स्तन कैंसर मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और फेफड़ों में बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए वीवो इमेजिंग में पूंछ नस मेटास्टेसिस Assays और वास्तविक समय का संयुक्त उपयोग

Cancer Research

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Summary

वर्णित दृष्टिकोण वीएवो लाइव एनिमल इमेजिंग में प्रायोगिक पूंछ नस मेटास्टेसिस परख को जोड़ती है ताकि फेफड़ों में मेटास्टेसिस संख्या और आकार की मात्रा के अलावा स्तन कैंसर मेटास्टेसिस गठन और विकास की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति दी जा सके।

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Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

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Abstract

मेटास्टैसिस कैंसर से होने वाली मौतों का मुख्य कारण है और मेटास्टैटिक रोग के रोगियों के लिए सीमित चिकित्सीय विकल्प हैं। उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और परीक्षण जो मेटास्टैटिक रोग के लिए बेहतर उपचार के विकास को सुगम बनाएगा, वीवो मॉडल में प्रीक्लिनिकल की आवश्यकता है। यहां प्रदर्शित स्तन कैंसर मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और बाद के विकास परसने के लिए एक सिंजेनिक माउस मॉडल है। मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं को वायरल वेक्टर एन्कोडिंग जुगनू लूसिफ़ेरेस और जेडएसग्रीन प्रोटीन के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया जाता है। उंमीदवार जीन तो बेसिफ़ेरेज़/ZsGreen-कैंसर की कोशिकाओं को व्यक्त करने में छेड़छाड़ कर रहे है और फिर कोशिकाओं को पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्शन के लिए परख मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और विकास कर रहे हैं । एक में वीवो इमेजिंग डिवाइस तो समय के साथ मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए जीवित जानवरों में ट्यूमर कोशिकाओं के बायोल्यूमिनेसेंस या फ्लोरेसेंस को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति फेफड़ों में मेटास्टेज की संख्या और आकार को अनुभागन या हिस्टोलॉजिकल धुंधला की आवश्यकता के बिना प्रयोग के अंत में निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और विकास में उम्मीदवार जीन की भूमिका का परीक्षण करने का अपेक्षाकृत त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है, और पारंपरिक पूंछ नस मेटास्टैसिस परख ों की तुलना में बहुत अधिक जानकारी प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम बताते हैं कि स्तन कैंसर कोशिकाओं में पीडीजेड-बाध्यकारी आकृति (TAZ) के साथ हां संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) और ट्रांसक्रिप्शनियल सह-सक्रियक के एक साथ नॉकआउट से फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ कम हो जाता है और यह कम बोझ काफी बिगड़ा मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और मेटाटैस के कम विकास का परिणाम है।

Introduction

कैंसरदुनिया भर में मौत का दूसरा प्रमुख कारण बना हुआ है और मेटास्तासिस इनमें से अधिकांश मौतों के लिए जिम्मेदार है2,3. हालांकि, मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और बाद के विकास को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों की सीमित समझ ने मेटास्टैटिक रोग के लिए प्रभावी उपचार के विकास में रुकावट पैदा की है। उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के लिए एक परख की आवश्यकता है कि कैसे बेफिक्र अभिव्यक्ति या एक उंमीदवार जीन के समारोह मेटाटैसिस गठन और विकास को प्रभावित करता है । जबकि ऑटोकॉन्सस माउस मॉडल के अपने फायदे हैं, वे समय लेने वाले और उत्पन्न करने के लिए महंगे हैं, जिससे उन्हें लक्ष्य खोज के बजाय लक्ष्य सत्यापन के लिए अधिक अनुकूल बनाया जा सकता है। प्रत्यारोपण मॉडल सिस्टम जिसमें उम्मीदवार जीन विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में बेफिक्र है और फिर मेटास्टैटिक क्षमता पर प्रभाव वीवो में मूल्यांकन कर रहे हैं, कम महंगे और ऑटोकॉन्सस मॉडल की तुलना में अधिक थ्रूपुट हैं । इसके अलावा, RNAi, CRISPR/CAS9 के स्थिर वितरण के लिए वायरल वैक्टर, और ट्रांसजीन व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, यह अपेक्षाकृत आसान लगभग किसी भी जीन या एक कैंसर सेल लाइनों में ब्याज के जीन क्षतः परेशान करने के लिए बना रही है । इस दृष्टिकोण का उपयोग मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण में उम्मीदवार जीन की भूमिका और मानव कैंसर सेल लाइनों में वृद्धि को इम्यूनोसमझौता या मानवीकृत चूहों में कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके परख करने के लिए भी किया जा सकता है।

वीवो में प्रत्यारोपित कैंसर कोशिकाओं द्वारा मेटास्टेसिस गठन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले दो प्रकार के परख सहज मेटास्टेसिस परख और प्रायोगिक मेटास्टेसिस परख हैं । सहज मेटास्तासिसपरख4,5में, कैंसर कोशिकाओं को चूहों में इंजेक्ट किया जाता है, प्राथमिक ट्यूमर बनाने की अनुमति दी जाती है, और फिर सहज मेटाटैसिस गठन और बाद में विकास को परख दिया जाता है। इस मॉडल की ताकत यह है कि कोशिकाओं को मेटास्टैटिक ट्यूमर बनाने के लिए मेटास्टैटिक प्रक्रिया के सभी चरणों को पूरा करना होगा। हालांकि, कई कैंसर सेल लाइनें सहज मेटास्टेसिस मॉडल में कुशलता से मेटास्टेसाइज नहीं करती हैं, और प्राथमिक ट्यूमर विकास को प्रभावित करने वाली कोशिकाओं में से कोई हेरफेर मेटास्टेसिस परख के परिणामों को चकित कर सकता है। प्रायोगिक मेटाटैसिस परख, जिसमें कैंसर कोशिकाओं को सीधे प्रचलन में इंजेक्ट किया जाता है, इन नुकसान से बचने के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य प्रायोगिक मेटास्टेसिस परखों में पूंछ नस इंजेक्शन6,7,8 (और यहां प्रदर्शित), इंट्राकार्डियक इंजेक्शन9और पोर्टल नस इंजेक्शन10शामिल हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक वीवो प्रायोगिक मेटास्टेसिस परख में प्रदान करना है जो एक शोधकर्ता को वास्तविक समय में मेटास्टेसिस गठन और विकास की निगरानी करने की अनुमति देता है, साथ ही साथ एक ही माउस के फेफड़ों में अंत बिंदु मेटास्टेसिस संख्या और आकार की मात्रा निर्धारित करता है। इसे पूरा करने के लिए, पारंपरिक प्रायोगिक पूंछ नस मेटास्टेसिस परख6,7,8 को लाइव एनिमल इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, जो वीवो इमेजिंग डिवाइस9,11,12,13,14में उपयोग करते हैं। ट्यूमर कोशिकाओं को स्थिर रूप से लूसिफ़ेरेज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों को व्यक्त करने के लिए पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्ट किया जाता है और फिर वीवो इमेजिंग डिवाइस में समय के साथ फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है(चित्रा 1)। हालांकि, वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में व्यक्तिगत मेटास्टेस के आकार को अलग या माप नहीं सकते हैं। इस प्रकार, प्रयोग के अंत में, एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग अनुभागऔर हिस्टोलॉजी या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री(चित्रा 1)की आवश्यकता के बिना फेफड़ों में फ्लोरोसेंट मेटास्टेसिस की संख्या को गिनने और मापने के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कि उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति या कार्य में फेरबदल मेटाटैसिस गठन और विकास को कैसे प्रभावित करता है। संभावित चिकित्सीय यौगिकों जैसे छोटे अणुया एंटीबॉडी को अवरुद्ध करने वाले कार्य का भी परीक्षण किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, हमने पहली बार अवधारणा प्रयोग का एक प्रमाण किया जिसमें आवश्यक प्रतिकृति कारक, प्रतिकृति प्रोटीन A3 (RPA3) मेटास्टैटिक माउस स्तन कैंसर कोशिकाओं में नीचे गिरा दिया जाता है। हम बताते हैं कि आरपीए3 नॉकडाउन कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों नियंत्रण कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों की तुलना में हर समय बिंदु पर काफी कम मेटास्टैटिक बोझ है । मेटास्टैसिस युक्त फेफड़ों के विश्लेषण से पता चलता है कि यह कम मेटास्टैटिक बोझ काफी कम मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और मेटास्टैस के बिगड़ा विकास का परिणाम है जो बनते हैं। इस तकनीक को और प्रदर्शित करने के लिए, हमने परीक्षण किया कि क्या एक साथ हां से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) और ट्रांसक्रिप्शनियल सह-सक्रियक के साथ पीडीजेड-बाध्यकारी आकृति (TAZ) मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण या बाद के विकास को ख़राब करता है। YAP और TAZ दो संबंधित प्रतिलेखन सह-सक्रियकर्ता हैं जो हिप्पो पाथवे के महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम प्रभावक हैं। हम15,16 और दूसरों मेटाटैसिस में YAP और TAZ फंसाया है(17,18,19में समीक्षा की), सुझाव है कि इन प्रोटीन अच्छे चिकित्सकीय लक्ष्य हैं । लगातार, हमने पाया कि YAP के साथ इंजेक्शन चूहों/TAZ नॉकडाउन कोशिकाओं काफी मेटास्टैटिक बोझ कम हो गया था । फेफड़ों के विश्लेषण से पता चला है कि YAP/TAZ नॉकडाउन कोशिकाओं ने कई कम मेटाटैस का गठन किया और यह कि मेटाटैस जो फार्म का था, वे छोटे थे । इन प्रयोगों से पता चलता है कि कैसे प्रयोगात्मक मेटाटैसिस परख एक शोधकर्ता जल्दी और सस्ते में मेटाटैसिस गठन और विकास में एक उंमीदवार जीन की भूमिका का परीक्षण करने की अनुमति देते हैं । वे आगे बताते हैं कि कैसे पूरे फेफड़ों में मेटाटैस के लाइव एनिमल इमेजिंग और फ्लोरोसेंट क्वांटिफिकेशन का संयुक्त उपयोग शोधकर्ता को मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण के दौरान चरणों को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में चूहों और जैव खतरनाक सामग्रियों का उपयोग शामिल है और उचित संस्थागत सुरक्षा समितियों से अनुमोदन की आवश्यकता होती है। यहां वीवो वर्क में वर्णित सभी को अल्बानी मेडिकल कॉलेज इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा मंजूरी दी गई है ।

नोट: एक प्रोटोकॉल अवलोकन के लिए, चित्रा 1में योजनाबद्ध देखें ।

1. पैकेजिंग सभी आवश्यक रेट्रोवायरस और लेंटिवायरस

नोट: वर्णित प्रोटोकॉल एक लूसिफ़ेरेज एंजाइम और फ्लोरोसेंट प्रोटीन को कम करने के साथ-साथ उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए लेंटिवायरल या रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करता है। इन वायरसों को एचईसी-293FT कोशिकाओं में पैक किया जाता है जैसा कि नीचे वर्णित है।

  1. दिन 1: प्लेट HEK-293FT कोशिकाओं पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों पूर्ण विकास मीडिया के 2 mL में (1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 mM एल-ग्लूटामाइन के साथ DMEM में 10% FBS) ताकि वे 2 दिन 40-60% अनुकूल हैं । 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 रातोंरात।
  2. 2 दिन: प्रत्येक वायरल वेक्टर को पैक करने के लिए, रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल वेक्टर के साथ एचईसी-293FT कोशिकाओं की 40-60% सूक्ष्म अच्छी तरह से ट्रांसफेट करें और वायरल कोट और पैकेजिंग प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले उपयुक्त वैक्टर।
    नोट: यह प्रोटोकॉल कोट प्रोटीन के रूप में वीएसवीजी का उपयोग करता है, लेंटिवायरल पैकेजिंग के लिए psPAX2, और रेट्रोवायरल पैकेजिंग के लिए गैग-पोल (वेक्टर सूची के लिए पूरक तालिका 1 देखें)।
  3. प्रत्येक के लिए एक सह-ट्रांसफेक्शन मिश्रण बनाएं:
    1. ट्रांसफेक्शन के लिए लिपिड समाधान के 4 माइक्रोन (सामग्री की तालिकादेखें) और ट्रांसफेक्शन बफर के 96 माइक्रोन और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट मिलाएं।
    2. वायरल वेक्टर के 1 μg जोड़ें, कोट प्रोटीन वेक्टर (VSVG) के ०.५ μg, और पैकेजिंग प्रोटीन वेक्टर (psPAX2 या चुप-पीओएल) के ०.५ μg और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    3. धीरे-धीरे चरण 1.3.2 से सह-ट्रांसफेक्शन मिश्रण को एचईसी-293FT कोशिकाओं में जोड़ें जो चरण 1.1 में चढ़ाया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात इनक्यूबेट करता है।
  4. 3 दिन: प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसफेक्शन युक्त मीडिया को हटा दें और धीरे-धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण विकास मीडिया के 2 मिलील जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 लगभग 24 घंटे के लिए।
  5. 4 दिन: एक 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक 3 मिलीस सिरिंज और फिल्टर का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से से वायरल supernatant ले लीजिए।
  6. वैकल्पिक: यदि वायरस के दूसरे बैच का संग्रह वांछित है, तो धीरे-धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण विकास मीडिया का 2 एलएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लगभग 24 घंटों के लिए 5% सीओ2।
  7. 5 दिन (वैकल्पिक): चरण 1.5 में वायरल सुपरनेटेंट का दूसरा दौर लीजिए।
    नोट: वायरल अतिशयोक्ति ठंड से प्रोटोकॉल रुका हो सकता है।

2. कैंसर कोशिकाओं की पीढ़ी स्थिर लूसिफ़ेरेज़ और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पहले जुगनू लूसिफ़ेरेज और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ZsGreen) अद्वितीय चयन जीन के साथ दो वेक्टर का उपयोग कर के साथ 4T1 कोशिकाओं लेबल करने के लिए । फिर एक3 वायरल वेक्टर एक उंमीदवार जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, वायरल वैक्टर जो एक साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन और आनुवंशिक हेरफेर प्रदान करते हैं, उन्हें भी एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (नीचे प्रतिनिधि प्रयोगों के रूप में)। अन्य कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन सेल संख्या को चरण 2.1 और 2.7.1 के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. प्लेट 4T1 कोशिकाओं पर 1.5 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से प्लेट में पूर्ण विकास मीडिया में (1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ DMEM में 10% FBS) और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात इनक्यूबेट ।
  2. इस प्रकार चरण 1 में उत्पन्न वायरल सुपरनेटेंट के साथ 4T1 कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    1. कोशिकाओं से विकास मीडिया Aspirate और ल्यूसिफ़ेरे वायरल supernatant और फ्लोरोसेंट प्रोटीन वायरल सुपरनेटेंट के ५०० μL जोड़ने के लिए एक साथ दोनों लूसिफ़ेरेज़ और फ्लोरोसेंट प्रोटीन वायरल supernatants के साथ कोशिकाओं को संक्रमित ।
    2. 8 मिलीग्राम/mL हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड (सामग्री की तालिकादेखें) के 1 μL जोड़ें ।
    3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% तक 75-90% शंखनाद (आमतौर पर 24-48 घंटे) तक इनक्यूबेट करें।
  3. 2-5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 500 माइक्रोन के साथ 4T1 कोशिकाओं को ट्राइप्सिन करें (कोशिकाओं को अच्छी तरह से अच्छी तरह से नीचे से कुल्ला करना चाहिए)। चयन मीडिया के 4 mL में एक 6 सेमी पकवान के लिए सभी कोशिकाओं को स्थानांतरित करें (उचित एंटीबायोटिक दवाओं वाले पूर्ण विकास मीडिया) जिससे ट्राइप्सिन को बुझाएं। एक ही चयन मीडिया में गैर संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं की एक 6 सेमी पकवान प्लेट।
    नोट: उचित एंटीबायोटिक एकाग्रता कई खुराक का परीक्षण करके समय से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग दवा चयन के स्थान पर फ्लोरोसेंटलेबल लेबल वाली कोशिकाओं का चयन करने के लिए भी किया जा सकता है।
  4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, चयन मीडिया में 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें और आवश्यक होने पर कोशिकाओं को विभाजित करें जब तक कि सभी गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाएं मर न जाएं (चयन जीन और सेल लाइन पर निर्भर)।
  5. पुष्टि करें कि संक्रमित 4T1 कोशिकाएं 50-100x आवर्धन पर एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर सेट हरे रंग के उत्तेजना (450-490 एनएम)/उत्सर्जन (500-550 एनएम) फिल्टर का उपयोग करके ZsGreen फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कर रही हैं ।
  6. पुष्टि करें कि संक्रमित 4T1 कोशिकाएं इस प्रकार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लूसिफ़ेरेस गतिविधि किट का उपयोग करके लूसिफ़ेरेज व्यक्त कर रही हैं।
    1. लूसिफ़ेरेज़-व्यक्त करने वाली 4T1 कोशिकाओं को नियंत्रित करने और 4T1 कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए 1x निष्क्रिय लिसिस बफर की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें जो लूसिफ़ेरेज़ को व्यक्त नहीं करते हैं, धीरे-धीरे 30 मिनट के लिए मिलाते हैं।
    2. एक सफेद नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट में सेल लाइसेट के 20 μL जोड़ें और फिर लूसिफ़ेरेज गतिविधि किट से ल्यूसिफ़ेरे परख के 50 माइक्रोन रिएजेंट।
    3. ल्यूमिनेसेंस सेटिंग का उपयोग करके स्पेक्ट्रम में सभी तरंगदैर्ध्य पर कोशिकाओं से ल्यूमिनेसेंस को मापने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करें।
      नोट: प्रोटोकॉल को स्थिर-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को ठंडा करके रोका जा सकता है।
  7. इस प्रकार उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करें:
    1. प्लेट 6 x 105 पूर्ण विकास मीडिया के 4 मिलील में 60 मिमी पकवान पर चरण 2.6 से 4T1 कोशिकाओं को लेबल किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात इनक्यूबेट किया गया।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से विकास मीडिया Aspirate और पूर्ण विकास मीडिया के 2 mL 8 मिलीग्राम/mL हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड के 4 μL युक्त जोड़ें ।
    3. चरण 1 से चरण 2.7.2 से प्लेटकी गई कोशिकाओं में वायरल सुपरनेट ेंट का 2 मिलील जोड़ें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    4. 2-5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 500 माइक्रोन के साथ 4T1 कोशिकाओं को ट्राइप्सिन करें (कोशिकाओं को अच्छी तरह से अच्छी तरह से नीचे से कुल्ला करना चाहिए)। चयन मीडिया के 10 mL में एक 10 सेमी पकवान के लिए कोशिकाओं के सभी हस्तांतरण (पूर्ण विकास उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया) जिससे ट्रिप्सिन शमन । प्लेट कुछ गैर संक्रमित नियंत्रण एक ही चयन मीडिया में 4T1 कोशिकाओं लेबल।
    5. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, चयन मीडिया में 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें और सभी गैर-संक्रमित कोशिकाओं के मृत होने तक आवश्यक होने पर कोशिकाओं को विभाजित करें।
    6. इस बात की पुष्टि करें कि उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति को पश्चिमी दाग20 या क्यूपीसीआर21जैसे मानक दृष्टिकोण का उपयोग करके बदल दिया जाता है ।
    7. परख ल्यूमिनेसेंस और फ्लोरेसेंस के रूप में चरण 2.5-2.6 में यह निर्धारित करने के लिए कि वे नियंत्रण और नॉकडाउन कोशिकाओं में कितने समान हैं, क्योंकि यह बदल सकता है (चर्चा देखें)।
      नोट: प्रोटोकॉल को स्थिर-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को ठंडा करके रोका जा सकता है।

3. वीवो प्रायोगिक डिजाइन में अनुकूलन

  1. इस प्रकार वांछित मेटास्टैटिक बोझ के लिए उपयुक्त सेल संख्या और प्रयोग की अवधि का अनुकूलन करें।
    1. पूर्ण विकास मीडिया में चरण 2.6 से फ्लोरोसेंट और बायोल्यूमिनेसेंट 4T1 कोशिकाओं का विस्तार करें ताकि इंजेक्शन के वांछित दिन पर अतिरिक्त कोशिकाएं उपलब्ध हों।
    2. चरण 4.2 में वर्णित पूंछ नस इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। इंजेक्शन के लिए इष्टतम सेल संख्या निर्धारित करने के लिए, 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन में कई अलग-अलग सांद्रता पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: हम 25,000 से 500,000 तक सेल नंबर/माउस की एक श्रृंखला का परीक्षण करने की सलाह देते हैं।
    3. इंजेक्शन तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
    4. चरण 4.3 में वर्णित पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चरण 3.1.2 से चरण 3.1.2 से 4T1 कोशिकाओं के प्रत्येक कमजोर पड़ने का इंजेक्शन लें (नीचे देखें)।
    5. माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए निगरानी करें। चूहों को दर्द या संकट 3x साप्ताहिक के लक्षणों के लिए जांच की जानी चाहिए।
    6. मेटास्टेसिस गठन और 3-6 सप्ताह के लिए विकास के लिए चूहों की निगरानी (सेल लाइन और माउस तनाव निर्भर) एक में वीवो लाइव पशु इमेजिंग डिवाइस का उपयोग कर (चरण 5 और 6 देखें) ।
      1. मानक संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पूंछ नस इंजेक्शन के 3-6 सप्ताह बाद चूहों को इच्छामृत्यु दें।
      2. फेफड़ों को तैयार करें और 7 चरण में वर्णित मेटास्टेसिस आकार और संख्या का आकलन करें।
      3. वांछित मेटास्टैटिक बोझ (चर्चा देखें) के लिए विकसित करने के लिए मेटास्टैस के लिए उचित समय चुनें।

4. लेबल कैंसर कोशिकाओं की पूंछ नस इंजेक्शन

नोट: चरण 4.2.4 सिंजेनिक BALB/c चूहों में बढ़ रही 4T1 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि अन्य कैंसर सेल लाइनों और माउस उपभेदों का उपयोग किया जाता है, तो इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या, और परख की लंबाई पहले अनुकूलित की जानी चाहिए।

  1. पूर्ण विकास मीडिया में दो 15 सेमी व्यंजनों पर चरण 2 में उत्पन्न 4T1 सेल लाइनों का विस्तार करें ताकि इंजेक्शन के दिन अतिरिक्त कोशिकाएं उपलब्ध हों।
  2. पूंछ नस इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को इस प्रकार तैयार करें:
    1. मीडिया को एस्पिरेट करें और 1x पीबीएस के साथ सेल प्लेटों को कुल्ला एंकलेट करें।
    2. 2-5 मिनट के लिए प्रति 15 सेमी प्लेट में ट्राइप्सिन के 5 mL के साथ कोशिकाओं को ट्रिप्सिन करें (कोशिकाओं को अच्छी तरह से अच्छी तरह से नीचे कुल्ला करना चाहिए)। सभी कोशिकाओं को शंकुपूर्ण ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ऊतक संस्कृति पकवान से शेष कोशिकाओं को पर्याप्त पूर्ण विकास मीडिया के साथ धोने के लिए ट्राइप्सिन बुझाने और एक ही शंकु ट्यूब के लिए धोने जोड़ें ।
    3. कुल सेल नंबर निर्धारित करने के लिए स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    4. 3 मिनट के लिए 122 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें, और वांछित एकाग्रता पर 1x पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यहां, पीबीएस के 100 माइक्रोन में प्रत्येक माउस में 2.5 x 104 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए 2.5 x 105 कोशिकाओं/mL पर पुनर्निलंबित कोशिकाएं। इंजेक्शन तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
      नोट: कोशिकाओं के ट्रिपसिनाइजेशन और पूंछ नस इंजेक्शन के बीच समय की मात्रा को लगभग 1 घंटे तक सीमित करना महत्वपूर्ण है।
  3. इस प्रकार पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चूहों में चरण 4.2.5 से 4T1 कोशिकाओं को इंजेक्ट करें:
    1. पशु सुविधा पर एक हुड में काम करना, धीरे-धीरे लेकिन ट्यूब को उलटकर या 1 मिलीस सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उन्हें समान रूप से निलंबित कर दिया जाए। हमेशा सुनिश्चित करें कि सिरिंज लोड करने से पहले कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया जाता है।
    2. सेल निलंबन के साथ एक 1 मिलीलीटर लूर-लॉक सिरिंज लोड करें और अतिरिक्त हवा के बुलबुले को निष्कासित करें। बेवेल अप के साथ सिरिंज पर आधा इंच, 30 गेज की सुई रखें और हवा के बुलबुले को निष्कासित करें।
    3. माउस को धीरे-धीरे एक कृंतक निरोधक में रखें।
    4. पार्श्व पूंछ की नसें दिखाई और फैली हुई होनी चाहिए। यदि नहीं, तो धीरे-धीरे पूंछ के आधार को पिंच करें और नसों को फैलाने के लिए पूंछ को गर्म नल के पानी में डुबोएं।
      नोट: नसों का फैलाव भी एक हीटिंग लैंप के नीचे माउस पिंजरे रखकर प्राप्त किया जा सकता है और/
    5. पूंछ को साफ करने के लिए अल्कोहल वाइप का इस्तेमाल करें। सुई को पूंछ की नस में डालें, बेवेल साइड अप, और सेल निलंबन के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करते हैं।
      नोट: यदि सुई को ठीक से नस में डाला जाता है, तो इसे आसानी से थोड़ा आगे और पीछे स्लाइड करना चाहिए, और जब प्लंजर को धक्का दिया जाता है तो प्रतिरोध नहीं होना चाहिए। सफल इंजेक्शन भी एक "फ्लश" जिसमें नस का नीला रंग इंजेक्शन के बाद कुछ सेकंड के लिए सफेद हो जाता है में परिणाम चाहिए।
  4. धीरे-धीरे सुई को हटा दें और बाँझ धुंध का उपयोग करके, किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करें।
  5. माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए निगरानी करें। चूहों को दर्द या संकट 3x साप्ताहिक के लक्षणों के लिए जांच की जानी चाहिए।
  6. मेटास्टेसिस गठन और 3-6 सप्ताह के लिए विकास के लिए चूहों की निगरानी (सेल लाइन और माउस तनाव निर्भर) एक में वीवो लाइव पशु इमेजिंग डिवाइस का उपयोग कर (चरण 5 और 6 देखें) ।

5. वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में फ्लोरेसेंस द्वारा मेटास्टैटिक बोझ की निगरानी करना

नोट: सक्रिय ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के साथ फ्लोरेसेंस के लिए जानवर की छवि न करें।

  1. यदि केवल इमेजिंग बायोल्यूमिनेसेंस, 6 कदम के लिए छोड़ दें ।
  2. वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में चालू करें।
  3. 1.5% और 2% आइसोफ्लोरीन के बीच एनेस्थीसिया चैंबर और इमेजिंग चैंबर को वितरित करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग एनेस्थीसिया सिस्टम में स्थापित करें।
  4. फ्लोरोसेंटी लेबल वाले मेटास्टेसिस को एक एनेस्थीसिया कक्ष में रखकर और 1.5-2.5% आइसोफ्लोरीन वितरित करके चूहों को चरण 4 से लेबल किया जाता है।
  5. छवि सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और लॉगिन करें।
  6. आरंभ बटन पर क्लिक करें और मशीन के शुरू होने का इंतजार करें।
  7. डीमें देखने के क्षेत्र को बदलें ।
    नोट: यदि माउस के करीब से देखने की आवश्यकता है, तो व्यू सी के क्षेत्र का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह चूहों की संख्या को सीमित करता है जिन्हें एक साथ चित्रित किया जा सकता है।
  8. एक बार सॉफ्टवेयर ने संकेत दिया है कि कैमरा उचित तापमान तक पहुंच गया है, इमेजिंग जादूगर बटन पर क्लिक करें, फ्लोरेसेंस चुनें और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से उपयुक्त फ़िल्टर जोड़ी चुनें।
    नोट: यदि फ्लोरोफोर का उपयोग किया जा रहा है एक विकल्प नहीं है, इनपुट EX/Eएम चुनें और आवश्यक उत्तेजना और उत्सर्जन टाइप करें ।
  9. माउस को चरण 3.2.4 में वर्णित कक्ष में रखें।
  10. क्लिक करें अधिग्रहण अनुक्रम
  11. इमेजिंग के बाद, माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए निगरानी करें।
  12. चरण 5.2 दोहराएं और कम से कम एक माउस के साथ 5.7-5.9 चरणों में मेटास्टेज़ शामिल नहीं हैं। नोट: इस माउस का उपयोग विश्लेषण (चरण 8) के दौरान पृष्ठभूमि संकेत को निर्धारित करने और घटाने के लिए किया जाएगा।
  13. छवि प्रयोग की अवधि के लिए साप्ताहिक 2-3 बार।

6. वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में बायोल्यूमिनेसेंस द्वारा मेटास्टैटिक बोझ की निगरानी करना

  1. वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में चालू करें और कार्यक्रम को इस प्रकार सेटअप करें।
    1. छवि सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और लॉगिन करें। आरंभ बटन पर क्लिक करें और मशीन के शुरू होने का इंतजार करें। डीमें देखने के क्षेत्र को बदलें ।
      नोट: व्यू सी के क्षेत्र का उपयोग पूर्ण माउस शरीर की छवि के करीब देखने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, यह चूहों की संख्या को सीमित करता है जिसे एक बार में चित्रित किया जा सकता है।
    2. पहली बार उपयोग के लिए, एक्सपोजर सेटिंग्स को इस प्रकार संपादित करें: संपादित करें । प्राथमिकताएं । अधिग्रहण । ऑटो एक्सपोजर और डिफ़ॉल्ट 60 सेकंड से 300 सेकंड के लिए अधिकतम एक्सपोजर समय बदलजाते हैं और केपर क्लिक करें।
      नोट: ऑटो एक्सपोजर टैब में किसी अन्य पैरामीटर को न बदलें।
  2. एनेस्थीसिया चैंबर और इमेजिंग चैंबर को 1.5% और 2% आइसोफ्लोरीन के बीच वितरित करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार संज्ञाहरण प्रणाली को सेट-अप करें।
  3. सुनिश्चित करें कि कैमरा 6.4 कदम आगे बढ़ने से पहले उचित तापमान तक पहुंच गया है।
  4. एनेस्थेटिस युक्त चूहों को एक एनेस्थीसिया कक्ष में रखकर और 1.5-2.5% आइसोफ्लोरीन वितरित करके चरण 4 से युक्त चूहों को वितरित करें।
  5. इस प्रकार बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के लिए चूहों को तैयार करें।
    1. डी-लूसिफ़ेरिन (डी-पीबीएस में 30 मिलीग्राम/mL) के साथ 1 मिलीग्राम सिरिंज लोड करें और फिर सिरिंज में आधा इंच 30 गेज सुई डालें और हवा के बुलबुले निष्कासित करें ।
    2. एनेस्थेटाइज्ड माउस के द्रव्यमान को मापें और रिकॉर्ड करें।
    3. अंगूठे और सूचक उंगलियों का उपयोग करके उनकी गर्दन के स्क्रफ को पिन करके माउस को नियंत्रित करें और पिंकी उंगली और हाथ के आधार के बीच पूंछ को लोभी करें। माउस को 45-डिग्री कोण पर उलटा करें, जिसमें इसका सिर नीचे की ओर इशारा करता है।
    4. माउस के बाईं ओर इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) अंतरिक्ष में सुई, बेवेल साइड अप डालें। एक छोटी मात्रा वापस ड्राइंग द्वारा आईपी अंतरिक्ष में प्रवेश की पुष्टि करें। आईपी स्पेस में वापस ड्राइंग करते समय सुई के आधार पर रंग नहीं होना चाहिए।
    5. 150 मिलीग्राम/किलो ग्राम की खुराक के लिए डी-लूसिफ़ेरिन की उचित मात्रा इंजेक्ट करें।
    6. डी-लूसिफ़ेरिन प्रशासन के तुरंत बाद, एक टाइमर शुरू करें और माउस फ्लैट को इमेजिंग डिवाइस में नाक शंकु में अपनी नाक के साथ रखें और यह सुनिश्चित करें कि 1.5-2.5% आइसोफ्लोरीन प्रशासित किया जा रहा है। कई चूहों इमेजिंग अगर प्रत्येक माउस के बीच डिवाइडर रखें। सुनिश्चित करें कि चूहों को संभव के रूप में फ्लैट के रूप में तैनात किया जाता है (यानी एक तरफ झुकाव नहीं)।
    7. ल्यूमिनेसेंट और फोटोग्राफ बॉक्स पर क्लिक करें और फिर अधिग्रहण नियंत्रण कक्षमें अधिग्रहण पर क्लिक करें ।
  6. पीक सिग्नल प्राप्त होने तक लगातार बायोल्यूमिनेसेंट छवियां प्राप्त करें और विश्लेषण के लिए पीक बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के साथ छवि का उपयोग करें।
  7. इमेजिंग के बाद, माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए निगरानी करें।
  8. छवि प्रयोग की अवधि के लिए साप्ताहिक 2-3 बार।

7. मेटास्टेज़ की संख्या और आकार का परिमाणीकरण

नोट: मेटाटैस को बढ़ने की अनुमति मिलने के समय की लंबाई प्रत्येक सेल लाइन और माउस तनाव के लिए निर्धारित की जानी चाहिए, और इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या से प्रभावित होगी।

  1. मानक संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  2. अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए प्रत्येक माउस से फेफड़ों को अलग करें और निकालें और 1x पीबीएस में कुल्ला करें।
  3. धीरे-धीरे फेफड़ों को पालि में अलग करें।
  4. एक GFP वाइडबैंड फिल्टर (उत्तेजना 470/40x) के साथ एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप का उपयोग कर उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरेसेंस में 10x पर पालियों में ZsGreen मेटास्टेस की छवियों को प्राप्त करें ।
    नोट: सभी नमूनों के लिए एक ही आवर्धन और चमक बनाए रखें। उपयोग किया जाने वाला आवर्धन मेटास्टेज़ के आकार, संख्या और चमक के साथ-साथ उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप के लिए देखने के क्षेत्र के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  5. छवियों से मेटास्टेसिस के आकार और संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: छवि विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल सॉफ्टवेयर निर्भर है और step3 से ट्यूमर के साथ अनुकूलित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके मैन्युअल रूप से प्रत्येक फेफड़े में मेटास्टेज़ की संख्या गिनें। प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और सभी वीवो छवियों में एकत्र किए जाने के बाद चरण 8 किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है।

8. वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस के साथ प्राप्त छवियों से डेटा का प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. छवि सॉफ्टवेयर में प्रत्येक माउस के लिए सभी छवि फ़ाइलें खोलें।
    नोट: विश्लेषण के लिए पीक बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के साथ छवि का उपयोग करें
  2. सुनिश्चित करें कि इकाइयां छवि खिड़की के शीर्ष बाईं ओर तीर पर क्लिक करके और इसे उचित इकाई में बदलकर फ्लोरोसेंट डेटा के लिए बायोल्यूमिनेसेंट डेटा और दक्षता के लिए चमक में हैं।
  3. इस प्रकार ब्याज क्षेत्र (आरओआई) बनाने के लिए अंतिम समय बिंदु से छवि का उपयोग करें।
    1. टूल पैलेट विंडो में आरओआई टूल्स पर क्लिक करें। तीर पर क्लिक करके और 1का चयन करके एक आरओआई डालें ।
    2. आरओआई की सीमा पर क्लिक करें और इसे माउस के सीने के ऊपर ले जाएं। आरओआई के आकार को समायोजित करें ताकि यह माउस की छाती को कवर करे और सिग्नल को बाहर न करे।
  4. क्लिक करें ROIs उपाय और प्रतिलिपि या एक एक्सेल शीट में कच्चे नंबर टाइप करें ।
    नोट: बायोल्यूमिनेसेंट डेटा के लिए कुल प्रवाह (फोटॉन/सेकंड) का चयन करें, जो आरओआई में सभी चमक का योग है । चूंकि मेटास्टैस अनिवार्य रूप से समान रूप से विकसित नहीं होते हैं, इसलिए कुल प्रवाह को औसत चमक से अधिक पसंद किया जाता है क्योंकि यह मेटास्टैटिक बोझ के योग को मापता है। इसी प्रकार फ्लोरोसेंट आंकड़ों के लिए औसत दक्षता के बजाय कुल दक्षता % (उत्सर्जन प्रकाश (फोटॉन/सेकंड)/उत्तेजना प्रकाश (फोटॉन/सेकंड)) का उपयोग किया जाना चाहिए ।
  5. स्टेप 8.3 में इस्तेमाल होने वाले आरओआई को कॉपी करने के लिए इमेज फाइल में राइट क्लिक करें और इसे हर इमेज फाइल में चिपका दें।
    नोट: फ्लोरोसेंट छवियों की मात्रा निर्धारित करते समय, एक माउस पर उसी क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करें जिसे कोई मेटाटैसिस के साथ इमेज किया गया था। पृष्ठभूमि संकेत के रूप में इस संकेत का उपयोग करें और इसे प्रत्येक फ्लोरोसेंट मेटाटैसिस युक्त माउस छवि से घटाना।
  6. प्रत्येक छवि के लिए चरण 8.3.4 में चयनित एक ही क्षेत्र में चिपकाया आरओआई ले जाएं और चरण 8.4 दोहराएं।
  7. इस प्रकार कच्चे डेटा को प्लॉट और विश्लेषण करें (पूरक तालिका 2देखें)।
    1. प्रत्येक माउस के लिए कच्चे डेटा का लॉग10 परिवर्तन करें जो इंगित सूत्र(पूरक तालिका 2)का उपयोग करके और चित्रा 2डी और चित्रा 4एफके रूप में प्लॉट करें। लॉग10 परिवर्तन विकास वक्र को रैकाइज़ करता है जो ज्यामितीय हो जाता है और विषमता को कम करता है।
    2. रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके, चरण 8.7.1(पूरक तालिका 2)में प्लॉट किए गए प्रत्येक माउस के लिए लॉग10 परिवर्तित डेटा के लिए फिट लाइन की ढलान की गणना करें। लाइन को फिट करने और ढलान की गणना करने के लिए पूरक तालिका 2 में सूत्र को देखें।
    3. चित्रा 2 और चित्रा 4जीमें के रूप में ढलानों के संख्यात्मक मूल्यों की साजिश । सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए ढलानों पर छात्र के टी-टेस्ट या एक-तरफा ANOVA (2 से अधिक समूहों के लिए) का उपयोग करें।

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Representative Results

उपरोक्त दृष्टिकोण प्रदर्शित करने के लिए, हमने अवधारणा प्रयोग का एक प्रमाण किया जिसमें एक महत्वपूर्ण प्रतिकृति कारक, आरपीए 3 को मेटास्टैटिक माउस मैममैरी कार्सिनोमा सेल लाइन (4T122)में नीचे गिरा दिया गया था। जबकि प्रोटोकॉल आनुवंशिक हेरफेर से पहले लूसिफ़ेरेज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों के साथ कोशिकाओं को लेबल करने का वर्णन करता है, हमने एक संशोधित दृष्टिकोण का उपयोग किया क्योंकि आरएनएआई वैक्टर भी ZsGreen(चित्रा 2ए)वितरित करते हैं। सबसे पहले, 4T1 कोशिकाओं को एक लेंटिवायरल निर्माण एन्कोडिंग जुगनू लूसिफ़ेरेज़ और हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध (पीएचएज-लूसिफ़ेरेस-आईआरईआरएस-हाइग्रो) के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था। हाइग्रोमाइसिन चयन के बाद, जुगनू लूसिफ़ेरेज(चित्रा 2ए)की स्थिर अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए एक लूसिफ़ेरेज़ परख का प्रदर्शन किया गया था। इसके बाद, 4T1-लूसिफ़ेरेज कोशिकाओं को रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था जो जेडग्रीन को व्यक्त करते हैं और या तो एक नियंत्रण miR30-आधारित श्रना, या एक miR30-आधारित श्रना पहले माउस आरपीए316,23,24को प्रभावी ढंग से लक्षित करने के लिए दिखाया गया था। कोशिकाओं को तब पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्ट किया गया था और वीवो बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल में मेटास्टैटिक बोझ(चित्रा 2बी, सी)की निगरानी के लिए सप्ताह में दो बार मापा गया था। प्रत्येक माउस के लिए लॉग10 परिवर्तित सिग्नल को समय के साथ मेटास्टैटिक बोझ के रूप में प्लॉट किया गया था(चित्रा 2डी)और प्रत्येक भूखंड की ढलानों का निर्धारण किया गया था(चित्रा 2ई)। इन आंकड़ों से पता चलता है मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन की दर काफी नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में RPA3 नॉकडाउन के साथ कम है । हालांकि मतभेद हड़ताली हैं, इन डेटा अकेले हमें निर्धारित करने के लिए अगर कम मेटास्टैटिक बोझ कम मेटास्टैटिक बोझ कम मेटास्टैस का परिणाम है या मेटास्टैस की धीमी वृद्धि के कारण अनुमति नहीं है । इसलिए, प्रयोग के अंत में फेफड़ों में जेडग्रीन लेबल वाले मेटाटैरेस का भी विश्लेषण किया गया। आरपीए3 नॉकडाउन कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों फेफड़ों में लगभग कोई मेटाटैस था, जबकि नियंत्रण चूहों में कई बड़े मेटाटैस(चित्रा 3)थे। इसके अलावा, RPA3 नॉकडाउन कोशिकाओं से फार्म किया है कि मेटाटैस स्पष्ट रूप से नियंत्रण 4T1 मेटाटैस(चित्रा 3ए)से छोटे थे । हमारे मैनुअल मायने रखता है(चित्रा 3बी),छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर RPA3 नॉकडाउन चूहों(चित्रा 3सी)में काफी कम मेटाटैस गिना के अनुरूप । इसके अतिरिक्त, फेफड़ों में कुल मेटास्टैटिक बोझ (मिलीमीटर में प्रत्येक मेटास्टैसिस के क्षेत्रों का योग) भी RPA3 नॉकडाउन(चित्रा 3डी)द्वारा काफी कम हो गया था। अंत में, आरपीए3 नॉकडाउन चूहों में गठित व्यक्तिगत मेटास्टेस का आकार आम तौर पर नियंत्रण चूहों(चित्रा 3ई)में उन लोगों की तुलना में बहुत छोटा था। नियंत्रण चूहों में बड़े मेटाटैस के अलावा, हमने कई छोटे मेटाटैस का भी निरीक्षण किया, लेकिन यह निर्धारित नहीं कर सकते कि ये ट्यूमर कोशिकाएं हैं जो फेफड़ों को वरीयता देती हैं और विकसित नहीं होती हैं या यदि वे ट्यूमर कोशिकाएं बड़े मेटाबेटों में से एक से बहाती हैं जो एक नए स्थान(चित्रा 3ई)में फेफड़ों को फिर से वरीयता प्राप्त करती हैं। सामूहिक रूप से इन आंकड़ों से पता चलता है कि RPA3 4T1 कोशिकाओं द्वारा मेटाटैसिस गठन के लिए आवश्यक है । इन निष्कर्षों की उम्मीद की जा रही थी क्योंकि हमारे पिछले काम से पता चला था कि आरपीए 3 दस्तक कोशिकाओं ने पूंछ नस इंजेक्शन16के बाद फेफड़ों में मेटाटैस बनाने की क्षमता को काफी कम कर दिया था । हालांकि, यह प्रयोग दर्शाता है कि मेटास्टेसिस संख्या और आकार के उपयोग लाइव एनिमल इमेजिंग और फ्लोरोसेंट क्वांटिफिकेशन का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण या विकास में अंतर के कारण हैं या नहीं।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि इस दृष्टिकोण का उपयोग अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक प्रश्न का उत्तर देने के लिए कैसे किया जा सकता है, हमने पूछा कि क्या स्तन कैंसर के इस सिंजेनिक मॉडल में मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और बाद में वृद्धि के लिए वाईएपी और TAZ की आवश्यकता है। सामान्य ऊतकों की तुलना में कई कैंसरों में वाईएपी या टाज की अभिव्यक्ति और गतिविधि बढ़ जाती है और यह खराब रोगी परिणाम25,26,27,28,29की भविष्यवाणी है । इसके अतिरिक्त, कई अध्ययनों ने मेटास्टेसिस15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,में वाईएपी, ताज़ या टीईडी, महत्वपूर्ण वाईएपी/TAZ-बाध्यकारी भागीदारों को फंसायाहै, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. इस डेटा को देखते हुए हमने अपने दृष्टिकोण का उपयोग परीक्षण करने के लिए किया यदि मेटाटैसिस गठन और विकास के लिए वाईएपी और TAZ की आवश्यकता होती है। इसके लिए, हम वाईएपी और टीजेड दोनों को लक्षित करते हुए मिलकर एमआईआर 30 आधारित shRNAs व्यक्त करते हुए एक रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग करते हैं। जैसा कि दिखाया गया है, यह मिलकर shRNA प्रभावी ढंग से YAP और TAZ प्रोटीन अभिव्यक्ति और 4T1 कोशिकाओं में प्रतिलेखन गतिविधि(चित्र4ए, बी)को कम कर देता है । 4T1-लूसिफ़ेरेस कोशिकाओं को इस टैंडेम वाईएपी/TAZ श्रना वेक्टर या एक नियंत्रण miR30 आधारित श्रना(चित्रा 4सी)के एक ZsGreen-व्यक्त संस्करण के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था और फिर सिंजेनिक BALB/c चूहों में पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा परख दिया । जैसा कि चित्र4में दिखाया गया है, जिस दर पर मेटास्टैटिक बोझ में वृद्धि हुई वह वाईएपी/TAZ नॉकडाउन कोशिकाओं(चित्रा 4डी-एफ)के साथ इंजेक्शन चूहों की तुलना में नियंत्रण कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों में काफी तेजी से थी । नियंत्रण कोशिकाओं के साथ चूहों की तुलना में YAP/TAZ नॉकडाउन कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों में गठित कम मेटाटैस ्स चाहे मैन्युअल रूप से गिना जाता है(चित्र5ए, बी)या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(चित्र 5सी)का उपयोग कर । न केवल नियंत्रण चूहों में कई और मेटाटैस रूप में थे, बल्कि वे आम तौर पर बड़े थे(चित्र 5ई)। लगातार, फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ (मिमी में कुल मेटास्टैसिस क्षेत्र) भी YAP/TAZ नॉकडाउन(चित्रा 5डी)द्वारा काफी कम हो गया था । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब मेटाटैस बड़े होते हैं और एक साथ बंद होते हैं, तो सॉफ्टवेयर अलग मेटास्तासेस में अंतर करने में असमर्थ हो सकता है। यह नियंत्रण चूहों (माउस 3 और माउस 7) में कुछ मेटाटैस के लिए मामला था। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उत्पादन की जांच करना महत्वपूर्ण है कि यह एकल ट्यूमर के क्षेत्र को सही ढंग से माप रहा है। यही कारण है कि इंजेक्शन की जा रही कोशिकाओं की संख्या और प्रयोग की लंबाई को अनुकूलित करना भी महत्वपूर्ण है। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि YAP और TAZ दर है जिस पर मेटास्टैटिक स्तन कैंसर के एक सिंजेनिक मूत्र मॉडल में मेटास्टैटिक बोझ बढ़ जाती है बनाए रखने की आवश्यकता है और यह मेटास्टेसिस की अक्षमता के कारण फार्म और कुछ मेटास्टेसिस है कि फार्म किया के विकास में कमी आई है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । सभी आवश्यक वायरस पहले एचईसी-293FT कोशिकाओं में पैक किए जाते हैं। अध्ययन के लिए वांछित कोशिकाएं तब एक साथ लूसिफ़ेरेज़ और फ्लोरोसेंट वायरस से संक्रमित होती हैं जो प्रत्येक एक अद्वितीय स्तनधारी दवा चयन जीन व्यक्त करती हैं। संक्रमित कोशिकाओं को तब उपयुक्त मीडिया में विस्तारित किया जाता है जिसमें दोनों दवाएं होती हैं जो लूसिफ़ेरेज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों को व्यक्त करते हुए स्थिर रूप से ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के लिए चयन करती हैं। प्रोटोकॉल में वर्णित दोनों लेबलों की अभिव्यक्ति की पुष्टि की जाती है। लेबल कोशिकाओं तो एक तिहाई वायरस एक आनुवंशिक हेरफेर (miR30 shRNA) और एक तिहाई अद्वितीय दवा चयन जीन युक्त के साथ उत्प्रेरित कर रहे हैं । तीसरी दवा के साथ चयन के बाद, कोशिकाओं को पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्ट किया जाता है। मेटास्टैटिक बोझ चूहों में एक में वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग सिस्टम के साथ प्रयोग के दौरान निगरानी की जाती है। प्रयोग के अंत में, चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है, और पूरे फेफड़ों की छवियों को फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया जाता है, और फिर मेटास्टेज़ की संख्या और आकार को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लूसिफ़ेराज़-वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग में आधारित से पता चलता है कि RPA3 नॉकडाउन स्तन कैंसर मेटास्टैटिक बोझ को कम करता है। (A)योजनाबद्ध दिखाकैसे कोशिकाओं को वीवो अध्ययन में इस के लिए उत्पन्न किया गया । 4T1 कोशिकाओं को एक लेंटिवायरस एन्कोडिंग ल्यूसिफ़ेरेज और हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था। संक्रमित कोशिकाओं को एक सप्ताह के लिए हाइग्रोमाइसिन बी के ६०० μg/mL के साथ चुना गया था और फिर ल्यूसिफ़ेरेज़ गतिविधि माता पिता या 4T1-ल्यूसिफ़ेरेज़ कोशिकाओं में एक लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर किट और प्लेट रीडर का उपयोग कर मापा गया था (n = 1 दोहराने कुओं के साथ प्रयोग औसत) । 4T1-लूसिफ़ेरेज कोशिकाओं को तब रेट्रोवायरस से संक्रमित किया गया था जो जेडग्रीन और एमआईआर30 shRNAs को या तो एमचेरी (नियंत्रण) या mRPA3 को लक्षित करते हैं। 3 दिनों के लिए प्यूरोमाइसिन चयन (2.5 μg/mL) का उपयोग वायरस के स्थिर एकीकरण के लिए चयन करने के लिए किया गया था। (बी-ई)4T1-लूसिफ़ेरेज कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से ZsGreen और नियंत्रण (एसएच-एमचेरी) या mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs चूहों में इंजेक्ट किया गया था और संकेत ित दिनों पर बायोल्यूमिनेसेंस के लिए इमेज्ड के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है । (B&C) संकेत डे पोस्ट इंजेक्शन(डी)लॉग10 के प्लॉट पर प्रत्येक समूह के प्रतिनिधि माउस के लिए बायोल्यूमिनेसेंट छवियां प्रयोग के दौरान प्रत्येक माउस के लिए मापा गया लूसिफ़ेरेस सिग्नल बदल दिया। (ई)डी में प्रत्येक माउस की ढलानों के लिए मतलब (ठोस रेखा) के साथ तितर बितर साजिश (एन = 6 एसएच नियंत्रण के लिए और 8 एसएच-mRPA3-431 के लिए) । सांख्यिकीय महत्व एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था; * पी ♫ 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट मेटाटैस के परिमाणीकरण से पता चलता है कि RPA3 नॉकडाउन मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और स्तन कैंसर कोशिकाओं के बाद के विकास को रोकता है । (क)फ्लोरोसेंट (बाएं) और ब्राइटफील्ड (दाएं) इंजेक्शन के 21 दिनों बाद चित्रा 2 में इंजेक्शन प्रत्येक माउस से प्रतिनिधि पालि की छवियां । एस्तेरिस्क्स (*) ने ग्रीन ऑटोफ्लोरोसेंट ब्रोंची का संकेत दिया। (सी-ई) इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग 25 से 100 की तीव्रता सीमा और 0.01 मिमी2 से अनंत तक की आकार सीमा का उपयोग करके वस्तुओं की पहचान करने और मापने के लिए किया गया था। (B&C) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सी)द्वारा गिना(बी)जब प्रत्येक माउस के फेफड़ों में मेटाटैस की कुल संख्या के मतलब (ठोस बार) के साथ तितर बितर साजिश । (डी)फेफड़ों का कुल क्षेत्रफल (मिमी) जिसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मापा गया था, एक ठोस बार द्वारा इंगित मतलब के साथ मेटास्टैटिक बोझ के रूप में साजिश रची जाती है। (ई)प्रत्येक मेटास्टेसिस के आकार को हर माउस के लिए प्लॉट किया जाता है। नियंत्रित चूहों को लाल बिंदुओं द्वारा नीले डॉट्स और mRPA3 नॉकडाउन चूहों द्वारा इंगित किया जाता है। ध्यान दें, स्केल बार को 1 मिमी में अलग किया जाता है ताकि छोटे मेटास्टेस (एन = 6 एसएच-कंट्रोल, 8 एसएच-एमआरपीए3-431) के आकार और संख्या की कल्पना करना आसान हो सके। सांख्यिकीय महत्व एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था; पी = 0.06; ** पी ♫ 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: YAP/TAZ नॉकडाउन स्तन कैंसर मेटास्टैटिक बोझ कम कर देता है । (एएंड बी)4T1 कोशिकाओं को पश्चिमी दाग विश्लेषण(ए)द्वारा विश्लेषण किया गया था जो एमआईआर 30-आधारित नियंत्रण (mCherry) या टैंडेम/TAZ shRNAs (एसएच-mYAP1/mTAZ6) द्वारा विश्लेषण किया गया था एक YAP/TAZ-TEAD लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर का निर्माण और YAP के लिए परख/TAZ-TEAD प्रतिलेखन गतिविधि के रूप में पहले15,16 (बी)(नियंत्रण के लिए एन = 5 और YAP1/TAZ6 के लिए 4) वर्णित है । (ग)योजनाबद्ध दिखाकैसे कोशिकाओं में वीवो अध्ययन के लिए उत्पन्न किया गया । 4T1-लूसिफ़ेरेस कोशिकाएं रेट्रोवायरस से संक्रमित थीं जो जेडग्रीन को वितरित करती हैं और या तो एक miR30 श्रना ने एमचेरी (नियंत्रण) या मिलकर miR30 shRNAs को लक्षित किया जो mYAP और mTAZ दोनों को लक्षित करता है। संक्रमित कोशिकाओं का चयन 3 दिनों के लिए पुरोमाइसिन (2.5 μg/mL) में किया गया था। 4T1-लूसिफ़ेरेस कोशिकाओं को स्थिर रूप से ZsGreen और नियंत्रण (एसएच-mCherry) या YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) shRNAs व्यक्त तो चूहों में इंजेक्शन और इंजेक्शन दिनों पर द्वारा बायोल्यूमिनेसेंस के लिए छवि थे । (डी एंड ई) संकेत ित दिन पोस्ट इंजेक्शन पर प्रत्येक समूह के एक प्रतिनिधि माउस के लिए Bioluminescent छवियां। (एफ)प्रयोग के दौरान प्रत्येक माउस के लिए मापा लॉग10 बदल लूसिफ़ेरास संकेत की साजिश । (जी) एफ में प्रत्येक माउस की ढलानों के लिए मतलब (ठोस बार) के साथ तितर बितर साजिश (एन = 7 एसएच नियंत्रण के लिए और 8 एसएच-mRPA3-431 के लिए) । मतलब एक ठोस लाइन द्वारा संकेत दिया है। सांख्यिकीय महत्व एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था; पी = 0.06; #, पी ♫ 0.01; ***. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फेफड़ों को उपनिवेश बनाने के लिए मेटास्टैटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं के लिए वाईएपी और TAZ की आवश्यकता होती है। (क)फ्लोरोसेंट (बाएं) और ब्राइटफील्ड (दाएं) इंजेक्शन के बाद चित्र 4 21 दिनों में इंजेक्शन प्रत्येक माउस से प्रतिनिधि पालि की छवियां। (सी-ई) चित्र ों को चित्र विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित किया गया था जैसा कि चित्र 3में वर्णित है। (B&C) मैन्युअल रूप से गिना जाता है जब प्रत्येक माउस के फेफड़ों में मेटास्ताज़ की कुल संख्या (ठोस बार) के साथ मतलब (ठोस बार) के साथ तितर बितर साजिश(बी)या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सी)द्वारा । (डी)सभी मेटास्टैस (मिमी) के कुल क्षेत्र को छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मापा गया था और मतलब (ठोस बार) के साथ मेटास्टैटिक बोझ के रूप में साजिश रची गई थी। (ई)प्रत्येक मेटास्टेसिस के आकार को हर माउस के लिए प्लॉट किया जाता है। नियंत्रण चूहों नीले डॉट्स और एसएच-mYAP1/mTAZ6 नॉकडाउन चूहों द्वारा लाल डॉट्स द्वारा संकेत दिया जाता है । ध्यान दें, स्केल बार को छोटे मेटास्टेस (एन = 7 एसएच-कंट्रोल, 8 एसएच-mYA1/mTAZ6) के आकार और संख्या की बेहतर कल्पना करने के लिए 1 मिमी पर अलग किया जाता है। मतलब एक ठोस लाइन द्वारा संकेत दिया है। सांख्यिकीय महत्व एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था; * पी ♫ 0.05, **, पी ♫ 0.01; **. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 1: वेक्टर की तालिका। उपयोग किए जाने वाले सभी वेक्टर सूचीबद्ध हैं और नए वेक्टर वर्णित हैं। मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग नए वैक्टर का क्लोन बनाने के लिए किया गया था और नए वर्णित 97-मेर श्रना के लिए दृश्यों को शामिल किया गया है। प्रशस्ति पत्र का उल्लेख है: [1]53,[2]16,[3]54कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण का उदाहरण। स्प्रेडशीट का प्रदर्शन कैसे वीवो लाइव पशु छवियों में से कच्चे डेटा विश्लेषण के लिए परिवर्तित किया जाता है के रूप में कदम ६.७ और ६.८ में वर्णित है । वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग से प्राप्त रॉ डेटा लॉग10 ट्रांसफॉर्मेशन का उपयोग करके बदल गया। मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन की दर लॉग10 परिवर्तित डेटा द्वारा उत्पन्न ढलान की गणना करके प्रत्येक माउस के लिए गणना की जाती है। उदाहरणों में चित्रा 2से लूसिफ़ेरे विश्लेषण शामिल है। कॉलम रंग-कोडित होते हैं ताकि यह इंगित किया जा सके कि प्रत्येक ढलान मूल्य उत्पन्न करने के लिए किस डेटा का उपयोग किया गया था और सूत्रों को स्प्रेडशीट में इम्बेड किया जाता है। डबल क्लिक कुएं से डेटा को प्रोसेस करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले फॉर्मूले का पता चल जाएगा । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विधि के महत्वपूर्ण कदम
किसी दिए गए सेल लाइन और माउस तनाव के लिए इंजेक्ट की गई कोशिकाओं (चरण 3) की संख्या को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह उन मेटास्टेस की संख्या और प्रयोग की लंबाई को बहुत प्रभावित कर सकता है। यदि बहुत सारी कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है या मेटाटैस बहुत लंबे समय तक बढ़ता है, तो मेटाटैस आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव को आकलन करने में मुश्किल हो सकती है। हालांकि, अगर बहुत कम कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, तो कुछ या कोई मेटाटैस नहीं बन सकता है। इस प्रकार, इष्टतम संख्या और मेटाटैस बढ़ने वाले समय की लंबाई निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की विभिन्न संख्याओं का उपयोग करके एक प्रारंभिक प्रयोग किया जाना चाहिए। एक समूह के भीतर मेटाटैस की लगातार संख्या सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक माउस में व्यवहार्य कोशिकाओं की समान संख्या इंजेक्ट करें। चूंकि कोशिकाएं ट्यूब और सिरिंज दोनों में बस सकती हैं, इसलिए कोशिकाओं को सिरिंज लोड करने से पहले धीरे-धीरे फिर से निलंबित किया जाना चाहिए, और सेल निलंबन को बहुत लंबे समय तक सिरिंज में नहीं छोड़ा जाना चाहिए (चरण 4.3.2)। सेल व्यवहार्यता कम हो जाती है अब कोशिकाओं निलंबन में हैं, तो ट्राइप्सिनाइजेशन और कोशिकाओं के इंजेक्शन के बीच समय की राशि एक घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए (चरण 4.2.5)। हवा के बुलबुले और कोशिकाओं के बड़े झुरमुट इंजेक्शन नहीं होना चाहिए क्योंकि ये एम्बोली का कारण बन सकते हैं जो माउस को मारते हैं। इसके अलावा, सुई के माध्यम से कोशिकाओं को ड्राइंग उन्हें कतरनी कर सकते हैं, इसलिए सिरिंज को सुई के बिना लोड किया जाना चाहिए। पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत समान संख्या इंजेक्शन था, वीवो लाइव पशु छवियों में इंजेक्शन के तुरंत बाद लिया जा सकता है(चित्रा 2बी, चित्रा 4डी)

बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल का सटीक और लगातार मात्रा महत्वपूर्ण है और डी-लूसिफ़ेरिन लेने और मेटाबोलिंग कोशिकाओं पर निर्भर है। यह डी-लूसिफ़ेरिन की खुराक, इंजेक्शन की खुराक, माउस के शरीर के तापमान, इंजेक्शन के समय माउस को कैसे एनेस्थेटाइज्ड करता है, और इमेजिंग से पहले एनेस्थीसिया चैंबर में माउस कैसे तैनात होता है, सहित कई चरों से प्रभावित किया जा सकता है। इसलिए, इन चरणों को सभी चूहों और इमेजिंग सत्रों के लिए सुसंगत रखना महत्वपूर्ण है। हमने संज्ञाहरण कक्ष में लगातार माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग किया। चूंकि सिग्नल को बायोल्यूमिनेसेंट और फ्लोरोसेंट डिटेक्शन दोनों के लिए ऊतक में प्रवेश करना चाहिए, इसलिए प्रत्येक छवि के लिए माउस की स्थिति को लगातार रखना भी महत्वपूर्ण है (इसकी पीठ पर फ्लैट फेफड़ों की इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा काम करता है)। वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग में फ्लोरोसेंट छवियों का परिमाणीकरण हमेशा दक्षता % इकाइयों का उपयोग करके किया जाना चाहिए क्योंकि यह छवियों के बीच उचित तुलना के लिए अनुमति देता है। इसी तरह, कुल प्रवाह (फोटॉन/सेकंड) का उपयोग हमेशा बायोल्यूमिनेसेंट छवियों को मात्रा देते समय किया जाना चाहिए । मेटास्टैटिक बोझ के विश्लेषण के लिए, लॉग10 परिवर्तन विकास वक्र (अधिकतम संकेत तक पहुंचने से पहले) को एक रैखिक साजिश में परिवर्तित करता है, जो ढलान विश्लेषण के लिए आवश्यक था।

संशोधन, और विधि की समस्या निवारण
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कोशिकाओं की आबादी को पहले फ्लोरोसेंट प्रोटीन और लूसिफ़ेरेज़ के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया जाता है, फिर उस जनसंख्या को या तो नियंत्रण वेक्टर या ब्याज के जीन को लक्षित करने वाले वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाता है। यह सुनिश्चित करता है कि दोनों सेल आबादी में समान फ्लोरोसेंट प्रोटीन और लूसिफ़ेरेज़ अभिव्यक्ति होती है। हालांकि, एक विकल्प के रूप में, वायरल वैक्टर जो इन घटकों में से दो को एक साथ वितरित करते हैं, का उपयोग किया जा सकता है। दरअसल, प्रतिनिधि प्रयोगों में हमने 4T1-ल्यूसिफ़ेरेस कोशिकाओं में shRNAs व्यक्त करने के लिए रेट्रोवायरल वेक्टर व्यक्त करने वाले जेडग्रीन का उपयोग किया। यह सिफारिश की जाती है कि ब्याज के जीन को बदलने के बाद लूसिफ़ेरेज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सभी सेल समूहों में परख़ला दिया जाए। समूहों के बीच अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तर डेटा की व्याख्या को जटिल बना सकते हैं, इसलिए यह सबसे अच्छा है यदि विभिन्न समूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और लूसिफ़ेरेस दोनों की समान अभिव्यक्ति है। इसके अतिरिक्त, लाल रक्त कोशिकाओं को ऑटोफ्लोरोसेंट किया जा सकता है और फेफड़ों में फ्लोरोसेंट मेटास्टेम्स की कल्पना करना मुश्किल हो सकता है। यदि यह मामला है, तो लाल रक्त कोशिकाओं को इच्छामृत्यु के दौरान पीबीएस परफ्यूजन द्वारा फेफड़ों से साफ किया जा सकता है ताकि ऑटोफ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम किया जा सके (उचित इच्छामृत्यु तकनीकों और दिशानिर्देशों का पालन किया जाना चाहिए)। यद्यपि हमारे प्रतिनिधि प्रयोगों में नियंत्रण और नॉकडाउन समूहों के बीच मतभेद नाटकीय हैं, अंतर्निहित माउस-टू-माउस परिवर्तनशीलता जो अक्सर वीवो मेटास्टेसिस परखमें मौजूद होती है, नियंत्रण चूहों में स्पष्ट है(चित्रा 3बी और चित्रा 5बी)। जब यह परिवर्तनशीलता अधिक होती है, तो यह नॉकडाउन प्रभाव की भयावहता का निर्धारण करना मुश्किल बना सकता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि इस परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नियंत्रण कोशिकाओं और अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन और अलग लूसिफ़ेरेज़ एंजाइमों के साथ नॉकडाउन कोशिकाओं लेबल और फिर समान संख्या में दो आबादी मिश्रण और मिश्रण सुई है । उदाहरण के लिए, टमाटर और रेनिला लूसिफेराज़ को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए ZsGreen और जुगनू लूसिफ़ेरेस व्यक्त करने वाली नॉकडाउन कोशिकाओं के साथ मिलाया जा सकता है। वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस में जुगनू लूसिफ़ेरेज से रेनिला लूसिफ़ेरेज और जेडग्रीन से टमाटर को अलग कर सकते हैं, इसलिए या तो फ्लोरेसेंस या ल्यूमिनेसेंस का उपयोग प्रत्येक सेल आबादी को स्वतंत्र रूप से बताने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, जीवित जानवरों में प्राथमिक ट्यूमर के रूप में बढ़ रही 4T1 कोशिकाओं की दोहरी लूसिफ़ेरे इमेजिंग को वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस4में उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट सिग्नल में ओवरलैप हो सकता है, इस प्रकार एक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग कदम (निर्माताओं के दिशानिर्देश देखें) को इस दृष्टिकोण में शामिल किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, रेनिला लूसिफ़ेरेज़ और जुगनू लूसिफ़ेरेज़ को पर्याप्त समय में देरी के साथ अलग से चित्रित किया जाना चाहिए जो पहले लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल के लिए अनुमति देता है जो दूसरे इमेजिंग से पहले पता लगाने योग्य नहीं है। अलग फ्लोरोफोरस के उपयोग से फेफड़ों में मेटास्टेसिस की संख्या और आकार की मात्रा16हो जाती है . फेफड़ों के अलावा अन्य अंगों में मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और विकास का परीक्षण करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है और इंट्राकार्डियक और पोर्टल नस इंजेक्शन9,10के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

विधि की सीमाएं
फ्लोरोसेंटी लेबल वाले कैंसर कोशिकाओं के साथ मिलकर वास्तविक समय मेटास्टैटिक बोझ प्राप्त करने के लिए वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करना मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और बाद के विकास परख करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है; हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाएं हैं। कुछ जीन मेटास्टेमिस में विशिष्ट भूमिकाओं के बजाय जन्मजात कोशिका प्रसार के लिए आवश्यक हो सकते हैं। इन विट्रो सेल प्रसार परख ों को वीवो प्रयोग से पहले किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि जीन इन विट्रो विकास को बाधित करता है या नहीं । एक जीवित जानवर की इमेजिंग करते समय, मेटास्टासेस से बायोल्यूमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट सिग्नल ऊतक के माध्यम से गुजरने के लिए पर्याप्त मजबूत होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, ऊतक के ऑप्टिकल गुण (यानी, अवशोषण और बिखरने) भी पता लगाने55को प्रभावित करते हैं। उत्तेजना प्रकाश स्रोत को फ्लोरोसेंटी लेबल वाले कैंसर कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए ऊतक के माध्यम से पारित करने में सक्षम होना चाहिए और बायोल्यूमिनेसेंस में फ्लोरेसेंस की तुलना में एक बड़ी गतिशील सीमा है। इस प्रकार, हालांकि फ्लोरेसेंस का उपयोग जीवित पशु इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, आंतरिक अंगों में संकेत का पता लगाने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस को पसंद किया जाता है। इसके अलावा, कुछ इम्यूनोसक्षम माउस उपभेदफ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को अस्वीकार कर सकते हैं। दरअसल, हमने पाया कि टमाटर, GFP, या mCherry व्यक्त कोशिकाओं को अस्वीकार कर दिया या नीचे फ्लोरोफोरविनियमित जब BALB में बढ़ रही/ हालांकि, जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है(चित्रा 3 और चित्रा 5)और पहले15,16,ZsGreen लेबल कोशिकाओं इन चूहों में पता लगाने योग्य हैं । ऐसे मामलों में जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति अज्ञेय हो जाती है, सापेक्ष मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण की मात्रा निर्धारित करने का एक और तरीका क्यूपीसीआर का उपयोग एकीकृत वायरल वेक्टर15में फ्लोरोसेंट जीन या किसी अन्य जीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए है। हालांकि एक वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग डिवाइस आपको मेटास्टैटिक बोझ में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति देता है, यह किसी को यह निर्धारित करने की अनुमति नहीं देता है कि ये परिवर्तन बदले हुए आकार या मेटास्टेसिस की संख्या के कारण हैं या नहीं। इसमें मेटासेट्स की लोकेशन के बारे में भी स्थानिक जानकारी नहीं दी गई है। इसके अलावा, संकेत की ताकत ऊतक में कितनी गहरी है से प्रभावित किया जा सकता है।

विधि और संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों का महत्व
अधिक या अलग जानकारी हासिल करने के लिए इस दृष्टिकोण को संशोधित किया जा सकता है। मानव कैंसर सेल लाइनों या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष सहित कैंसर सेल लाइनों की एक किस्म इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । अन्य माउस मॉडल का भी उपयोग किया जा सकता है, जिसमें ट्रांसजेनिक या नॉकआउट चूहों शामिल हैं जो यह परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं कि स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा बनाए गए प्रोटीन को लक्षित करने से मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं के विकास को कैसे प्रभावित करता है। यदि कई उम्मीदवार जीन का परीक्षण किया जाना है, तो इस दृष्टिकोण को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है क्योंकि वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग उपकरणों में फ्लोरोफोरस की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगा सकते हैं और अलग कर सकते हैं। इससे आवश्यक चूहों की संख्या में कमी आएगी और परीक्षण किए जा सकने वाले लक्ष्यों की संख्या में वृद्धि होगी । वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग में मेटास्टेस के स्थान के बारे में बहुत अधिक स्थानिक जानकारी प्रदान करने के लिए एक्स-रे या सीटी9 इमेजिंग के साथ भी जोड़ा जा सकता है। अंत में, इस दृष्टिकोण को मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण झरना के भीतर अधिक विशिष्ट कदम परख करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर सेल सीडिंग (इंट्रावैस्कुलर सर्वाइवल, एक्सट्रावेशन और पोस्ट एक्सट्रावेशन सर्वाइवल) में शामिल कदमों को इंजेक्शन के बाद पहले 3 दिनों के भीतर कई समय बिंदुओं पर फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करके प्रतिष्ठित किया जा सकता है (जैसे कि यहां16किया गया)। इस मामले में, फेफड़ों को संवहनी मार्कर और इमेज्ड एक्स वीवो के साथ भी दाग दिया जा सकता है ताकि कैंसर कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित किया जा सके जो प्रत्येक समय बिंदु56,57पर एक्सपेरिमेंट्स हुए हैं।

संक्षेप में, पूंछ नस इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंट और ल्यूमिनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के वीवो लाइव एनिमल इमेजिंग में वास्तविक समय का उपयोग अधिक विस्तृत विश्लेषण को सक्षम बनाता है कि कैसे एक उम्मीदवार जीन या जीन मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण और बाद के विकास को प्रभावित करता है। यह दृष्टिकोण ऑटोकॉन्सस माउस मॉडल की तुलना में तेज और कम महंगा है और सहज मेटाटैसिस मॉडल के कुछ चेतावनी से बचा जाता है। मेटास्टासे का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के साधन के रूप में फ्लोरेसेंस और ल्यूमिनेसेंस दोनों का उपयोग शोधकर्ताओं को स्वतंत्र readouts देता है जो परिणामों में विश्वास में सुधार करता है और प्रायोगिक डिजाइन में लचीलेपन की अनुमति देता है। मेटास्टेसिस आकार और संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस का उपयोग समय लेने वाली और संभावित रूप से महंगा हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण और विश्लेषण की आवश्यकता से बचा जाता है, और पूरे ऊतकों के अतिरिक्त उपयोग के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल का उपयोग उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति या कार्य में हेरफेर करने के लिए कई विभिन्न तकनीकों के साथ किया जा सकता है, जैसे आरएनएआई, ट्रांसजीन अभिव्यक्ति, या CRISPR/Cas-मध्यस्थता संपादन, और इसका उपयोग छोटे अणुओं का परीक्षण करने, एंटीबॉडी को अवरुद्ध करने वाले कार्य, या अन्य संभावित चिकित्सीय यौगिकों के लिए भी किया जा सकता है । जैसा कि ऊपर बताया गया है, परख को बढ़ाने और अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए कई सरल संशोधन किए जा सकते हैं। यह दृष्टिकोण प्रो-मेटास्टैटिक जीन की पहचान करने और परीक्षण करने का एक आदर्श तरीका है जिसमें कैंसर के उपचार के लिए चिकित्सीय क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वायरल संक्रमण और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के साथ सहायता के लिए एमिली नॉर्टन का शुक्रिया अदा करते हैं । हम फेफड़ों में हरे मेटासकेज की छवि विश्लेषण के साथ मदद के लिए फेफड़ों और केट ई. ट्यूब्सिंग की छवियों को प्राप्त करने में मदद के लिए रयान कनाई को भी धन्यवाद देते हैं। हम उनके समर्थन के लिए और इस वीडियो की तैयारी में सहायता के लिए पशु अनुसंधान सुविधा कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एक सुसान जी कोमेन कैरियर उत्प्रेरक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जो जेएमएल (#CCR17477184) को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

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References

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