פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Clostridioides קושי זיהום (cdi) נחשב לאחד מזיהומים במערכת העיכול הנפוצים ביותר הקשורים לבריאות בארצות הברית. התגובה החיסונית מולדת נגד הקושי המתואר כבר תוארה, אבל התפקידים המדויקים של נויטרופילים ו מקרופאגים ב-cdi הם פחות מובנים. במחקר הנוכחי, הזחלים danio rerio (zebrafish) משמשים כדי להקים C. בקושי מודל זיהום לדימות התנהגות ושיתוף פעולה של תאים אלה מולדים החיסונית ב vivo. כדי לפקח על C. הקושי, פרוטוקול תיוג באמצעות צבע פלורסנט הוקמה. זיהום המותאם לשפות אחרות מושגת על ידי מיקרוהזרקת מתויג C. הקשיים, אשר באופן פעיל גדל במערכת העיכול דג זברה ומחקה את הנזק האפיתל המעי cdi. עם זאת, פרוטוקול זה זיהום ישיר הוא פולשני וגורם פצעים מיקרוסקופיים, אשר יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוני. מכאן, פרוטוקול microgavage שאינו פולשני יותר מתואר כאן. השיטה כרוכה במסירה של C. הקושי תאים ישירות לתוך המעיים של הזחלים דג זברה ידי צנרור דרך הפה הפתוח. זו שיטת הדלקת מחקה היטב את תוואי זיהום טבעי של C. הקושי.

Introduction

ג. הקושי הוא גרם-חיובי, נבג-יוצר, אנאירובי, ו-הרעלן מייצר באקלוס כי הוא הגורם המוביל של זיהומים חמורים במערכת העיכול1. תסמינים טיפוסיים של cdi כוללים שלשול, כאבי בטן, קוליטיס הפסבדו מכרעת, וזה יכול לפעמים להוביל למוות1,2. ראיות הראו כי מארח התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי הן התקדמות ותוצאה של מחלה זו3. בנוסף לתגובה החיסונית, מיקרוביוטה הבטן הילידית היא חיונית לתחילתה ופתוגנזה של CDI4. בעשור האחרון, הן מספר המקרים ואת שיעור התמותה של cdi גדלו באופן משמעותי בשל הופעתה של זן היפרשני של C. הקושי (BI/NAP1/027)5,6. הבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון הבסיסיים ואת התפקיד של microbiota במהלך CDI יסייע להוביל התפתחויות טיפוליות חדשות והתקדמות, המאפשר שליטה טובה יותר של מגיפה זו.

כמה מודלים בעלי חיים, כגון אוגר ועכבר, פותחו כדי לספק תובנה ההגנה החיסונית נגד C. הקושי7,8. עם זאת, התפקיד של תאים חיסוניים מולדים עדיין מובנת בצורה גרועה, במיוחד מאז התנהגות מולדת התא החיסונית נגזרת בעיקר מניתוח היסטולוגית או מתאים בתרבית מבחנה. לכן, הקמת מודל שקוף דג זברה כדי לחשוף את התגובה החיסונית מולדת C. הקושי בתוך האורגניזם בעלי חוליות חיים יקל על מחקרים כאלה. הזחלים zebrafish יש מערכת חיסונית תפקודית מולדת, אבל הם חסרים את המערכת החיסונית אדפטיבית עד 4 – 6 שבועות לאחר הפריה9. תכונה ייחודית זו עושה הזחלים דג זברה מודל מעולה ללמוד את התגובה המבודדת ותפקוד של תאים חיסוניים מולדים ב-cdi.

דו ח זה מתאר שיטות חדשות באמצעות הזחלים דג זברה ללמוד את האינטראקציות בין C. הקושי ואת התאים החיסוניים הטבועה, כגון מקרופאגים ו נויטרופילים. תחילה, מוצג פרוטוקול מיקרוהזרקת מקומי הכולל C. הקשיים וההכתמים. שימוש vivo קונפוקלית וקד זמן לשגות הדמיה, התגובה של נויטרופילים ו מקרופאגים לקראת האתר זיהום מוקלט, ואת phagocyציטוזה של חיידקים על ידי נויטרופילים מקרופאגים הוא נצפתה. עם זאת, דווח כי ההזרקה עצמה גורמת נזק לרקמות מוביל גיוס של לוקיציטים עצמאית של חיידקים10. לכן, פרוטוקול microgavage לא פולשני לספק C. הקושי לתוך המעיים של הזחלים דג זברה מתואר לאחר מכן. מחקרים קודמים הוכיחו כי מיקרוביוטה מערכת העיכול הילידים להגן על מארח נגד הקולוניזציה של C. הקושי11. לכן, הזחלים גנוטוביוטיים משמשים גם כדי להיפטר הדגים הנגועים 12. לאחר מכן, ניתוח מעיים מבוצע כדי לשחזר את קיימא C. הקושי ולאמת את משך הנוכחות שלהם בתוך מעיים של דגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים המתואר כאן בוצעה בהתאם לתקנות משפטיות (EU-הוראה 2010/63, רישיון AZ 325.1.53/56.1-אמבטיות ורישיון AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. הכנת ההיתוך נמוך, צלחת ג'ל, ו מיקרוהזרקה/Microgavage מחטים

  1. התמוססות 0.08 גרם של התכה נמוכה (טבלת חומרים, Agarose A2576) ב-10 mL של 30% בינוני של Danieau (0.12 Mm MgSO4, 0.18 mM Ca [לא3]2), 0.21 מ"מ Kcl, 1.5 mm hepes (pH = 7.2), ו-17.4 מילימטר הנאקל, מאוחסן בטמפרטורת החדר (RT) כדי לקבל את הפתרון של 0.8%.
    הערה: ניתן להשתמש בריכוזים גבוהים או נמוכים יותר של agarose. עם זאת, הזמן הנדרש לגבש משתנה למותגים שונים של הצמח, אפילו באותו ריכוז.
  2. הכנת מחטי מיקרו וmicrogavage מנימי זכוכית (טבלת חומרים).
    1. השתמש בפולר מיקרופיפטה עם ההגדרות הבאות (שים לב שיחידות מסוימות הן ספציפיות לפולר המשמשות כאן; ראה טבלת חומרים): מחטימיקרוהזרקה (לחץ אוויר = 500; חום = 400; משוך = 125; מהירות = 75; זמן = 150); ומחטים microgavage (לחץ אוויר = 500; חום = 400; למשוך = 100; מהירות = 75; זמן = 150). השתמש בטיפ מיקרו מטעין כדי לטעון 3 μL של nuclease-H חינם2O לתוך המחט משכה.
    2. הציגו את המחט לתוך המזרק והדקו אותו כראוי. כוונן את המחט לזווית מתאימה להזרקה. הגדר את הלחץ ההזרקה בין 600 – 900 hPa עבור מחט microinjection ו 200 – 300 hPa עבור מחט gavage.
    3. הניחו טיפת שמן מינרלי על העיגול השחור של שקופית הכיול. השתמש מלקחיים עדין כדי לחתוך את קצה המחט. הכנס טיפה אחת לשמן המינרלים כדי למדוד את גודל ה-droplet.
    4. להזרקה, כוונן את זמן ההזרקה כדי לקבל droplet בקוטר של 0.10 – 0.12 mm, השווה לנפח של 0.5 – 1.0 nL. לmicrogavage, לקבל droplet עם קוטר של 0.18 – 0.20 מ"מ, השווה לנפח של 3 – 5 nL.
  3. הכינו לוחית של 1.5% עם הצמח (לוח חומרים, 8050) בצלחת בגודל 10 ס מ בתוך 30% בינונית של Danieau באמצעות תבנית פלסטיק כמו עובש microgavage. החנות ב-4 ° צ' כדי למנוע התייבשות עד הצורך. חם עד RT או 28 ° צ' לפני הניסוי.

2. הכנה ותיוג של C. הקושי והנבגים עם צבען פלורסנט

  1. הכינו פתרון מניות בעובי 1 מ"מ מצבע פלורסנט (טבלת חומרים). מכיוון שהצבע נמכר ב-50 μg של אבקה, הוסף 69 μL של DMSO לבקבוקון כדי לקבל ריכוז מניות של 1 מ"מ.
  2. הכן 100 μM פתרון עבודה של צבע פלורסנט על ידי הוספת 2 μL של פתרון מניות 1 מ"מ עד 18 μL של DMSO בשפופרת צנטריפוגה, ומערבבים היטב.
  3. תרבות ג. הקושי (R20291, הריבוטיפ 027 המתח) על ידי הענבה 10 מ ל של bhis מדיום נוזלי עם שניים עד שלוש מושבות מצלחת בשכונה אנאירובית בלי לרעוד בן לילה. BHIS הוא BHIS בתוספת עם 0.5% (w/v) תמצית שמרים ו 0.1% (w/v) L-cysteine. לפזר 1 גר' L-cysteine ב 10 מ ל של ddh2O ו לחטא על ידי סינון, ולאחר מכן להוסיף את המדיום בלוק כדי לקבל ריכוז סופי של 1 g/l. צלחות מוכנות על ידי הוספת 15 g/l אגר-אגר למדיום לפני בלוק ינג. כרומטוגרפיה סלקטיבית של הקושי מתבצעת באמצעות chromid C. לוחות הקושי (טבלת חומרים).
  4. צביעת C. קושי עם צבע פלורסנט
    1. קציר C. הקושי ב- OD600 של 1.0 – 1.2 ולשטוף 1X עם 1 מ ל של 1x PBS (5,000 x g עבור 3 דקות ב-RT). השהה בתוך 1 mL של 1 x PBS.
    2. הוסף 3 μL של פתרון עבודה של צבע פלורסנט ל 1 מ ל של חיידקים ההשעיה. מודטה את המדגם עבור 15 דקות ב RT בחושך. לשטוף את המוכתמת C. הקושי פעם עם 1 mL pbs להסיר את הצבע שיורית ולהשעות מחדש ב-1X PBS כדי OD600 של 1.0 (1.0 OD600 הוא שווה ערך ל 108 cfu/mL).

3. הזרקה של ויטראז ' הקושי לתוך הזחלים Zebrafish

  1. במקום 20 – 30 הזחלים דג זברה ב 5 ימים לאחר הפריה (המכונה כאן 5 dpf) עם 0.02% – 0.04% tricaine (אבקת tricaine מומס מים כפולים מזוקקים מותאמים ל-pH = 7 עם 1 M טריס-HCL פתרון) ב 30% המדיום של danieaus ~ 10 דקות לפני זרקת. להעביר את הזחלים המורדם לצלחת. טרייה בגודל 10 ס מ ולהסיר את כל העודף של 30% המדיום של Danieau.
  2. מניחים טיפה של 0.8% התכה נמוך ההיתוך על הזחלים דג זברה לכסות. כוונן בעדינות את הזחלים לתנוחת לרוחב. מניחים את צלחת פטרי על הקרח במשך 30 – 60 כדי לאפשר את המסת ההיתוך נמוך לגבש. הוסף 30% המדיום של Danieau המכיל 0.02% – 0.04% tricaine כדי לכסות את הצמח.
  3. הכן את פתרון ההזרקה. הוסף 1 μL של 0.5% פנול אדום בפתרון PBS ל 9 μL של הצבע מוכתם C. הקושי להמחיש את תהליך ההזרקה.
  4. טענו מחט מיקרוכובית עם פתרון ההזרקה בעזרת מיקרוטוען. הר את המחט הטעונה על מיקרומניפולציה ולמקם אותו תחת stereomicroscope.
  5. כוונן את הלחץ ההזרקה בין 600 – 900 hPa. הגדר את זמן ההזרקה 0.1 – 0.3 s כדי להשיג 0.5 – 1.0 nL. הגדר את המחט במיקרומניפולציה בזווית של ~ 45 ° הצבעה לעבר הזחלים המוטבעים.
  6. מניחים את קצה המחט מעל מערכת העיכול קרוב הנקבובית אורואיברי. פירס דרך agarose ואז את השריר עם קצה המחט, לאחר מכן להכניס אותו לתוך לומן המעיים ולהזריק 0.5 – 1.0 nL של C. הקושי. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לפקח על הזחלים מוזרק להרים את הזחלים מוזרק כראוי לדימות קונפוקלית וקד.

4. דור הזחלים של גנוטוביוטיקה

  1. השתמש בשיטת הרבייה הטבעית כדי ליצור עוברי הגנוטוביוטיקה, כולל: בהפריה חוץ גופית, כביסה עם אנטיביוטי המכיל בינוני (1 μg/mL אמפוריטיצין B, 10 μg/mL kanamycin, ו 20 μg/mL אמפיצילין), כביסה עם 0.1% wt/vol פוליוויניל פירודור-יוד (PVP-I) פתרון, ו דגירה של העוברים בשכונה תרבות תא12.
  2. השאר את כל הזחלים של דגי הגנוטוביוטיקה תחת תנאים גנוביוטיים עד 5 dpf או ממש לפני gavage. לאחר הgavage, הזחלים של הזברפיש יועברו לאינקובטור רגיל, אבל עם מדיום של 30% המדיום של Danieau.

5. הGavage של הזחלים של הדגים

  1. כיול את המחט הmicrogavage כמתואר בשלב 1.2.
  2. מדדו את קוטר קצה המחט על ידי הצבת המחט על שקופית כיול עם טיפה אחת של שמן מינרלי. ודא שהקצה הוא 30-40 יקרומטר בקוטר, בוטה וחלק. התעלם ממחטים חדים או מחוספסים.
    הערה: ניתן להיפטר מקצוות חדים של מחטים על ידי בוער מהיר.
  3. הכינו את הפתרון הgavage כמתואר בשלב 3.3.
  4. לטעון ולטעון את המחט על מיקרומניפולציה כפי שמתואר בשלב 3.4. כוונן את המיקרומניפולציה כדי למקם את המחט בזווית 45 °.
  5. . מכונה בשלב 3.1 כאשר הזחלים להפסיק לזוז, להעביר אותם לחריץ של עובש microgavage באמצעות פיפטה פסטר.
  6. מניחים טיפה של 0.8% התכה נמוך ההיתוך על הזחלים דג זברה לכסות. להתאים בעדינות את הזחלים עם ראשים מול זקוף בזוויות 45 ° בחריץ וזנבות נגד הקיר של החריץ. ודא כי זוויות של ראשי הם בערך זהה, כך שהם מיושרים עם זווית של מחטים gavage. מניחים את העובש הmicrogavage על הקרח במשך 30-60, ומאפשרים לחזק את ההיתוך הנמוך כדי לייצב את עמדות הזחלים.
  7. כוונן את לחץ ההזרקה בין 200-300 hPa. הגדר את זמן ההזרקה 0.1 – 0.3 s כדי לקבל נפח הזרקה של 3 – 5 nL של C. הקושי.
  8. בעדינות להפעיל את המחט דרך העלה ואז לתוך הפה של הזחלים של הדגים, דרך הוושט. לאחר קצה המחט הוא בתוך הנורה המעי הקדמי, לחץ על דוושת ההזרקה כדי לשחרר את החיידקים. למלא את לומן המעי עם הכרך נמסר. אל תתנו לו לגלוש מן הוושט או cloaca. משוך בעדינות את המחט מתוך הפה של דג הצראדון.
  9. לאחר gavage, להציל את הזחלים הנגועים דג זברה מן הצמח עם טיפ מיקרוטוען גמיש על ידי לחתוך תחילה את agarose משם על ידי הסרת הזחלים. להעביר את הזחלים האלה לתוך סטרילי 30% המדיום של Danieau. שטפו את הזחלים במדיום סטרילי פעמיים. מעבירים את הזחלים. לצלחת פטרי טרייה בגודל 10 ס מ הזחלים יישמרו עד 11 דpf.

6. ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של הזחלים מוזרקים

  1. הזחלים מורדם. התייחסו לשלב 3.1 הפוך חור בתחתית צלחת פטרי 35 מ"מ עם מגלשת זכוכית המצורפת לחור, המכונה תא הדמיה. העבר עוברים לתחתית חדר ההדמיה עם כמות מספקת של 30% מדיום Danieau של.
  2. הוסף 200 – 300 μL של 1% ההיתוך נמוך התכה לכסות את הזחלים מורדם. כיוון שנעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך, הניחו את האזור הנגוע של הזחלים על שקופית הזכוכית באופן הדוק ככל האפשר.
  3. תנו לאגבה לעבור בקרח במשך 30-שישים. לטבול את הצמח עם 30% Danieau של המכיל 0.02% – 0.04% tricaine.
  4. תמונה של הזחלים עם מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (טבלת חומרים).

7. חיתוך של זחל Zebrafish המעיים כדי לשחזר את קיימא C. הקושי

  1. לבודד את מערכת העיכול מפני הזחלים לנתח עומס חיידקי. . עם 0.4% טריקיין
  2. שטוף את הדגים בקצרה עם הPBS 1x סטרילי ולהעביר אותם לוחית agarose טרייה.
  3. חיתוך דגי הזברה
    1. הכניסו מחט לתוך תא המטען של הזחלים של הדגים קרוב לראש כדי לשתק את הדג. . הסירו את הראש מאחורי הזימים
    2. הכניסו את המחט השנייה. לאמצע תא המטען הכנס את המחט השלישית לתוך הבטן של דג דג זברה למשוך את המעיים מתוך חלל הגוף.
      הערה: יש צורך בטיפול קיצוני כדי לבודד את המעי השלם. אם קשה לעשות זאת, בצע משיכה נוספת כדי להפריד את שאר המעי מן האיברים הפנימיים הנותרים.
    3. השתמש במחט מיקרוהזרקה כדי להעביר 10 – 15 מעיים לתוך צינור 1.5 mL המכיל 200 μL סטרילי של 1x PBS.
    4. המגון לסדר את המעיים עם הסחוס כדי לשבש את הרקמה ולהכין הומוטים. ודא שהפסל מגיע לתחתית הצינור כדי לשבש את כל המעיים לחלוטין.
  4. מודלת את המגון ב C. הקושי גידול בינוני המכיל D-ציקלוסרין ו-cefoxitin, עם או בלי טאורוכולאט (tca, נבטי של C. הנבגים בעלי קושי) בחדר אנאירובי.
  5. מודטה את הצלחת anaerobically עבור 48 h ב 37 ° c.
  6. השתמש בתרבות החיידקית. למשך 16 ס מ
    1. להשעות את המושבה ב-50 μL של H2O ולהרתיח אותו ב 95 ° c עבור 15 דקות. גלולה פסולת lysed על ידי צנטריפוגה (14,000 rpm עבור 2 דקות ב RT) ולהשתמש 2 μl של supernatant כתבנית ב 25 μl של התגובה האנטי-PCR באמצעות C. הקושיהסגולי-ספציפי (Cdiff16Sfw: 5 ' GTG AGC הקאג TAC agc 3 '; Cdiff16Srev: 5 ' טה AGG אגה TGT חתול TGT 3 ').
    2. כאשר חיידקים מן התרבות הנוזלית משמשים, הקציר 1 מ ל של התרבות ולשטוף פעם אחת עם 1 מ ל של PBS (14,000 rpm עבור 2 דקות ב RT). השהה מחדש את הגלולה ב 100 μL של H2Odd ולטפל כפי שנעשה לעיל. כדי לאפיין עוד יותר מושבות חיידקיים, פס על BHIS-או כרומאיד-צלחת (טבלת חומרים).

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ג. הקושי הוא אנאירובית לחלוטין, אבל כרומופור של חלבונים פלורסנט בדרך כלל דורש חמצן להבשיל. כדי להתגבר על בעיה זו, צבע פלורסנט שימש כדי להכתים לחיות C. הקשיים תאים שהיו באופן פעיל גדל (R20291, הריבוסוג 027 זן; איור 1א). באמצעות מערכת Gal4/UAS, שורות הטרנסגניים יציבה שנוצרו עבור הדמיה חיה, שבו mpeg 1.1 או lyz היזמים הסיע את הביטוי של חלבון פלורסנט egfp ב מקרופאגים ו נויטרופילים (בהתאמה) באופן תלוי Gal4.

המוכתם C. הקושי הוזרק לתוך מערכת המעיים של דג בגובה 5 dpf, ואת האתרים הנגועים הודבקו לאחר 1 h של דגירה. זמן מעידה הדמיה הראו כי הן נויטרופילים ו מקרופאגים הגיעו לאתרי זיהום (איור 1B), ואת מספר שני תאים חיסוניים מולדים גדל עד C. הקושי היה נקי. הניקוי התרחש על ידי phagocyציטוזה והעיכול של c. הקושי שכותרתו. איור 1C מראה כי מופעל מקרופאג phagocytosis שני C. הקושי בקטריה (ראה סרט משלים 1).

Figure 1
איור 1: כתמים וזיהום של C. הקושי ב-zebrafish. (A) מתויגבחיידקים C. בקטריה מזוהם בתוך מיקרו דגים נגועים. סרגל בקנה מידה = 5 μm. (ב) confocal יקוד Z-הקרנת מחסנית המציגה הפלורסנט הירוק נויטרופילים בתוך הטרנסגניים כפולה Tg (Lyz: KalTA4)Bz17/tg (4xuas-E1b: egfp)hzm3 שנצבר ב C. הקושי באתר זיהום ב 2 h לאחר ההדבקה (hpi). נויטרופילים מוצגים בירוק ו -C. הקושי באדום. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ג) הדמיה מוקד זמן מראה הצגת מקרופאגים בעלי המסומנת gfp מתויג phagocytosing אדום ויטראז ' C. הקושי. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

למרות מיקרוהזרקה היא השיטה הנפוצה ביותר כדי להדביק הזחלים דג זברה עם פתוגנים, שיטה זו גורמת תמיד נזק לרקמות, אשר יכול להשפיע על תוצאות ניסיוני. כדי למנוע בעיה זו, microgavage שימש כדי לספק בעלי התווית הקרינה C. הקושי לתוך לומן המעיים של שורות הכתב המקרופאג ו נויטרופילים ב 5 dpf, אשר מחקה את הנתיב הטבעי של Cdi (איור 2א). עם זאת, נויטרופילים ו מקרופאגים לא הראו הגירה ברורה למערכת העיכול עד 12 שעות לאחר microgavage (איור 2B). בינתיים, הזריחה של ה -C. הקושי שכותרתו נעלם לאחר כ 5 h post-microgavage, כנראה בשל ההרס האנזימטי 1, 2) רמות ה-pH הולמים במעיים של zebrafish, או 3) התחלתה של היווצרות נבג וליווי שינויים membraneous בחיידקים (איור 2ב). לכן, הוקמה שיטת לחיתוך מעיים כדי לזהות את הקושי.

Figure 2
איור 2: Microgavage של הזחלים של הדגים עם C. הקושי. (א) דמות מייצגת של הזחלים הזברדגים בגיל 5 dpf עם מוכתם בקרינה פלואורסצנטית C. התמונה הוקלטה סביב 3 h post-gavage, מראה כי C. הקושי היו נוכח המעי האחורי של דג הצראצדון. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) confocal וקד זמן הדמיה דימות להפגין מקרופאג תנועתיות. כפול הזחלים משני הרימות Tg (mpeg 1.1: KalTA4)bz16/Tg (4xuas-E1b: egfp)hzm3 ב 5 dpf היו בעלי מסומן בקרינה פלואורסצנטית C. בעלי הקושי. הדמיה של מוקד זמן מיקוד התבצע עד 12 h. סרגל קנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לאשר אם C. הקושי היה מסוגל לאכלס דג, מעיים דג זברה הופרדו בנקודות זמן שונות לאחר gavage. לאחר מכן, המעיים הבודדים היו הומוגניים בעלי כדים פלסטיים, והומוגניים הינם מודטים ב -C. הקושי המכיל את D-ציקלוסרין ואת הסייפוטין, עם או בלי tca. עם זאת, פעילה באופן פעיל C. הקשיים תאים זוהו רק עד 24 h לאחר הידבקות הן עם ובלי tca (נתונים לא מוצגים). מדובר בעובדה כי הקהילות הילידים ברימות הקונבנציונליות מנעו את הפלישה לקשיים בגלל התנגדות הקולוניזציה שלהם.

בנוסף, השתמשו גם בזחלים של גנוטוביוטיים. דגימות מעיים 24 hpi היו גזור והראה גידול חיידקי בינוני עם TCA או בלי TCA, בעוד חיידקים לא גדל בקבוצת הביקורת (איור 3א). עם זאת, בזמן מאוחר יותר נקודות (כלומר, 48 hpi, 72 hpi, ו 120 hpi) הדגימות הדגירה גדל רק במדיום המכיל TCA, אשר הציע כי סך C. הקושי בבטן יצרו נבגים (איור 3ב). זה מספק הסבר אפשרי לאובדן של תיוג פלואורסצנטית.

16S rDNA PCR השתמשו אז כדי לזהות את החיידקים הגדולים כ C. הקושי, אשר הפיק הגברה מסוימת PCR של גודל צפוי (~ 800 bp; איור 3ג). תוצאה זו אומתה עוד יותר על ידי רצף של מוצרי PCR אלה. לאחר מכן, תרבויות בקטריות. התפשטו בלוחית הרישוי שלו כמה מושבות יחיד הועברו לאחר מכן על כרומוid-פלייט, אשר תמך רק C. הקושי צמיחה. החיידק הופיע כמושבות שחורות טיפוסיות, אשר הצביעו עוד על כך שחיידקים מהמעיים בדגים היו C. הקושי (איור 3ד).

Figure 3
איור 3: זיהוי של הקושי של C. במעי דג זברה לאחר ההדבקה. עבור כל אחד הניסויים עצמאיים, 15-20 הגנוטוביוטיקה הזחלים ב 5 dpf נדבקו 3-5 nL של 108 cfus/mL C. הקושי או PBS כשליטה שלילית על ידי microgavage. (א) המגון של מעיים בגזור היו מתורבתים. חיידקים גדל במדיום המכיל TCA 72 h לאחר זיהום של הזחלים גנוטוביוטיים (1, הקבוצה שליטה שאינם נגועים; 2, R20291-הנגועים במחלה; n = 3). (ב) תרשים סכמטי של תוצאות הניסוי הכולל לאחר 24 שעות, 48 h, 72 h, ו 120 h לאחר ההדבקה עם C. הקושי (n = 3) (C) דגימות חיידקי נבדקו על ידי 16 s rdna PCR ב 72 h post-microgavage (1, לא נגוע בקבוצה בקרת; 2, R20291-הנגועים בדגים; (ד) התפתחותם של C. הקושי על כרומאיד-צלחת; שימו לב לצבע השחור של C. הקושי, שהוא תכונה של צלחות אלה (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Movie 1
סרט משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המוצגות לשנות ולהרחיב גישה קיימת כדי להדביק את הזחלים דג זברה על ידי ביצוע שתי הזרקה ו microgavage10,14. זה גם מדגים גישה לחקור פתוגנים אנאירובית עם הזחלים דג זברה22. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ניתוח של תגובות תא החיסון הטבוע בvivo על CDI ועל הקולוניזציה של C. הקושי ב-zebrafish. השיטה היא למעשה קלה לביצוע במעבדה שגרתית או בסביבה קלינית.

כדי לעקוב אחר הפייגוציטוזה של סי. הקושי על ידי לוקיולוציטים, שני שורות הטרנסגניים יציבים שימשו (למשל, Tg [Mpeg 1.1: KalTA4]bz16) כדי להמחיש מקרופאגים (KalTA4: ממוטב הדגים ממוטבת Gal4-variant) ו Tg (lyz: KalTA4)bz17 ו הדמיה נויטרופילים כאשר חצה עם הרקע הטרנסגניים של Tg (4xuas: egfp)hzm3 ספקים. בשל הסביבה אנאירובית הנדרשת לצמיחה של C. הקושי, כלים גנטיים לעקוב אחר c. הקושי מוגבלים. למרות שניתן להשתמש ב- Mcherryopt ממוטבת של codon כדי לתייג אותם, יש לתקן את החיידקים C. בקטריה לפני המציגות את הקרינה לפני השימוש בו בהגדרות הדמיה חיה13. לכן, צבע פלורסנט שימש כאן כדי להכתים בשידור חי C. הקושי עם פלואורסצנט אדום, אשר ניתן לשלב עם רבים זמין הירוק פלורסנט מגוון זנים דג זברה. ניתן להחיל שיטה זו בקלות על חיידקים אנאירוביים מעיים אחרים, כגון בקטריה פראגידיס והליקובקטר hepaticus. התוצאות הנציגה להפגין כי הן נויטרופילים מקרופאגים יכולים לזהות ו phagocytose C. הקושי ב-zebrafish נגוע.

הן שיטות טבילה מיקרוהזרקה שימשו באופן קבוע כדי להדביק דג דג זברה20,21,22. שימוש שיטות טבילה היא פשוטה, אך גישה זו מקשה לשלוט במדויק את זמן הפלישה של חיידקים לתוך המעי. מיקרוהזרקה היא השיטה הנפוצה ביותר כדי להדביק העוברים של דג דג זברה עם פתוגנים, אבל זה תמיד גורם נזק לרקמות. מכאן, microgavage השתמשו כדי לחקות את המסלול זיהום טבעי.

עם זאת, זה נמצא כי צבע מוכתם C. הקושי הפכה בלתי ניתן לגילוי סביב 5 h post-microgavage. הסיבות לכך הם לא ברורים כרגע, אבל יכול להיות קשור ל 1) אי הסובלנות של fluorophore תחת תנאי מעיים או 2) חניכה של היווצרות נבג של C. הקושי תאים. עוד נמצא כי הקושי לא התגלה בתרבות של הזחלים שלמים המהומוטים. לכן, המעיים של כל דג זברה נגוע היה לאחר מכן מתורבת כדי לקבוע אם C. הקושי עדיין מיושב ברקמת המעי של דג דג זברה.

בגלל המיקרוביוטה הילידים של עכברים קונבנציונליים, רק עכברים שטופלו מראש עם קוקטייל אנטיביוטי או עכברים הגנוביוטיים רגישים ל -C. הקושי16. כמו כן, זה נמצא כי C. הקושי התגלתה רק במעיים של דגי הגנוטוביוטי, אך לא בסוג פראי הרגיל של מצוי 24 שלאחר זיהום. מעניין, דגימות מעיים של 48 h, 72 h, ו 120 h לאחר הזיהום צמח דג זברה גדל רק במדיה המכילה tca. כפי שמתואר לעיל, TCA מעוררת C. הקושי נביטת נבג בתוך מבחנה. תוצאה זו מרמזת כי פעיל C. הקושי בתאים שנוצרו כבר נבגים וגטטיבי ב המעי דג זברה, ו-המושבות הנגזרות נבג זוהו באמצעות גישה microgavage.

שליט, נבט חינם דג זברה עדיין לא הציג כל הסימפטומים של cdi, כמו נויטרופילים מעיים או אפילו מוות של דג דג זברה. זה מראה כי זיהום על ידי הזרקה עשוי להפעיל את התאים החיסוניים מולדים על ידי פצעו וכי הופעל רק מקרופאגים ו נויטרופילים מסוגלים לזהות במהירות C. הקושי. בנוסף, ההסבר הסביר להעדר הבולטים של cdi ב-דג זברה מבוסס על ההבדלים המבבניים בין המעיים והקרביים17. לבטן הדג חסר קריפטטים מעיים, כאשר C. הקושי ממוקם לעתים קרובות18. בנוסף לטמפרטורת התחזוקה הנמוכה ביותר בהשוואה לאלה שביונקים, הייתה הנגזרת כי התחלתה של cdi ב-דג זברה אינה מתרחשת מהר כמו במודלים של יונקים. עם זאת, שני חיידקים אנאירובית של המיקרוביוטה האנושית, paracasei לקטסילוס ו Eubacterium limosum, הוכחו לגדול בתוך בטן הדגים הזיבכי19. ההתקדמות הטכנית המוצגת כאן תעודד יישומים של שיטה זו ללמוד C. קשיים וחיידקים או פתוגנים אחרים שמקורם בבטן היונקים בתוך הזחלים המvivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לטימו פריטש. לטיפול מעולה בחיות אנו מודים לחברי מעבדות הקוסטר והסטירטי לתמיכה ולדיונים מועילים. אנו מודים לד ר דנדאן האן על כך. שקריטי לקרוא את כתב היד אנו מודים בהכרת תודה על ידי המדינה הפדרלית של סקסוניה התחתונה, נינידזצ ווראב (VWZN2889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81, (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics