål (figur 1C).
  3. Vakuum behandle den uherdede PDMS blandingen til ingen luftbobler er til stede over master wafer. Cure ved 65 °C over natten.
  4. Bruk en skalpell til å skjære rundt utsiden av den mønstrede delen av wafer, og fjern sakte den herdede PDMS-skiven. Plasser PDMS-skiven på et rent skjærebrett med mønstret side vendt opp (figur 1D).
  5. Slå ut individuelle frimerker fra PDMS skive med en 8 mm biopsi punch (Figur 1E). For ett glasslysbilde vil det være behov for åtte frimerker.
  6. Plasser hvert stempel med forsiden ned på tape for å fjerne rusk.
  7. På forhånd, utarbeide en 1,6 mg / ml oppløsning av CP i vann.
    1. Tilsett riktig mengde CP pulver til vann (f.eks. 0,8 g til 500 ml).
    2. Bland på en røreplate ved romtemperatur over natten, eller til alt faststoffet er oppløst i vannet. CP-løsningen kan oppbevares ved romtemperatur i 6 måneder.
    3. Hvis ønskelig, gjør CP-løsningen fluorescerende ved å tilsette poly-L-lysin merket med fluorescein isotiocyanat (PLL-FITC).
      1. Aliquot ca 10 ml av CP-løsningen. Legg til en liten mengde PLL-FITC (0,05 mg) i det alisiterte volumet. Mengden kan endres for å justere lysstyrken på fluorescens etter ønske.
      2. Vortex CP-løsningen merket med FITC i 20 s, eller til løsningen er en jevn, blek gul farge. Beskytt mot lys og oppbevar ved 4 °C i opptil 1 måned.
  8. Med frimerkene med forsiden opp, prime hvert stempel med 100 μL av 1,6 mg / ml oppløsning av CP, noe som sikrer ingen luftbobler dannes mellom CP-løsningen og stempelet (Figur 1F).
  9. Snu frimerkene på et lag med CP-oppløsning (figur 1G).
  10. Fjern frimerkene fra CP-løsningen etter 1 t.
  11. Dab hvert vått stempel med forsiden ned på et rent glass lysbilde 6-8x for å fjerne overflødig væske.
  12. Vakuum behandler frimerkene i 1–2 min.
  13. Fest en åtte brønn, 9 mm diameter bildeavstand på toppen av et rent glasslysbilde som en veiledning for stempelplassering. Med denne avstandsstykket kan hvert glasslysbilde ha åtte mikroarrayer.
  14. Plasser et stempel med forsiden ned på glasslysbildet i midten av hver brønn av bildebehandlingsavstandsprogrammet (dvs. bruk åtte frimerker totalt).
  15. Legg en 5,6 ± 0,1 g balansert vekt på toppen av hvert stempel og la 10 min for stempling (Figur 1H). En balansert vekt er nødvendig for å sikre at stempelet trykkes jevnt på glasssklien og fremme jevn overføring av CP til glasslysbildet.
  16. Fjern vektene og frimerkene fra glasslysbildet (figur 1I). La CP-laget tørke ved romtemperatur i 24 timer før du tilsetter biopartiklene, som beskrevet i trinn 1,17. Hvis CP er merket med FITC, kan effektiviteten av stemplingen kontrolleres på dette punktet med et fluorescerende mikroskop på 488 nm før du fortsetter til trinn 1.17 (Figur 1M).
  17. Skjær en tom PDMS skive til størrelsen på bildebehandlingsavstandsstykket og bruk 8 mm biopsislag for å lage brønner i PDMS som samsvarer med brønnene til en bildebehandlingsavstandsstykke. Fest PDMS-platen til glasslysbildet med bildebehandlingsavstandsprogrammet (Figur 1J).
  18. Tin en løsning av biopartikler (f.eks. coli eller zymosan) og fortynn til 500 μg/ml i vann til injeksjon (WFI).
    MERK: Biopartiklene trenger ikke å opsoniseres. Nøytrofile overflatereseptorer gjenkjenner direkte molekyler på disse biopartiklene19,20,21.
  19. Tilsett 100 μL biopartikkeloppløsning til hver PDMS-brønn på glasssklien (figur 1K).
  20. Rock glasssklien i 30 min.
  21. Skyll brønnene grundig med vann. Biopartikkelmikroarrayet kan lagres i et støvfritt miljø ved 4 °C i opptil 3 måneder. På dette tidspunktet bør mønsteret kontrolleres med et fluorescerende mikroskop på 594 nm før du går videre til trinn 2.1 (Figur 1N).

2. Prøve forberedelse

  1. Samle minst 2 ml friskt blod i K2-EDTA-rør fra ønsket donor. Forventet utbytte av nøytrofiler er 1-2 x 106 celler / 1 ml fullblod. Bildeanalysen krever ca. 1,5 x 105 nøytrofiler, og analysen av supernatanten krever 1 x 106 nøytrofiler. Bruk blodet innen 4 timer.
  2. Separate røde blodlegemer (RBC) ved å legge til et erytrocyttaggregasjonsmiddel i et 1:5-forhold til hele blodet. Vent 45 min for et gjennomskinnelig lag (buffy coat) for å skille fra laget av RbCer.
  3. Fjern buffy pels og vask med fosfat bufret saltvann (PBS) ved hjelp av 1 ml buffy pels: 9 ml PBS.
  4. Sentrifuge i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  5. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten på 5 x 107 celler/ml.
  6. Bruk et negativt immunmagnetisk utvalgssett for å isolere nøytrofiler.
    1. Tilsett 50 μL antistoffcocktail/1 ml cellesuspensjon. Vent 10 min.
    2. Tilsett 100 μL magnetiske perler/1 ml cellesuspensjon. Vent 10 min.
    3. Legg cellesuspensjon til et rundt bunnrør og legg i en sylindrisk magnet. Vent 10 min.
  7. Hell supernatant i et sentrifugerør. Legg til opptil 10 ml PBS. Sentrifuge i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  8. Aspirer supernatant. Resuspend er hvit pellet i IMDM med 0,4 % humant serumalbumin.
  9. Flekkkjerner med 20 μg/ml Hakkechst 33342 for 10 min ved 37 °C.
  10. Tilsett 5 ml IMDM med 0,4 % humant serumalbumin for å skylle. Sentrifuge i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  11. Resuspender celler ved 7,5 x 105 celler/ml i IMDM med 0,4 % humant serumalbumin.
  12. Tilsett 100 μL av cellesuspensjonen til en PDMS-brønn som inneholder en biopartikkelmikroarray. Kontroller at cellesuspensjonen er konveks over toppen av PDMS-brønnen og inneholder ingen bobler.
  13. Forsegling med en 12 mm diameter dekselslip. Dekk åpningen av PDMS godt med en 12 mm diameter dekselslip. Trykk forsiktig ned på dekkslip med pinsett slik at overflødig celle suspensjon rømmer til kanten av brønnen. Bruk et vev for å fjerne overflødig cellesuspensjon.

3. Kjøre analysen og bildeanalysen

  1. Last mikropartikkelarray med celler på live cellebildestasjon med et mikroskop utstyrt med et burinkubator satt til 37 °C, 5 % CO2og 90 % relativ fuktighet.
  2. Bruk time-lapse fluorescerende og brightfield mikroskopi for å ta opp bilder på 10x forstørrelse hver 10 s på 405 nm, 594 nm, og brightfield. I et typisk eksperiment samles bilder opp til 2 timer.
  3. Bruk en automatisert cellesporingsprogramvare til å spore migrering av individuelle nøytrofiler mot biopartikkelklyngen.
    1. Bruk autoregresjonsmodus for en spotgjenkjenningscellesporingsprogramvare. Sett spotradiusen til 5 μm (den omtrentlige størrelsen på en nøytrofilkjerne). Sett minimumslengde for spor til 120 s og en maksimal avstandsstørrelse på én ramme.
    2. Fra dataene som genereres av cellesporingsprogramvaren, pakker du ut filene som inneholder nøytrofilposisjon og hastighet. Disse filene kan brukes med en graferprogramvare for å generere nøytrofile migrasjonsspor (figur 2C) og et varmekart over hastighet vs. tid ( henholdsvisfigur 2D).
  4. Bruk 405 nm fluorescerende bilder for å spore svermstørrelse over tid på en bildeanalyse programvare etter eget valg.
    1. Definer områder av interesse (ROIer) rundt hver biopartikkelklynge hvor nøytrofiler vil sverme. Behold samme størrelse roi for å analysere hver biopartikkelklynge.
    2. Analyser gjennomsnittlig fluorescerende intensitet av de 405 nm-bildene innenfor hver avkastning over tid.
    3. Generer en kalibreringskurve av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet til svermstørrelse ved å ta manuelle målinger i ulike svermstørrelser fra 0 μm2 til maksimal svermstørrelse. Bruk denne kalibreringen til å beregne svermstørrelsen over tid.

4. Supernatant samling og proteindeteksjon

  1. Inkuber nøytrofiler i brønnene som inneholder biopartikkelmikroarrayved 37 °C og 5 % CO2 i 3 timer. Ta prøver på ønskede tidspunkter. Vanligvis vil prøver bli tatt på 0, 0,5, 1 og 3 t. For å overvinne grensen for påvisning av proteinarrayanalysen, ble hele volumet av supernatant av en enkelt brønn (200 μL) brukt for hvert tidspunkt. Hvert tidspunkt ble analysert i triplicate.
  2. Ved hjelp av et brightfield-mikroskop må du kontrollere at svermer dannes på mikroarrayet.
  3. Aspirer supernatanten med en 200 μL pipette og last i et 0,45 μm sentrifugefilterrør.
  4. Sentrifuge supernatant en 190 x g og 20 °C i 5 min og samle det filterte volumet.
  5. Oppbevar prøvene ved -80 °C til behandlingstiden.
  6. Bruk et mikroarraysett som oppdager en rekke menneskelige proteiner for å behandle prøver.
    1. Tilsett 200 μL av hver prøve til et separat dialyserør som følger med settet.
    2. Plasser dialyserørene i et beger som inneholder minst 500 ml PBS (pH = 8,0). Rør forsiktig på en røreplate i minst 3 timer ved 4 °C. Endre PBS i begeret og gjenta dette trinnet.
    3. Overfør hver prøve til et rent sentrifugerør og sentrifuge ved 9000 x g i 5 min for å fjerne eventuelle utfellinger. Overfør hver supernatant til et rent rør.
    4. Biotinylate hver prøve ved å legge til 36 μL av 1x merking reagens fra settet per 1 mg totalt protein i dialyzed prøven til 180 μL dialyzed prøve. Inkuber ved 20 °C i 30 min. Bland forsiktig hver 5 min.
    5. Tilsett 3 μL stoppoppløsning som følger med settet i hvert prøverør. Overfør hver prøve til et friskt dialyserør og gjenta trinn 4.6.2–4.6.3. På dette stadiet kan prøven lagres ved -20 °C eller -80 °C til du er klar til å fortsette.
    6. Glasssklien som følger med settet, lagres ved -20 °C. La det komme til romtemperatur. Plasser den monterte glasssklien i en lamial strømningshette i 1–2 timer ved romtemperatur.
    7. Tilsett 400 μL av blokkeringsbufferen som følger med settet i hver brønn av det monterte glasslysbildet. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
    8. Sentrifuge de forberedte prøvene for 5 min ved 9000 x g for å fjerne utfellinger eller partikler. Fortynn 5x med blokkeringsbuffer.
    9. Fjern blokkeringsbufferen fra hver brønn. Tilsett 400 μL av de fortynnede prøvene i de riktige brønnene. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur mens du gynger.
    10. Dekanter prøvene fra hver brønn. Vask 3x med 800 μL av 1x vaskebufferen jeg utstyrte med settet ved romtemperatur i 5 min hver mens du gynger.
    11. I en ren beholder, senk det monterte glasslysbildet i 1x vaskebuffer I. Vask 2x ved romtemperatur i 5 min hver mens du gynger.
    12. Tilsett 400 μL cy3-konjugert streptavidin til hver undermatrise. Dekk med plast lim strimler. Beskytt mot lys for resten av protokollen.
    13. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur mens du gynger.
    14. Dekanter løsningen og demonter glasssklien fra prøvekamrene.
    15. I 30 ml sentrifugerør som følger med settet, legg forsiktig til glasssklien og nok 1x vaskebuffer I til å dekke glasssklien. Vask 3x i 10 min hver ved romtemperatur mens du gynger.
    16. I 30 ml sentrifugerør, vask 2x med 1x vask buffer II i 5 min hver ved romtemperatur mens du gynger.
    17. Vask glasssklien med 30 ml ddH2O i 5 min. Fjern glasssklien fra sentrifugerøret og la det tørke i 20 min i en lamiastrømningshette. Det tilberedte glasssklien kan oppbevares ved -20 °C til den er klar til skanning.
    18. Skann glasssklien med en mikroarrayskanner ved en fluorescensutslipp på 555 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når nøytrofiler legges til biopartikkelmikroarrayet, blir nøytrofiler som kontakter biopartikkelklyngene aktivert og starter den svermende responsen. Biopartikkelmikroarrayet ble validert ved hjelp av time-lapse fluorescerende mikroskopi for å spore nøytrofil migrasjon mot biopartikkelklyngene (Video S1). Migreringen av individuelle nøytrofiler kjerner spores når de migrerer mot biopartikkelklyngen. Når nøytrofiler når biopartikkelklyngen, overlapper kjernene med andre kjerner i klyngen. Dermed er det ikke mulig å nøyaktig spore en nøytrofil i klyngen ved hjelp av denne metoden. Zymosan og E. coli biopartikkelklynger resulterer begge i generering av nøytrofile svermer. For våre resultater bruker figur 2B data fra nøytrofile svermer generert av E. coli partikler. Figur 3 og de andre panelene i figur 2 bruker nøytrofile svermer generert av zymosanpartikler. Resultatene som oppnås viser at biopartikkelklynger stimulerer nøytrofilaktivering når en nøytrofil kontaktet klyngen, noe som til slutt førte til dannelsen av stabile nøytrofile svermer rundt hver klynge etter 30–60 min (figur 2A, topp). Nøytrofiler viste derimot ikke kollektiv migrering i fravær av biopartikkelklynger (Figur 2A,bunn og Video S2). Ved hjelp av fluorescerende intensitet av farget nøytrofilkjerner ved 405 nm, ble gjennomsnittlig nøytrofil svermstørrelse rundt 30 μm diameter E. coli biopartikkelklynger funnet å være 1490 ± 680 μm2 (gjennomsnitt ± SD, figur 2B, topp). Fluorescensintensiteten til en gitt interesseregion der det ikke finnes biopartikkelklynger var omtrent konstant over tid, noe som bekreftet fraværet av kollektiv migrasjon i denne innstillingen (figur 2B, bunn). Spor av nøytrofil migrasjon viser at nøytrofiler konvergerte på en biopartikkelklynge da man var til stede (Figur 2C, topp). Omvendt ble det ikke observert konvergens i kontrollsystemet (figur 2C, bunn). Hastigheten (distanse reist/tid) av svermende og ikke-aktiverte nøytrofiler ble målt og en statistisk signifikant forskjell i hastighetsfordelingene ble funnet (ANOVA, p < 0.0001), som vist i figur 2D. Gjennomsnittshastigheten for svermende nøytrofiler var 20,6 ± 13,0 μm/min (gjennomsnitt ± SD), og gjennomsnittshastigheten for kontrollnøytrofiler var 2,0 ± 2,2 μm/min.

I tillegg ble konsentrasjonen av 16 proteiner som nøytrofiler som ble utgitt under sverming analysert (figur 3). Normalisert konsentrasjon av hvert protein på forskjellige tidspunkter i svermprosessen (t = 0, 0,5, 1 og 3 timer) ble beregnet, hvor normalisert konsentrasjon er (C – Cmin)/ (Cmaks – Cmin). 10 proteiner økte i konsentrasjon gjennom hele svermen. Disse proteinene var adipsin, galectin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 og TLR2. To proteiner (pentraxin 3 og RANK) redusert i konsentrasjon gjennom hele svermen. De resterende fire proteinene (clusterin, PF4, RANTES og Trappin-2) økte i løpet av den første timen med sverm, men redusert deretter. Med andre ord, konsentrasjonene av disse proteinene "piggete" under sverm. Av de 16 proteinene som ble identifisert, ble 12 proteiner identifisert i vår forrige publikasjon5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 og TLR2 ble vist å være svermende-spesifikke, mens clusterin, IL-6R, MMP-8, og MMP-9, RANK, og trappin-2 var ikke5.

Figure 1
Figur 1: Produksjon av biopartikkelmikroarray. En silisium wafer belagt med negativ photoresist er utsatt for UV-lys gjennom en krom fotomaske (A). Etter at silisiumwaferen er bakt og utviklet, forblir et fotoresistmønster på overflaten av silisiumwaferen. Dette er master wafer (B). I en Petri-tallerken legges en PDMS-blanding til toppen av masterwaferen. PDMS er kurert over natten ved 65 °C for å danne PDMS-formen (C). PDMS-formen er kuttet fra master wafer og en biopsi punch brukes til å slå ut individuelle PDMS frimerker (D). Et PDMS-stempel (E) er belagt med CP-oppløsning (F). Stempelet er invertert på et tynt lag med CP-oppløsning (G). Etter inkubering i CP-oppløsningen i 1 time, er stempelet blottet på et glasslysbilde for å fjerne overflødig CP. Åtte frimerker trykkes deretter på et rent glasslysbilde med en 5,6 ± 0,1 g vekt, justert med en bildebehandlingsavstandsbryter (H). Når stempelet fjernes, forblir et CP-mønster (I). En PDMS skive med precut brønner er festet til glasslysbildet (J). Deretter legges en biopartikkelløsning over CP-mønsteret (K). De negativt ladede biopartiklene binder seg til den positivt ladede polyelektrolytten via elektrostatisk interaksjon. Den overskytende biopartikkeloppløsningen vaskes bort, slik at biopartikler er mønstret på toppen av CP-mønsteret (L). (M) Fluorescerende bilde av CP-laget merket med FITC (Skalastenger = 50 μm, stort bilde; Skalabar = 25 μm, innfelt). (N) Fluorescerende bilde av mønstrede zymosan biopartikler konjugert med Texas Red (Skala bar = 100 μm, stort bilde; Skalabar = 50 μm, innfelt). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Nøytrofil svermvekst rundt biopartikkelklynger. I nærvær av biopartikkelklynger gjennomgår nøytrofiler kollektiv migrasjon mot biopartikkelklyngene (bunn, kontroll nøytrofiler). Når det ikke finnes biopartikler, utfører nøytrofiler ikke kollektiv migrasjon. (A) I nærvær av zymosan biopartikkelklynger danner nøytrofiler svermer i 30 min. Uten biopartikkelklynger dannes ingen svermer (Skalastenger = 50 μm). (B) Nøytrofile svermer vokser til en gjennomsnittlig størrelse på 1490 ± 680 μm2 (gjennomsnitt ± SD) rundt 30 μm diameter E. coli biopartikkelklynger. Kontroll nøytrofiler viser en konstant tetthet som tilsvarer ingen sverm vekst (ANOVA, p < 0,0001, n = 32 nøytrofile svermer, N = 1 donor, feillinjer = standardavvik). (C) Spor av svermende nøytrofiler konvergerer på zymosan biopartikkelklynger, mens kontroll nøytrofiler viser ingen konvergerende punkt (Skala barer = 50 μm). (D) Nøytrofiler som svermer mot et zymosanmål har en gjennomsnittshastighet på 20,6 ± 13,0 μm/min (gjennomsnitt ± SD), mens kontrollnøytrofiler har en gjennomsnittlig hastighet på 2,0 ± 2,2 μm/min. Hver telling på varmekartet representerer en nøytrofil med gitt øyeblikkelig hastighet på gitt tidspunkt. Disse varmekartene er representative for ett eksperiment (n = 1 sverm; N = 1 donor; ANOVA, 6114 = svermende nøytrofiler, 32 116 = kontroll nøytrofiler, p < 0,0001). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Frie meklere utgitt av svermende nøytrofiler. Nøytrofil sverm påvirker produksjonen av ulike proteiner over tid. Proteinkonsentrasjonble målt til 0, 0,5, 1 og 3 timer. Datapunktene ble utstyrt med utjevning splines (λ = 0,05). Disse proteinene har en tendens til å følge en av tre karakteristiske trender: avtagende over tid, øke over tid, eller spiking rundt 1 t og deretter redusere (Feilbarer = standardavvik; n = 3 replikerer; N = 1 donor). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Video S1: Nøytrofil svermer mot zymosan biopartikkelklynger. Nøytrofilkjerner er vist i blått. Zymosan mål er merket med røde sirkler (Skala bar = 50 μm; opprinnelige oppkjøpstid = 60 min). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S2: Ikke-aktivert nøytrofil tilfeldig migrering. Nøytrofilkjerner er vist i blått (Skalabar = 50 μm; original innhentingstid = 60 min). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi utviklet en mikrostemplingsplattform for å generere ensartede arrayer av biopartikler for å stimulere in vitro nøytrofil sverm. Den in vitro natur vår plattform tillater oss å omgå komplikasjoner som oppstår med in vivo svermende eksperimenter, nemlig den dårlige evnen til å analysere meklere utgitt av svermende nøytrofiler5. I tillegg utføres in vivo-modeller vanligvis i gnagere11,12,13,15,22,23eller sebrafisk11,12,15,23. Vår plattform bruker menneskelige nøytrofiler, noe som gjør oss i stand til å mer direkte tolke våre resultater i sammenheng med menneskelig sykdom, selv om visse likheter mellom mus og menneskelige nøytrofiler har blitt observert5,11. I tillegg opprettholder vi et romlig kontrollert svermende miljø som skiller vår plattform fra in vivo-modeller ved å gi et høyt nivå av reproduserbarhet som letter analysen av menneskelig nøytrofil kollektiv migrasjon samt innsamling og analyse av meklere utgitt av svermende nøytrofiler.

Under utviklingen av vår mikrostempelprotokoll oppsto det flere utfordringer som krevde nøye feilsøking. For det første er CP som brukes til mikrostempling svært hydrofile, og PDMS-frimerkene er hydrofobe. Fordi CP ikke har en høy affinitet for PDMS, ble vår prosedyre nøye utformet for å unngå dannelse av bobler og fremme fukting. Ved først å grunne stempelet med CP mens vi vender opp (trinn 1,8), minimerer vi dannelsen av bobler mellom CP og stempelet. Stempelet blir deretter invertert på et lag med CP og inkubert i 1 t. Denne lange inkubasjonstiden sikrer at hver del av stempelet blir fuktet. For det andre kan prosessen med å fjerne overflødig CP før stempling på et rent glasslysbilde (trinn 1.11) være inkonsekvent. Mens du utfører trinn 1.11, må stempelet undersøkes nøye. Når mønsteret begynner å bli synlig, er stempelet klart for trinn 1.12. I tillegg kan ønsket vakuumtid for å tørke frimerkene (trinn 1.12) variere. Dette er først og fremst avhengig av været. På en varm, fuktig dag er det nødvendig med 2 min vakuumtid. På en kjølig, tørr dag er 1 min vakuumtid tilstrekkelig.

Vi har vist at nøytrofiler fra friske donorer danner stabile svermer rundt biopartikkelklynger. Med time-lapse fluorescerende mikroskopi, kan vi kvantifisere sverm størrelse og spore nøytrofil migrasjon, som gjør oss i stand til å analysere nøytrofil chemotaxis kvantitativt5. For eksempel har vi tidligere vist at denne plattformen kan brukes til å beregne kjemotaktisk indeks (CI, cosinus av vinkelen mellom nøytrofil hastighet vektor og posisjon vektor mellom nøytrofile og nærmeste biopartikkel klynge), hastighet (avstand nøytrofile reiser delt etter tid),radial hastighet (hastigheten multiplisert med CI), og den totale avstanden reist (forskjellen mellom første og endelig nøytrofil posisjon) av individuelle migrerende nøytrofile s . I motsetning til de fleste in vitro studier24,25,26, vår plattform har ikke en kunstig kjemotaktisk gradient, så nøytrofil intercellulær kommunikasjon er den eneste drivkraften for nøytrofil migrasjon. I tillegg er supernatanten generert av svermende nøytrofiler lett tilgjengelig. Vi kan samle inn og analysere supernatanten for intercellulære meklere utgitt av nøytrofiler uten forstyrrelser fra andre celletyper som er tilstede i vivo. 16 proteiner ble observert hvis uttrykk under sverming kunne beskrives som en av tre trender: økning (10 proteiner), reduksjon (to proteiner) og pigg (fire proteiner). Seks av disse proteinene bekreftet tidligere rapporterte trender under svermende over tid5. Noen av de identifiserte proteinene ble tidligere vist å være svermende spesifikke, mens andre ble uttrykt differensielt av aktiverte ikke-svermende nøytrofiler5. Proteiner som øker konsentrasjonen over tid er sannsynligvis forbundet med pro-betennelse respons. Noen av proteinene som øker konsentrasjonen over tid er allerede kjent for å være involvert i den proinflammatoriske responsen (f.eks. galectin-3 og MMP-9)27,28. Forholdet mellom andre proteiner og betennelse er mindre godt forstått. Proteinene som spike eller reduksjon under svermer kan være involvert i regulering av betennelse. Imidlertid er videre forskning nødvendig for å forstå rollen i betennelse i mange av proteinene som er differensialt uttrykt under sverm. Analysere utgitte meklere sammen med nøytrofil migrasjon kan hjelpe oss å bedre forstå det komplekse bildet av betennelse og hvordan nøytrofiler påvirker det omkringliggende vevet under sverm.

I fremtidige studier kan plattformen vår brukes til å grundig studere evnen til usunne nøytrofiler til å generere stabile svermer rundt mønstrede biopartikkelklynger. Ulike medisinske tilstander har vært relatert til nøytrofiler, inkludert sepsis3, traumer6, og kreft1,8,17,18, noe som tyder på nøytrofiler hos disse pasientene kan ha endret funksjon. Denne plattformen kan brukes til å undersøke forskjeller mellom de intercellulære meklerne utgitt av sunne og usunne nøytrofiler. I tillegg kan denne plattformen endres til mønster levende mikrober og brukes til å analysere nøytrofil respons til levende mikrober in vitro.

Til slutt har vi utviklet en ny plattform for å analysere nøytrofil svermende in vitro. Plattformens svært kontrollerte natur gjør det mulig for oss å redusere problemer som oppstår under in vivo nøytrofile svermende eksperimenter. Nøytrofil svermer på en biopartikkel mikroarray er lett kvantifiserbar via time-lapse fluorescerende mikroskopi. I tillegg kan vi samle meklerne utgitt av nøytrofiler uten forstyrrelser av andre vev som er tilstede i vivo. Denne plattformen kan brukes i fremtidig forskning for å kvantifisere forskjeller mellom migrasjonsatferden til nøytrofiler fra sunne og usunne donorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering og Comprehensive Cancer Center ved The Ohio State University. Data som presenteres i denne rapporten kom fra bilder behandlet ved hjelp av Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) tilgjengelig på Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Dette anlegget støttes delvis av stipendP30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18001 Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator Okolab 777057437 / 77057343 Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit STEMCELL Technologies 17957 Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2 Nikon Instruments MEA54010 / MEF55037 Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch Sigma Aldrich Z708925 To cut PDMS stamps
HetaSep STEMCELL Technologies 7906 Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array Raybiotech Inc. AAH-BLG-1000-4 High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA) Sigma Aldrich A5843 Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053 To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes Thermo Fisher Scientific 02-657-32 Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask Front Range Photomask N/A Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner Perkin Elmer ASCNGX00 Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris Bitplane 9.3.0 Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package Nikon Instruments MQS31100 Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) Sigma Aldrich P3069-10MG 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer Grace Bio-Labs 654008 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer University Wafer 590 Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater Laurell WS-650MZ-23NPPB Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025 MicroChem 2025 Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) Dow 1673921 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System Kloé UV-KUB 2 Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water Thermo Fisher Scientific A1287303 High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185 BASF 8185 Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen Z2843 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16, (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25, (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1, (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84, (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99, (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100, (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273, (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16, (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10, (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1, (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37, (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14, (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34, (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11, (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598, (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22, (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760, (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10, (1), 92-107 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics