Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det beskrevet innfallsvinkel syndikatene eksperimentelle hale vene metastasering analyser med inne vivo bo dyr tenkelig å tillate virkelig-tid avlytting av brystkreften metastasering formasjon og oppblomstringen foruten kvantifisering av metastasering antallet og størrelse inne det lungen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastasering er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall og det er begrensede terapeutiske alternativer for pasienter med metastatisk sykdom. Identifisering og testing av romanen terapeutiske mål som vil lette utviklingen av bedre behandlinger for metastatisk sykdom krever prekliniske in vivo-modeller. Demonstrert her er en syngeneic mus modell for assaying brystkreft metastatisk kolonisering og påfølgende vekst. Metastatisk kreftceller er stabilt transduced med viral vektorer koding Firefly luciferase og ZsGreen proteiner. Kandidat gener er så stabilt manipulert i luciferase/ZsGreen-uttrykker kreftceller og deretter cellene injiseres i mus via lateral halen venen til analysen metastatisk kolonisering og vekst. En inne vivo tenkelig apparat er så pleide mål det bioluminesens eller fluorescens av det svulst celler inne det lever dyrene å kvantifisere endre inne metastatisk lasten over tid. Uttrykket av det fluorescerende proteinet gjør at antallet og størrelsen på metastaser i lungene kan kvantifisert på slutten av eksperimentet, uten behov for snitting eller histologiske farging. Denne tilnærmingen gir en relativt rask og enkel måte å teste rollen som kandidat gener i metastatisk kolonisering og vekst, og gir mye mer informasjon enn tradisjonelle hale vene metastasering analyser. Ved hjelp av denne tilnærmingen, viser vi at samtidige knockdown av Ja assosiert protein (YAP) og transcriptional co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) i brystkreftceller fører til redusert metastatisk byrde i lungene og at denne reduserte byrden er et resultat av signifikant nedsatt metastatisk kolonisering og redusert vekst av metastaser.

Introduction

Kreft er fortsatt den nest største dødsårsaken over hele verden1 og metastasering er ansvarlig for de fleste av disse dødsfallene2,3. Imidlertid har en begrenset forståelse av de molekylære mekanismene som regulerer metastatisk kolonisering og påfølgende vekst hindret utviklingen av effektive behandlinger for metastatisk sykdom. Identifikasjonen av romanen terapeutiske mål krever en analyse for å teste hvordan perturbed uttrykk eller funksjon av en kandidat genet påvirker metastasering dannelse og vekst. Mens autochtonous musemodeller har sine fordeler, er de tidkrevende og kostbare å generere, noe som gjør dem mer egnet for mål validering i stedet for målgjenkjenning. Transplant modellsystemer der kandidat genet er perturbed i kreftceller in vitro og deretter effekter på metastatisk potensial er vurdert i Vivo, er rimeligere og høyere gjennomstrømning enn autochtonous modeller. I tillegg, viral vektorer for stabil levering av RNAi, CRISPR/CAS9, og transgenes er allment tilgjengelig, noe som gjør det relativt enkelt å forurolige nesten alle gen eller gener av interesse i en kreftcelle linjer. Denne tilnærmingen kan også brukes til å analysen rollen som kandidat gener i metastatisk kolonisering og vekst i menneskets kreftcelle linjer ved å transplantere cellene i immunsupprimerte eller humanisert mus.

De to typer analyser brukes til å teste metastasering dannelse av transplanterte kreftceller in vivo er spontane metastasering analyser og eksperimentelle metastasering analyser. I spontane metastasering analyser4,5, er kreftceller injiseres i mus, lov til å danne en primær svulst, og deretter spontan metastasering dannelse og påfølgende vekst er analyseres. Styrken i denne modellen er at cellene må fullføre alle trinnene i metastatisk prosess for å danne metastatisk svulster. Men mange kreftcelle linjer ikke metastase effektivt i spontane metastasering modeller, og enhver manipulering av cellene som påvirker primære tumor vekst kan forvirre resultatene av metastasering analysen. Eksperimentelle metastasering analyser, der kreftceller injiseres direkte i sirkulasjon, brukes for å unngå disse fallgruvene. Vanlige eksperimentelle metastasering analyser inkluderer hale vene injeksjon6,7,8 (og demonstrert her), intrakardielle injeksjon9, og Portal vene injeksjon10.

Formålet med protokollen som presenteres her er å gi en in vivo eksperimentell metastasering analysen som gjør at en forsker til å overvåke metastasering dannelse og vekst i sanntid, samt å kvantifisere endepunktet metastasering nummer og størrelse i lungene av samme mus. For å oppnå dette, tradisjonell eksperimentell hale vene metastasering analyser6,7,8 er kombinert med levende dyr Imaging, ved hjelp av en in vivo Imaging Device9,11,12,13,14. Tumor celler stabilt uttrykker både luciferase og et fluorescerende protein injiseres i mus via lateral halen blodåre og deretter in vivo Imaging enheten brukes til å måle endringer i metastatisk byrde i lungene over tid (figur 1). Imidlertid, det inne vivo bo dyr tenkelig apparat kan ikke skjelne eller målnummeret av individ metastaser. Således, på slutten av forsøket, en fluorescerende stereomikroskopet brukes til å telle antall og måle størrelsen på fluorescerende metastaser i lungene uten behov for snitting og histologi eller immunhistokjemi (figur 1). Denne protokollen kan brukes til å teste hvordan endring av uttrykket eller funksjonen til et kandidat gen påvirker metastasering dannelse og vekst. Potensielle terapeutiske forbindelser som små molekyler eller funksjon blokkerer antistoffer kan også testes.

For å demonstrere denne tilnærmingen, vi først utførte et bevis på konseptet eksperiment der de essensielle replikering faktor, replikering protein a3 (RPA3) er slått ned i metastatisk mus brystkreftceller. Vi viser at mus injisert med RPA3 knockdown celler har betydelig mindre metastatisk byrde på hvert tidspunkt sammenlignet med mus injisert med kontroll celler. Analyse av metastasering lungene viser at denne reduserte metastatisk byrden er et resultat av betydelig redusert metastatisk kolonisering og nedsatt vekst av metastaser som dannes. For ytterligere å demonstrere denne teknikken, testet vi om samtidig slå ned Ja tilknyttet protein (YAP) og transcriptional co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) svekker metastatisk kolonisering eller påfølgende vekst. YAP og TAZ er to relaterte transcriptional co-aktivator som er den kritiske nedstrøms effekt Orer av Hippo Pathway. Vi15,16 og andre har innblandet YAP og Taz i metastasering (omtalt i17,18,19), noe som tyder på at disse proteinene er gode terapeutiske mål. Konsekvent, fant vi at mus injisert med YAP/TAZ knockdown celler hadde betydelig redusert metastatisk byrde. Analyse av lungene viste at YAP/TAZ knockdown celler dannet mange færre metastaser og at metastaser som gjorde form var mindre. Disse eksperimentene viser hvordan eksperimentelle metastasering analyser tillate en forsker til raskt og rimelig teste rollen som en kandidat genet i metastasering formasjon og vekst. De viser videre hvordan den kombinerte bruken av levende dyr Imaging og fluorescerende kvantifisering av metastaser i hele lungene gjør at forskeren å bedre forstå trinnene under metastatisk kolonisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen innebærer bruk av mus og biologisk farlige materialer og krever godkjenning fra de aktuelle institusjonelle sikkerhets komiteer. Alle de beskrevne in vivo arbeid her er godkjent av Albany Medical College institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen (IACUC).

Merk: for en protokoll oversikt, se skjematisk i figur 1.

1. pakking alle nødvendige retroviruses og lentiviruses

Merk: Den beskrevne protokollen bruker lentiviral eller retroviral vektorer til stabilt uttrykke et luciferase enzym og fluorescerende protein, samt å manipulere uttrykk for en kandidat genet. Disse virusene er pakket i HEK-293FT celler som beskrevet nedenfor.

  1. Dag 1: plate HEK-293FT celler på 6-brønn plater i 2 mL komplett vekst Media (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin) slik at de er 40-60% confluent på dag 2. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 over natten.
  2. Dag 2: for hver viral vektor skal pakkes, transfect en 40-60% confluent brønn av HEK-293FT celler med retroviral eller lentiviral vektor og riktig vektorer koding av viral pels og emballasje proteiner.
    Merk: denne protokollen bruker VSVG som pels protein, psPAX2 for lentiviral emballasje, og gag-Pol for retroviral emballasje (se supplerende tabell 1 for vektor liste).
  3. Lag en co-transfeksjoner blanding for hver brønn som følger:
    1. Kombiner 4 μL av lipid oppløsning for transfections (se tabell over materialer) og 96 μL av transfeksjoner buffer og ruge i 5 minutter.
    2. Tilsett 1 mikrogram viral vektor, 0,5 μg av pels protein vektor (VSVG) og 0,5 μg av protein vektor med emballasje (psPAX2 eller gag-Pol) og ruge i 20 minutter.
    3. Legg forsiktig til transfeksjoner blandingen fra trinn 1.3.2 til HEK-293FT cellene belagt i trinn 1,1 og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 over natten.
  4. Dag 3: Fjern det transfeksjoner mediet fra hver brønn, og Legg forsiktig til 2 mL komplett vekstmedium i hver brønn. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 i ca 24 timer.
  5. Dag 4: samle viral supernatanten fra hver brønn ved hjelp av en 3 mL sprøyte og Filtrer gjennom et 0,45 μm filter til et 2 mL mikrosentrifugen rør.
  6. Valgfritt: Hvis det ønskes samling av en ny gruppe med virus, legger du forsiktig til 2 mL fullstendig vekstmedium i hver brønn og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 i ca. 24 timer.
  7. Dag 5 (valgfritt): samle en ny runde med viral supernatanten som i trinn 1,5.
    Merk: protokollen kan stanses midlertidig ved å fryse den virale supernatanten.

2. generering av kreftceller stabilt uttrykker luciferase og et fluorescerende protein

Merk: følgende protokoll beskriver hvordan du først til stabilt merke 4T1 celler med Firefly luciferase og et fluorescerende protein (ZsGreen) ved hjelp av to vektorer med unike utvalg gener. Deretter en 3Rd viral vektor brukes til å manipulere uttrykk for en kandidat genet. Men, viral vektorer som samtidig leverer et fluorescerende protein og en genetisk manipulasjon kan også brukes som et alternativ (som i representative eksperimenter nedenfor). Andre kreftceller kan brukes, men celle tallene bør optimaliseres for trinn 2,1 og 2.7.1.

  1. Plate 4T1 celler på 1,5 x 105 celler/brønn i en 12-brønn plate i fullstendig vekst Media (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/Streptomycin og 2 mm L-glutamin) og ruge ved 37 ° c, 5% co2 over natten.
  2. Infisere 4T1 celler med viral supernatanten generert i trinn 1 som følger.
    1. Aspirer veksten medier fra cellene og tilsett 500 μL av luciferase viral supernatanten og 500 μL av fluorescerende protein viral supernatanten å samtidig infisere cellene med både luciferase og fluorescerende protein viral supernatanter.
    2. Tilsett 1 μL av 8 mg/mL hexadimethrine bromide (se tabell over materialer).
    3. Ruge cellene ved 37 ° c, 5% til 75-90% confluent (vanligvis 24-48 timer).
  3. Trypsinize 4T1-cellene med 500 μL av Trypsin i 2-5 minutter (cellene skal fritt skylles av bunnen av brønnen). Overfør alle cellene til en 6 cm rett i 4 mL utvalg medier (komplett vekstmedium som inneholder riktig antibiotika) og dermed slukke Trypsin. Plate en 6 cm rett av ikke-infiserte kontroll celler i samme utvalg medier.
    Merk: hensiktsmessig antibiotika konsentrasjon bør fastsettes forut for tid ved å teste flere doser. I tillegg kan fluorescens-aktiverte celle sortering også brukes til å velge fluorescensmerkete merket celler i stedet for narkotika valg.
  4. Ruge cellene ved 37 ° c, 5% CO2 i utvalg medier og splitt cellene når det er nødvendig til alle ikke-infiserte kontroll celler er døde (avhengig av valg genet og cellelinje).
  5. Bekreft at de infiserte 4T1-cellene uttrykker ZsGreen fluorescerende protein ved hjelp av et grønt eksitasjon (450-490 NM)/Emission (500-550 NM) filter satt på et invertert fluorescerende mikroskop ved 50-100/s forstørrelse.
  6. Bekreft at de infiserte 4T1-cellene uttrykker luciferase ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig luciferase som følger.
    1. Bruk et minimalt volum av 1x passiv lyseringsbuffer til lyse luciferase-uttrykker 4T1 celler og kontrollere 4T1 celler som ikke uttrykker luciferase, forsiktig risting i 30 minutter.
    2. Tilsett 20 μL av celle lysat til en hvit-bunn 96-brønn plate og deretter 50 μL av luciferase analysen reagens fra luciferase aktivitet Kit.
    3. Bruk en plate leser til å måle luminescence fra cellene ved alle bølgelengder i spekteret ved hjelp av luminescence-innstillingen.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig ved å fryse ned de stabilt transduced cellene.
  7. Manipulere uttrykket av kandidat genet som følger:
    1. Plate 6 x 105 merket 4T1 celler fra trinn 2,6 på en 60 mm rett i 4 ml komplett vekst Media og ruge ved 37 ° c, 5% co2 over natten.
    2. Aspirer vekst mediene fra hver brønn og tilsett 2 mL komplett vekstmedium inneholdende 4 μL av 8 mg/mL hexadimethrine bromide.
    3. Tilsett 2 mL viral supernatanten fra trinn 1 til cellene belagt fra trinn 2.7.2 og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 over natten.
    4. Trypsinize 4T1-cellene med 500 μL av Trypsin i 2-5 minutter (cellene skal fritt skylles av bunnen av brønnen). Overfør alle cellene til en 10 cm rett i 10 mL utvalg medier (komplett vekstmedium som inneholder riktig antibiotika) og dermed slukke Trypsin. Plate noen ikke-infiserte kontroll merket 4T1 celler i samme utvalg medier.
    5. Ruge cellene ved 37 ° c, 5% CO2 i utvalg medier og splitt cellene når det er nødvendig til alle ikke-infiserte celler er døde.
    6. Bekreft at uttrykket for kandidat genet endres ved hjelp av en standard tilnærming, for eksempel Western Blot20 eller qPCR21.
    7. Analysen luminescence og fluorescens som i trinn 2.5-2.6 for å finne ut hvor like de er i kontroll og knockdown celler, da dette kan endre (se diskusjon).
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig ved å fryse ned de stabilt transduced cellene.

3. optimalisering av in vivo eksperimentell design

  1. Optimaliser riktig celle nummer og varighet av eksperimentet for ønsket metastatisk byrde som følger.
    1. Utvid de fluorescerende og Puerto Mosquito 4T1-cellene fra trinn 2,6 i komplette vekst medier, slik at overflødige celler er tilgjengelige på den ønskede injeksjons dagen.
    2. Klargjør cellene for hale vene injeksjoner som beskrevet i trinn 4,2. For å finne det optimale celle tallet for injeksjoner, resuspend cellene i flere forskjellige konsentrasjoner i 100 μL av 1x PBS.
      Merk: Vi anbefaler at du tester en rekke celle tall/mus fra 25 000 til 500 000.
    3. Hold cellen suspensjoner på isen til injeksjon.
    4. Injiser hver fortynning av 4T1-celler fra trinn 3.1.2 til 3-4 mus via den laterale hale venen beskrevet i trinn 4,3 (se nedenfor).
    5. Retur musa å dens bur og dataskjerm for 15 minuttene å sikre en i sin helhet det å bli frisk. Mus bør sjekkes for tegn på smerte eller nød 3x ukentlig.
    6. Overvåk mus for metastasering dannelse og vekst i 3-6 uker (cellelinje og mus belastning avhengig) ved hjelp av en in vivo levende dyr bildeenhet (se trinn 5 og 6).
      1. Euthanize mus 3-6 uker etter at halen vene injeksjon i henhold til standard institusjonelle retningslinjer.
      2. Klargjør lungene og Vurder metastasering størrelse og antall som er beskrevet i trinn 7.
      3. Velg riktig tidsrom for metastaser å vokse for ønsket metastatisk byrde (se diskusjon).

4. hale blodåre injeksjon av merket kreftceller

Merk: trinn 4.2.4 er optimalisert for 4T1 celler som vokser i syngeneic BALB/c mus. Hvis andre kreftcelle linjer og mus stammer brukes, antall celler injisert, og lengden av analysen bør først optimaliseres.

  1. Utvid 4T1 cellelinjer generert i trinn 2 på 2 15 cm retter i fullstendig vekst medier, slik at overflødige celler er tilgjengelige på injeksjons dagen.
  2. Forbered cellene for hale vene injeksjon som følger:
    1. Aspirer mediene og skyll celle platene med 1x PBS.
    2. Trypsinize cellene med 5 mL Trypsin per 15 cm plate i 2-5 minutter (cellene skal fritt skylles av bunnen av brønnen). Overfør alle cellene til et konisk rør. Vask gjenværende celler fra vevet kultur parabolen med nok komplett vekst Media for å slukke Trypsin og tilsett vask til samme koniske rør.
    3. Telle cellene ved hjelp av en automatisert celle teller for å bestemme det totale celle nummeret.
    4. Sentrifuger cellene ved 122 x g i 3 minutter, aspirer supernatanten, og resuspend cellene i 1x PBS ved ønsket konsentrasjon. Her, 2,5 x 104 celler injiseres i hver mus i 100 ΜL av PBS, så resuspend cellene på 2,5 x 105 celler/ml. Hold cellen suspensjoner på isen til injeksjon.
      Merk: det er viktig å begrense mengden av tid mellom trypsinization av cellene og halen blodåre injeksjon til ca 1 time.
  3. Injiser 4T1 celler fra trinn 4.2.5 til mus via den laterale hale venen som følger:
    1. Arbeider i en hette på dyret anlegget, forsiktig men grundig blande cellene ved invertere røret eller ved hjelp av en 1 mL sprøyte for å sikre at de er jevnt resuspendert. Forsikre deg alltid om at cellene er resuspendert før du legger i sprøyten.
    2. Legg en 1 mL luer sprøyte med celle fjæring og fjern overflødig luftbobler. Plasser en 1/2 tommer, 30-gauge nål på sprøyten med skråkant opp og utvise luftbobler.
    3. Forsiktig plassere musen i en gnager restrainer.
    4. Den laterale halen årer skal være synlig og utvidet. Hvis ikke, forsiktig klype bunnen av halen og dypp halen i varmt vann fra springen til dilate venene.
      Merk: utvidelse av venene kan også oppnås ved å plassere musen buret under en varmelampe og/eller på toppen av en varmepute.
    5. Bruk en alkohol tørke for å rengjøre halen. Stikk nålen inn i hale venen, skrå siden opp og Injiser 100 μL av celle oppheng.
      Merk: Hvis nålen er satt riktig inn i venen, bør det lett gli litt forover og bakover, og det bør ikke være motstand når stempelet skyves. Vellykket injeksjoner bør også resultere i en "flush" der den blå fargen på venen blir hvit i noen sekunder etter injeksjonen.
  4. Langsomt fjerne nålen og bruke et sterilt gasbind, legge press på injeksjonsstedet for å stoppe eventuelle blødninger.
  5. Retur musa å dens bur og dataskjerm for 15 minuttene å sikre i sin helhet det å bli frisk. Mus bør sjekkes for tegn på smerte eller nød 3x ukentlig.
  6. Overvåk mus for metastasering dannelse og vekst i 3-6 uker (cellelinje og mus belastning avhengig) ved hjelp av en in vivo levende dyr bildeenhet (se trinn 5 og 6).

5. overvåking av metastatisk byrde ved fluorescens med en in vivo levende dyr tenkelig enhet

Merk: ikke bilde dyr for fluorescens med aktivt selvlysende signal.

  1. Hvis bare bilde bioluminesens, hopper du til trinn 6.
  2. Slå på in vivo Live Animal Imaging Device.
  3. Sett opp in vivo Live dyr Imaging anestesi system i henhold til produsentens retningslinjer for å levere mellom 1,5% og 2% isoflurane til anestesi kammeret og bilde kammeret.
  4. Bedøve mus med fluorescensmerkete merket metastaser fra trinn 4 ved å plassere dem i en anestesi kammer og levere 1,5-2,5% isoflurane.
  5. Åpne bilde programvaren (se tabell over materialer) og Logg inn.
  6. Klikk på Initialiser knappen og vent til maskinen initialiseres.
  7. Endre feltet for visning til D.
    Merk: synsfelt C kan også brukes hvis en nærmere visning av en mus er nødvendig, men dette begrenser antall mus som kan bli avbildet samtidig.
  8. Når programvaren har indikert at kameraet har nådd riktig temperatur, klikker du på Imaging Wizard -knappen, velger fluorescens og velger deretter det passende filter paret fra rullegardinmenyen.
    Merk: Hvis fluoroforen som brukes ikke er et alternativ, velg Input ex/EM og skriv inn eksitasjon og utslipp som kreves.
  9. Plasser musen i kammeret som beskrevet i trinn 3.2.4.
  10. Klikk på Hent sekvens.
  11. Etter tenkelig, retur musa å dens bur og dataskjerm for 15 minuttene å sikre i sin helhet det å bli frisk.
  12. Gjenta trinn 5,2 og trinn 5.7-5.9 med minst én mus som ikke inneholder metastaser. Merk: denne musen vil bli brukt til å kvantifisere og subtrahere bakgrunns signal under analyse (trinn 8).
  13. Bilde 2-3 ganger ukentlig for varigheten av eksperimentet.

6. overvåking av metastatisk byrde ved bioluminesens med en in vivo levende dyr tenkelig enhet

  1. Slå på in vivo Live Animal Imaging Device og oppsett av programmet som følger.
    1. Åpne bilde programvaren (se tabell over materialer) og Logg inn. Klikk på Initialiser knappen og vent til maskinen initialiseres. Endre feltet for visning til D.
      Merk: synsfelt C kan brukes for en nærmere visning til bildet hele musen kroppen; imidlertid begrenser dette antallet mus som kan bli avbildet på en gang.
    2. For første gangs bruk, Rediger eksponeringsinnstillinger som følger: Klikk Rediger | Innstillinger | Oppkjøp | Automatisk eksponering og endre maksimal eksponeringstid fra standard 60 sekunder til 300 sekunder og klikk på OK.
      Merk: ikke endre noen andre parametre i kategorien for automatisk eksponering.
  2. Sett opp anestesi systemet i henhold til produsentens retningslinjer for å levere mellom 1,5% og 2% isoflurane til anestesi kammeret og bilde kammeret.
  3. Kontroller at kameraet har nådd riktig temperatur før du går videre til trinn 6,4.
  4. Bedøve metastasering-som inneholder mus fra trinn 4 ved å plassere dem i en anestesi kammer og levere 1,5-2,5% isoflurane.
  5. Forbered mus for bioluminesens bildebehandling som følger.
    1. Legg en 1 mL sprøyte med D-luciferin (30 mg/mL i D-PBS) og legg deretter til en 1/2 tommer 30-gauge nål til sprøyten og fjern luftbobler.
    2. Mål og registrere massen av anesthetized musen.
    3. Hold musen ved å klemme på scruff av nakken ved hjelp av tommelen og pekeren fingrene og fatte halen mellom Pinkie finger og undersiden av hånden. Vend musen i en 45-graders vinkel, med hodet pekende nedover.
    4. Sett nålen, skrå siden opp, inn i musen venstre side intraperitoneal (IP) plass. Bekreft inntreden i IP-området ved å trekke tilbake et lite volum. Det bør ikke være farge på undersiden av nålen når du trekker tilbake i IP plass.
    5. Injiser riktig volum på D-luciferin for en dose på 150 mg/kg.
    6. Umiddelbart etter D-luciferin administrasjon, Start en tidtaker og Plasser musen flatt på baksiden i bildeenheten med nesen i nesen kjegle og sikre at 1.5-2.5% isoflurane blir administrert. Plasser skillevegger mellom hver mus hvis Imaging flere mus. Sørg for at mus er plassert så flat som mulig (dvs. ikke lener seg til den ene siden).
    7. Klikk selvlysende og fotografi boksene, og klikk deretter i oppkjøpet kontroll panel.
  6. Kontinuerlig tilegne seg Puerto Mosquito bilder til peak signalet er oppnådd og bruke bildet med peak Puerto Mosquito signal for analyse.
  7. Etter tenkelig, retur musa å dens bur og dataskjerm for 15 minuttene å sikre i sin helhet det å bli frisk.
  8. Bilde 2-3 ganger ukentlig for varigheten av eksperimentet.

7. kvantifisering av antall og størrelse på metastaser

Merk: hvor lang tid metastaser har lov til å vokse bør fastsettes for hver cellelinje og musen belastning, og vil bli påvirket av antall celler injisert.

  1. Euthanize musene i henhold til standard institusjonelle retningslinjer.
  2. Isoler og fjern lungene fra hver mus og skyll i 1x PBS å fjerne overflødig blod.
  3. Forsiktig skille lungene i fliker.
  4. Skaff deg bilder av ZsGreen metastaser i fliker på 10x i lyse felt og fluorescens ved hjelp av en fluorescerende stereoscope med et GFP bredbånds filter (eksitasjon 470/40x).
    Merk: Behold samme forstørrelse og lysstyrke for alle prøvene. Forstørrelsen som brukes kan variere avhengig av størrelse, antall og lysstyrke på metastaser samt synsfeltet for mikroskopet som brukes.
  5. Bruk bildeanalyse programvare for å kvantifisere størrelsen og antallet metastaser fra bildene.
    Merk: protokollen for bildeanalyse er programvare avhengig og kan optimaliseres med svulster fra trinn 3. Alternativt kan du telle antall metastaser i hver lunge manuelt ved hjelp av fluorescerende stereoscope. Protokoll kan stanses midlertidig her, og trinn 8 kan gjøres når som helst etter at alle in vivo-bildene er samlet inn.

8. prosessering og analyse av data fra bildene ervervet med in vivo Live dyr Imaging Device

  1. Åpne alle bildefiler for hver mus i bilde programvaren.
    Merk: Bruk bildet med topp Puerto Mosquito signal for analyse av
  2. Sørg for at enhetene er i stråleglans for Puerto Mosquito data og effektivitet for fluorescerende data ved å klikke på pilen øverst til venstre i bildevinduet og endre det til den aktuelle enheten.
  3. Bruk bildet fra den siste timepoint til å opprette en region av interesse (ROI) som følger.
    1. Klikk på Avkastnings verktøy i vinduet verktøy palett . Sett inn en ROI ved å klikke på pilen og velge 1.
    2. Klikk på grensen av AVKASTNINGEN og flytte den over brystet av musen. Juster størrelsen på AVKASTNINGEN slik at den dekker brystet av musen og utelukker ikke signal.
  4. Klikk mål ROIs og kopier eller skriv inn rå tallet i et Excel-ark.
    Merk: for Puerto Mosquito data velge den totale Flux (fotoner/sekund), som er summen av all utstråling i AVKASTNINGEN. Siden metastaser ikke nødvendigvis vokser jevnt, er den totale Flux foretrukket over gjennomsnittet utstråling fordi den måler summen av metastatisk byrde. Tilsvarende, for fluorescerende data, den totale effektiviteten% (utslipps lys (fotoner/sekund)/excitation lys (fotoner/sekund)) bør brukes i stedet for gjennomsnittlig effektivitet.
  5. Rett falle i staver inne bildet arkiv å avskrift det ROI anvendt i takt 8,3 og pasta den i enhver image arkiv.
    Merk: Når du kvantifisere fluorescerende bilder, kan du Kvantifisere det samme området på en mus som ble avbildet uten metastasering. Bruk dette signalet som bakgrunns signal og trekk det fra hver fluorescerende metastasering som inneholder muse bilde.
  6. Flytt limte ROIs over det samme området som er valgt i trinn 8.3.4 for hvert bilde, og gjenta trinn 8,4.
  7. Plott og analyser rådata som følger (se tilleggs tabell 2).
    1. Gjør en logg10 transformasjon av rådata for hver mus ved hjelp av den angitte formelen (supplerende tabell 2) og plot som i figur 2D og Figur 4F. Loggen10 transformasjon linearizes vekstkurven som har en tendens til å være geometriske og minimerer heteroscedasticity.
    2. Ved hjelp av lineær regresjon, beregne skråningen av den monterte linjen til loggen10 transformert data for hver mus plottet i trinn 8.7.1 (supplerende tabell 2). Se formelen i tilleggs tabell 2 for å tilpasse linjen og beregne stigningstallet i ett trinn.
    3. Plot de numeriske verdiene i bakkene som i figur 2E og Figur 4G. Bruk en student t-test eller enveis ANOVA (for mer enn 2 grupper) i bakkene for å bestemme statistisk betydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere ovennevnte tilnærming, utførte vi et bevis på konseptet eksperiment der en kritisk replikering faktor, RPA3 ble slått ned i en metastatisk mus melke kreftcelle linje (4T122). Mens protokollen beskriver merking cellene med både luciferase og fluorescerende proteiner før genetisk manipulasjon, brukte vi en modifisert tilnærming fordi RNAi vektorer også levere ZsGreen (figur 2a). Først 4T1 celler var stabilt transduced med en lentiviral konstruere koding Firefly luciferase og hygromycin motstand (pHAGE-luciferase-IRES-Hygrotermometersensor). Etter hygromycin valg ble det utført en luciferase-analyse for å bekrefte et stabilt uttrykk for Firefly-luciferase (figur 2a). Deretter ble 4T1-luciferase celler stabilt transduced med retroviral vektorer som uttrykker ZsGreen og enten en kontroll miR30-basert shRNA, eller en miR30-basert shRNA tidligere vist å effektivt målrette musen RPA316,23,24. Cellene ble deretter injisert i musene via lateral hale vene og in vivo Puerto Mosquito signal ble målt to ganger i uken for å overvåke metastatisk byrde (figur 2B, C). Loggen10 forvandlet signal for hver mus ble plottet som metastatisk byrde over tid (figur 2D) og bakkene i hver tomten ble bestemt (figur 2E). Disse dataene viser frekvensen av endring i metastatisk byrde er betydelig redusert med RPA3 knockdown sammenlignet med kontroll celler. Selv om forskjellene er slående, disse dataene alene ikke tillater oss å avgjøre om den reduserte metastatisk byrde er et resultat av mindre metastaser eller på grunn av tregere vekst av metastaser. Derfor ble ZsGreen-merket metastaser i lungene også analysert på slutten av eksperimentet. Mus injisert med RPA3 knockdown celler hadde nesten ingen metastaser i lungene, mens kontroll musene hadde mange store metastaser (Figur 3). Videre metastaser som gjorde form fra RPA3 knockdown celler var klart mindre enn kontroll 4T1 metastaser (Figur 3A). I samsvar med våre manuelle tellinger (Figur 3B), telte bildeanalyse programvare betydelig mindre metastaser i RPA3 knockdown mus (Figur 3C). I tillegg ble den totale metastatisk byrde i lungene (summen av områdene for hver metastasering i millimeter) også drastisk redusert med RPA3 knockdown (Figur 3D). Til slutt, størrelsen på den enkelte metastaser som dannet i RPA3 knockdown mus var generelt mye mindre enn de i kontroll musene (Figur 3E). I tillegg til de store metastaser i kontroll musene, gjorde vi observerer mange små metastaser også, men kan ikke avgjøre om disse er tumorceller som seeded lungene og ikke vokse, eller om de er tumorceller skur fra en av de større metastaser som re-seeded lungene på et nytt sted (Figur 3E). Samlet disse dataene viser at RPA3 er nødvendig for metastasering dannelse av 4T1 celler. Disse funnene var ventet fordi våre tidligere arbeid viste at RPA3 slå ned celler hadde signifikant redusert evne til å danne metastaser i lungene etter hale vene injeksjon16. Men, dette eksperimentet demonstrerer hvordan bruk levende dyr Imaging og fluorescerende kvantifisering av metastasering tall og størrelse kan brukes til å avgjøre om endringer i metastatisk byrde skyldes forskjeller i metastatisk kolonisering eller vekst.

For å demonstrere hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å svare på et mer biologisk relevant spørsmål, spurte vi om YAP og TAZ er nødvendig for metastatisk kolonisering og påfølgende vekst i denne syngeneic modell av brystkreft. Uttrykket og aktiviteten til YAP eller Taz er økt i mange kreftformer sammenlignet med normalt vev, og dette er prediktiv for dårlig pasient utfall25,26,27,28,29. I tillegg har flere studier innblandet YAP, Taz, eller TEADs, de kritiske YAP/Taz-bindende partnere, i metastasering15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47, 48, 49,50,51, 52. Gitt disse dataene vi brukte vår tilnærming til å teste om YAP og TAZ er nødvendig for metastasering dannelse og vekst. For dette bruker vi en retroviral vektor uttrykker tandem miR30-baserte shRNAs målretting både YAP og TAZ. Som vist, denne tandem shRNA effektivt reduserer YAP og TAZ protein uttrykk og transcriptional aktivitet i 4T1 celler (Figur 4A, B). 4T1-luciferase celler var stabilt transduced med en ZsGreen-uttrykker versjon av denne tandem YAP/Taz shRNA vektor eller en kontroll miR30-baserte shRNA (Figur 4C) og deretter analyseres av hale vene injeksjoner i syngeneic BALB/C mus. Som vist i Figur 4, var hastigheten som metastatisk byrde økt betydelig raskere i musene injisert med kontroll celler sammenlignet med musene INJISERT med YAP/Taz knockdown celler (Figur 4D-F). Betydelig færre metastaser dannet i musene injisert med YAP/TAZ knockdown celler sammenlignet med mus med kontroll celler enten telles manuelt (figur 5A, B) eller ved hjelp av bildeanalyse programvare (figur 5C). Ikke bare gjorde mange flere metastaser form i kontroll musene, men de var generelt større (figur 5E). Konsekvent ble metastatisk byrde i lungene (totalt metastasering område i mm) også drastisk redusert av YAP/TAZ-knockdown (figur 5D). Det er viktig å merke seg at når metastaser er store og tett sammen, kan programvaren være ute av stand til å differensiere distinkte metastaser. Dette var tilfellet for noen få metastaser i kontroll mus (mus 3 og mus 7). Således, det er en betydelig å sjekk utgangen av bildet analyseprogramvare å sikre det er en korrekt måler arealet av enkelt svulst. Dette er også grunnen til at det er viktig å optimalisere antall celler som injiseres og lengden på eksperimentet. Kollektivt, disse dataene viser at YAP og TAZ er pålagt å opprettholde hastigheten som metastatisk byrde økning i en syngeneic murine modell av metastatisk brystkreft og at dette er på grunn av manglende evne til metastaser å danne og redusert vekst av de få metastaser som gjorde form.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av protokollen. Alle nødvendige virus er først pakket i HEK-293FT celler. De ønskede cellene for studien blir deretter samtidig smittet med luciferase og fluorescerende virus som hver uttrykker en unik pattedyr medikament utvalg genet. Infiserte celler blir deretter utvidet i de aktuelle mediene som inneholder både medikamenter for å velge for stabilt transduced celler uttrykker både luciferase og fluorescerende protein. Uttrykk for begge etikettene bekreftes som beskrevet i protokollen. De merkede cellene blir deretter transduced med et tredje virus som inneholder genetisk manipulasjon (miR30 shRNA) og en tredje unike legemiddel utvalg genet. Etter valg med det tredje stoffet, blir cellene injiseres inn i mus via lateral hale vene. Metastatisk byrde overvåkes i musene gjennom hele eksperimentet med en in vivo Live Animal Imaging system. På slutten av eksperimentet, mus er euthanized, og bilder av hele lungene er tatt ved hjelp av et fluorescerende dissekere mikroskop, og deretter brukes til å måle antall og størrelse på metastaser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: luciferase in vivo Live Animal Imaging viser at RPA3 knockdown reduserer brystkreft metastatisk byrde. (A) skjematisk visning av hvordan cellene ble generert for denne in vivo studien. 4T1 celler var stabilt transduced med en lentivirus koding luciferase og hygromycin motstand. Infiserte celler ble valgt med 600 μg/mL av hygromycin B for en uke og deretter luciferase aktivitet ble målt i foreldrenes eller 4T1-luciferase celler ved hjelp av en luciferase reporter Kit og plate leser (n = 1 eksperiment med replikere brønner gjennomsnitt). 4T1-luciferase celler ble deretter smittet med retrovirus som leverer ZsGreen og miR30 shRNAs målretting enten mCherry (kontroll) eller mRPA3. Puromycin utvalg (2,5 μg/mL) for 3 dager ble brukt til å velge for stabil integrering av viruset. (B-E) 4T1-luciferase celler stabilt uttrykker ZsGreen og kontroll (sh-mCherry) eller mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs ble injisert i mus og avbildet for bioluminesens på de angitte dagene som beskrevet i protokollen. (B &Amp; C) Puerto Mosquito bilder for en representativ mus av hver gruppe på den angitte dagen etter injeksjon (D) tomten av loggen10 forvandlet luciferase signal målt for hver mus i løpet av eksperimentet. (E) scatter plot med gjennomsnittlig (fast linje) for bakkene av hver mus i D (n = 6 for sh-kontroll og 8 for sh-mRPA3-431). Statistisk betydning ble testet ved hjelp av en student t test; * p ≤ 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisering av fluorescerende metastaser avslører at RPA3 knockdown hindrer metastatisk kolonisering og påfølgende vekst av brystkreftceller. (A) fluorescerende (venstre) og brightfield (høyre) bilder av representative fliker fra hver mus injisert i figur 2 21 dager etter injeksjon. Stjerner (*) indikert grønn autofluorescent bronkiene. (C-E) Bildeanalyse programvare (se tabell over materialer) ble brukt til å identifisere og måle objekter ved hjelp av en intensitet terskel på 25 til 100 og en størrelse terskel på 0,01 mm2 til uendelig. (B &Amp; C) Scatter plot med Mean (solid bar) av det totale antall metastaser i lungene av hver mus når telles (B) av bildeanalyse programvare (C). (D) totalt areal (mm) av lunge som ble målt med bildeanalyse programvare er plottet som metastatisk byrde med Mean indikert av en solid bar. (E) størrelsen på hver metastasering er plottet for hver mus. Kontroll mus indikeres av de blå prikkene og mRPA3 knockdown mus med de røde prikkene. Note, skalaen stang er adskilt for 1 mm å lage den lettere å visualisere nummeret og antallet av liten metastaser (n = 6 sh-administrere, 8 sh-mRPA3-431). Statistisk betydning ble testet ved hjelp av en student t test; p = 0,06; * * p ≤ 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: YAP/Taz knockdown reduserer brystkreft metastatisk byrde. (A & B) 4T1 celler stabilt uttrykker miR30-basert kontroll (mCherry) eller tandem YAP/Taz shRNAs (sh-mYAP1/mTAZ6) ble analysert av Western Blot analyse (A) eller transfekterte med en YAP/Taz-ettverk luciferase reporter konstruere og analyseres for YAP/Taz-ettverk transcriptional aktivitet som beskrevet tidligere15,16 (B) (n = 5 for kontroll og 4 for YAP1/TAZ6). (C) skjematisk visning av hvordan cellene ble generert for in vivo studien. 4T1-luciferase celler ble smittet med retroviruses som leverer ZsGreen og enten en miR30 shRNA målretting mCherry (kontroll) eller tandem miR30 shRNAs målretting både mYAP og mTAZ. Infiserte celler ble valgt i Puromycin (2,5 μg/mL) i 3 dager. 4T1-luciferase celler stabilt uttrykker ZsGreen og kontroll (sh-mCherry) eller YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) shRNAs ble deretter injisert i mus og avbildet for bioluminesens av på injisert dager. (D &Amp; E) Puerto Mosquito bilder for en representativ mus av hver gruppe på den angitte dagen etter injeksjonen. (F) handlingen i loggen10 forvandlet luciferase signal målt for hver mus i løpet av eksperimentet. (G) scatter plot med Mean (solid bar) for bakkene i hver mus i F (n = 7 for sh-kontroll og 8 for sh-mRPA3-431). Gjennomsnittet indikeres av en heltrukket linje. Statistisk betydning ble testet ved hjelp av en student t test; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: YAP og Taz er nødvendig for metastatisk brystkreftceller å kolonisere lungene. (A) fluorescerende (venstre) og brightfield (høyre) bilder av representative fliker fra hver mus injisert i Figur 4 21 dager etter injeksjon. (C-E) Bildene ble behandlet med bildeanalyse programvare som beskrevet i Figur 3. (B &Amp; C) Scatter plot med Mean (solid bar) av det totale antall metastaser i lungene av hver mus når telles manuelt (B) eller ved bildeanalyse programvare (C). (D) det totale arealet av alle metastaser (mm) ble målt med bildeanalyse programvare og plottet som metastatisk byrde med Mean (solid bar). (E) størrelsen på hver metastasering er plottet for hver mus. Kontroll mus indikeres av de blå prikkene og sh-mYAP1/mTAZ6 knockdown mus med de røde prikkene. Note, skalaen stang er adskilt for 1 mm å bedre visualisere nummeret og antallet av liten metastaser (n = 7 sh-administrere, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Gjennomsnittet indikeres av en heltrukket linje. Statistisk betydning ble testet ved hjelp av en student t test; * p ≤ 0,05, * *, p ≤ 0,01; **. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: tabell over vektorer. Alle vektorer som brukes er oppført og nye vektorer er beskrevet. Standard molekylærbiologi teknikker ble brukt til å klone nye vektorer og sekvenser for nylig beskrevet 97-mer shRNA er inkludert. Sitater referer til: [1]53, [2]16, [3]54Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: eksempel på in vivo levende dyr Imaging databehandling og analyse. Regneark som demonstrerer hvordan rådata fra in vivo levende dyr bilder konverteres for analyse som beskrevet i trinn 6,7 og 6,8. Rådata ervervet fra in vivo levende dyr Imaging forvandlet ved hjelp av en logg10 transformasjon. Frekvensen av endring i metastatisk byrde beregnes for hver mus ved å beregne skråningen generert av loggen10 transformert data. Eksempler inkluderer luciferase analyse fra figur 2. Kolonnene er fargekodet for å indikere hvilke data som ble brukt til å generere hver stignings verdi, og formlene er imbedded i regnearket. Dobbeltklikk på brønnen vil avdekke formelen som brukes til å behandle dataene. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i metoden
Det er viktig å optimalisere antall celler injisert (trinn 3) for en gitt cellelinje og mus belastning da dette kan i stor grad påvirke antall metastaser som form og lengden på eksperimentet. Hvis for mange celler injiseres eller metastaser vokse for lenge, kan metastaser være vanskelig å telle gjør virkningene av genetisk manipulasjon vanskelig å vurdere. Men hvis for få celler injiseres, få eller ingen metastaser kan danne. Dermed bør et foreløpig eksperiment gjøres ved hjelp av ulike antall celler for å bestemme det optimale antallet og hvor lenge metastaser vokser. For å sikre konsekvent antall metastaser i en gruppe, er det viktig å injisere like mange levedyktige celler i hver mus. Siden celler kan bosette seg i både rør og sprøyte, bør cellene være forsiktig resuspendert før lasting av sprøyten, og celle suspensjoner bør ikke stå i sprøyten for lenge (trinn 4.3.2). Celle levedyktighet synker jo lenger cellene er i suspensjon, slik at mengden av tid mellom trypsinization og injeksjon av cellene bør ikke være mer enn en time (trinn 4.2.5). Luftbobler og store klumper av celler bør ikke injiseres siden disse kan forårsake lungeemboli som dreper musen. I tillegg kan tegne celler opp gjennom nålen skjære dem, slik at sprøyten skal være lastet uten nålen. For å bekrefte at et relativt likt antall celler ble injisert, kan in vivo levende Dyrebilder tas kort tid etter injeksjonen (figur 2B, Figur 4D).

Nøyaktig og konsistent kvantifisering av Puerto Mosquito signalet er viktig og avhengig av cellene som tar opp og metabolizing D-luciferin. Dette kan være påvirket av mange variabler inkludert, dosen av D-luciferin, timing av injeksjon, mus kroppstemperatur, hvordan anesthetized musen er når injisert, og hvordan en mus er plassert i anestesi kammeret før Imaging. Derfor er det viktig å holde disse trinnene konsekvente for alle mus og bildebehandlings økter. Vi brukte en oppvarming pad for å opprettholde konsekvent musen kroppstemperatur mens i anestesi kammeret. Siden signalet må trenge gjennom vevet for både Puerto Mosquito og fluorescerende deteksjon, er det også viktig å holde musen posisjon konsekvent for hvert bilde (flatt på ryggen fungerer best for bildebehandling av lungene). Kvantifisering av fluorescerende bilder fra in vivo levende dyr Imaging bør alltid gjøres ved hjelp av effektivitet% enheter som dette gir riktig sammenligning mellom bilder. Likeledes, total Flux (fotoner/sekund) bør alltid brukes når kvantifisere Puerto Mosquito bilder. For analyse av metastatisk byrde konverterer loggen10 transformasjon veksten kurve (før maksimalt signal er nådd) til en lineær plot, som var nødvendig for stigningstallet analyse.

Modifikasjoner, og feilsøking av metoden
I den presenterte protokollen en befolkning av celler er først stabilt transduced med et fluorescerende protein og luciferase, så at befolkningen er transduced med enten en kontroll vektor eller en vektor rettet mot genet av interesse. Dette sikrer at begge celle populasjoner har lignende fluorescerende proteiner og luciferase uttrykk. Men som et alternativ, viral vektorer som samtidig leverer to av disse komponentene kan utnyttes. Faktisk, i den representative eksperimenter vi brukte ZsGreen uttrykke retroviral vektorer å uttrykke shRNAs i 4T1-luciferase celler. Det anbefales at uttrykket av luciferase og fluorescerende protein analyseres i alle celle grupper etter at genet av interesse er endret. Ulike uttrykks nivåer mellom grupper kan komplisere tolkningen av dataene, så det er best om de ulike gruppene har lignende uttrykk for både det fluorescerende proteinet og luciferase. I tillegg kan røde blodlegemer være autofluorescent og kan gjøre det vanskelig å visualisere fluorescerende metastaser i lungene. Hvis dette er tilfelle, røde blodlegemer kan fjernes fra lungene ved PBS blod under døds aktiv å redusere autofluorescent bakgrunn (passende døds regler teknikker og retningslinjer bør følges). Selv om forskjellene mellom kontroll-og knockdown gruppene i våre representative eksperimenter er dramatiske, er variasjoner i mus-til-mus-variasjonen som ofte finnes i in vivo metastasering-analyser, tydelig i kontroll musene (Figur 3b og figur 5b). Når denne variasjonen er høy, kan det gjøre det vanskelig å bestemme omfanget av knockdown effekt. En alternativ tilnærming som kan brukes til å redusere denne variasjonen er å merke kontroll celler og knockdown celler med distinkte fluorescerende proteiner og distinkte luciferase enzymer og deretter blande de to populasjoner i like tall og injisere blandingen. For eksempel kontroll celler stabilt uttrykker tomat og renilla luciferase kan blandes med knockdown celler uttrykker ZsGreen og Firefly luciferase. In vivo Live Animal Imaging-enheter kan skille renilla luciferase fra Firefly luciferase, og tomat fra ZsGreen, så enten fluorescens eller luminescence kan brukes til selvstendig kvantifisere hver celle befolkning. Faktisk, dobbelt luciferase tenkelig av 4T1 celler voksing idet primære svulst inne bo dyrene er blitt bevist benytter en inne vivo bo dyr tenkelig apparat4. Det er imidlertid viktig å merke seg at det kan være overlapping i fluorescerende signal, og dermed en Spectral unmixing trinn (se produsentens retningslinjer) bør inkluderes i denne tilnærmingen. I tillegg bør renilla luciferase og Firefly luciferase bli avbildet separat med en tilstrekkelig tidsforsinkelse som gjør det mulig for den første luciferase signal å ikke lenger være synlig før Imaging den andre. Bruk av distinkte fluorophores gjør fortsatt antallet og størrelsen på metastasering i lungene som skal kvantifisert16. Å teste metastatisk kolonisering og vekst i andre organer i tillegg til lungene denne protokollen kan endres og brukes for intrakardielle og Portal vene injeksjoner9,10.

Begrensninger for metoden
Bruke en in vivo Live dyr Imaging enhet til å tilegne seg sanntid metastatisk byrde i forbindelse med fluorescensmerkete merket kreftceller gir en kraftig metode for å analysen metastatisk kolonisering og påfølgende vekst; Det er imidlertid begrensninger i denne tilnærmingen. Noen gener kan være nødvendig for medfødte celle spredning snarere enn spesifikke roller i metastasering. Analyser av celle spredning i vitro kan gjøres før in vivo-eksperimentet for å avgjøre om genet forstyrrer in vitro-veksten. Når tenkelig en bo dyr, det Puerto Mosquito eller fluorescerende signal fra metastaser må være kraftig nok å admission card igjennom vevet. I tillegg påvirker de optiske egenskapene (dvs. absorpsjon og spredning) av vevet også påvisning55. Den eksitasjon lyskilde må kunne passere gjennom vev for å opphisse fluorescensmerkete merket kreftceller og bioluminesens har et større dynamisk område enn fluorescens. Således, til tross for fluorescens kan brukes for bo dyr tenkelig, bioluminesens er foretrakk for oppdager signal inne indre organ. I tillegg kan noen immunkompetente mus stammer avvise celler som uttrykker fluorescerende proteiner. Faktisk fant vi at celler som uttrykker tomat, GFP, eller mCherry ble avvist eller ned regulert fluoroforen når vokser i BALB/c mus (data ikke vist og15). Men, som vist her (Figur 3 og figur 5) og tidligere15,16, ZsGreen-merkede celler er synlig i disse musene. I tilfeller der fluorescerende protein uttrykket blir undetectable, en annen måte å kvantifisere den relative metastatisk kolonisering er å bruke qPCR å kvantifisere enten fluorescerende genet eller et annet gen i den integrerte viral vektor15. Selv om en in vivo Live Animal Imaging-enhet lar deg oppdage endringer i metastatisk byrde, det tillater ikke en å avgjøre om disse endringene skyldes endret størrelse eller antall metastaser. Det gir heller ikke romlig informasjon om plasseringen av metastaser. Videre kan styrken på signalet påvirkes av hvor dypt i vevet det er.

Betydningen av metoden og potensielle fremtidige søknader
Det er mange måter som denne tilnærmingen kan endres for å få mer eller annen informasjon. En rekke kreftcelle linjer inkludert menneskelig kreftcelle linjer eller pasient avledet xenotransplantater kan brukes i denne analysen. Andre musemodeller kan også brukes, inkludert transgene-eller knockout-mus for å teste hvordan målrettings proteiner som lages av stromal celler, påvirker metastatisk kolonisering og vekst av de innsatte kreftcellene. Hvis det er flere kandidat gener som skal testes, kan denne tilnærmingen bli multiplekset fordi in vivo Live Animal Imaging enheter kan oppdage og skille et bredt spekter av fluorophores. Dette vil redusere antall mus som kreves og øke antall mål som kan testes. In vivo levende dyr Imaging kan også kombineres med røntgen eller CT9 Imaging å gi en god del mer romlig informasjon om plasseringen av metastaser. Endelig, denne tilnærmingen kan endres til analysen mer spesifikke skritt innenfor metastatisk kolonisering Cascade. For eksempel, trinnene involvert i tumor celle seeding (intravaskulær overlevelse, Ekstravasasjon, og post Ekstravasasjon overlevelse) kan skilles ved kvantifisere antall tumorceller i lungene på flere tidspunkt i løpet av de første 3 dagene etter injeksjon (som gjort her16). I dette tilfellet kan lungene også være farget med vaskulær markører og avbildet ex vivo å bestemme prosentandelen av kreftceller som har extravasated på hver gang punkt56,57.

Oppsummert, bruk av sanntids in vivo Live dyr Imaging av fluorescerende og selvlysende kreftceller etter halen vene injeksjon muliggjør en mer detaljert analyse av hvordan en kandidat genet eller gener påvirker metastatisk kolonisering og påfølgende vekst. Denne tilnærmingen er raskere og rimeligere enn autochtonous musemodeller og unngår noen av de begrensninger av spontane metastasering modeller. Bruk av både fluorescens og luminescence som et middel for å oppdage og kvantifisere metastaser gir forskere uavhengige readouts som forbedrer tilliten til resultatene og gir fleksibilitet i den eksperimentelle designen. Bruken av fluorescens for å kvantifisere metastasering størrelse og antall unngår behovet for tidkrevende og potensielt kostbare histologiske prosessering og analyse, og gir mulighet for ytterligere bruk av hele vev. Protokollen kan brukes med en rekke ulike teknikker for å manipulere uttrykk eller funksjon av kandidat genet, for eksempel RNAi, transgene uttrykk eller CRISPR/CAS-mediert redigering, og kan også brukes til å teste små molekyler, funksjon blokkerer antistoffer, eller andre potensielle terapeutiske forbindelser. Som nevnt ovenfor, kan flere enkle modifikasjoner gjøres for å forbedre analysen og gi ytterligere informasjon. Denne tilnærmingen er en ideell måte å identifisere og teste Pro-metastatisk gener som har terapeutisk potensial for behandling av kreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Emily Norton for å bistå med virusinfeksjoner og kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også Ryan Kanai for hjelp med å anskaffe bilder av lungene og Kate E. Tubbesing for hjelp med bildeanalyse av den grønne metastaser i lungene. Vi takker dyret forskning anlegget ansatte for deres støtte og for å få hjelp i utarbeidelsen av denne videoen. Dette arbeidet ble støttet av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tildeles J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15, (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294, (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10, (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28, (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52, (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41, (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10, (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6, (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30, (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36, (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36, (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134, (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34, (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33, (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8, (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496, (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36, (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35, (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34, (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9, (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26, (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19, (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6, (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19, (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129, (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8, (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35, (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13, (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10, (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76, (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20, (5), 576-590 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics