क्लोस्ट्रीडिओइड्स डिफिसिल के लिए लार्वा जेब्राफिश संक्रमण मॉडल का विकास

Developmental Biology

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Summary

यहां प्रस्तुत माइक्रोइंजेक्शन और नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज द्वारा फ्लोरोसेंटी लेबल एनोरोबिक सी डिफिसिल के साथ जेब्राफिश लार्वा को संक्रमित करने के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी तरीका है।

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Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

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Abstract

क्लोस्ट्रिडियोइड्स डिफिसिल इंफेक्शन (सीडीआई) को संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे आम स्वास्थ्य देखभाल से जुड़े गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमणों में से एक माना जाता है। सी डिफिसिल के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का वर्णन किया गया है, लेकिन सीडीआई में न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की सटीक भूमिकाओं को कम समझा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, दानियो रेरियो (जेब्राफिश) लार्वा का उपयोग वीवो में इन जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यवहार और सहयोग को इमेजिंग करने के लिए सी डिफिसिल संक्रमण मॉडल स्थापित करने के लिए किया जाता है। सी डिफिसिलकी निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट डाये का इस्तेमाल करते हुए एक लेबलिंग प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है । एक स्थानीयकृत संक्रमण माइक्रोइंजेक्टिंग लेबल सी डिफिसिल द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो सक्रिय रूप से जेब्राफिश आंतों के पथ में बढ़ता है और सीडीआई में आंतों के एपिथेलियल क्षति की नकल करता है। हालांकि, यह सीधा संक्रमण प्रोटोकॉल आक्रामक है और सूक्ष्म घावों का कारण बनता है, जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, यहां एक अधिक नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज प्रोटोकॉल वर्णित है। विधि खुले मुंह के माध्यम से इंटुबशन द्वारा सीधे जेब्राफिश लार्वा की आंत में सी डिफिसिल कोशिकाओं की डिलीवरी शामिल है। यह संक्रमण विधि सी डिफिसिलके प्राकृतिक संक्रमण मार्ग की बारीकी से नकल करती है।

Introduction

सी डिफिसिल एक ग्राम-सकारात्मक, बीजाणु बनाने वाला, एनारोबिक और टॉक्सिन-उत्पादक बैसिलस है जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट1में गंभीर संक्रमण का प्रमुख कारण है। सीडीआई के विशिष्ट लक्षणों में दस्त, पेट दर्द और घातक छद्म कोलाइटिस शामिल है, और यह कभी-कभी1,2मौत का कारण बन सकता है। साक्ष्य ों से पता चला है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं इस बीमारी की प्रगति और परिणामदोनोंमें महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अलावा, स्वदेशी आंत माइक्रोबायोटा सीडीआई4की शुरुआत और रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है। पिछले एक दशक में, सी डिफिसिल (बीआई/एनएपी1/027)5,6के अतिविवर्तक तनाव के उद्भव के कारण मामलों की संख्या और सीडीआई की मृत्यु दर दोनों में काफी वृद्धि हुई है । अंतर्निहित प्रतिरक्षा तंत्र की बेहतर समझ और सीडीआई के दौरान माइक्रोबायोटा की भूमिका से नए चिकित्सीय विकास और प्रगति को बढ़ाने में मदद मिलेगी, जिससे इस महामारी का बेहतर नियंत्रण हो सकेगा ।

सी डिफिसिल7,8के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए हम्सटर और माउस जैसे कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका अभी भी खराब समझ में आती है, विशेष रूप से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार मुख्य रूप से विट्रो में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या सुसंस्कृत कोशिकाओं से प्राप्त होता है। इसलिए, एक जीवित कशेरुकी जीव के अंदर सी डिफिसिल के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकट करने के लिए एक पारदर्शी ज़ेब्राफिश मॉडल की स्थापना से इस तरह के अध्ययनों की सुविधा होगी। जेब्राफ़िश लार्वा में एक कार्यात्मक सहज प्रतिरक्षा प्रणाली होती है, लेकिन निषेचन9के 4-6 सप्ताह बाद तक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है। यह अनूठी विशेषता जेब्राफिश लार्वा को सीडीआई में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अलग प्रतिक्रिया और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है।

इस रिपोर्ट में सी डिफिसिल और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जैसे मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश लार्वा का उपयोग करने वाले नए तरीकों का वर्णन किया गया है । सबसे पहले, एक स्थानीयकृत माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल जिसमें सी डिफिसिल इनोकुलम और धुंधला शामिल है प्रस्तुत किया जाता है। वीवो कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग में उपयोग करना, संक्रमण स्थल के प्रति न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया दर्ज की जाती है, और न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज द्वारा बैक्टीरिया के फेगोसाइटोसिस को देखा जाता है। हालांकि, यह बताया गया है कि इंजेक्शन स्वयं ऊतक क्षति का कारण बनता है और बैक्टीरिया10से स्वतंत्र ल्यूकोसाइट्स की भर्ती की ओर जाता है। इसलिए, जेब्राफिश लार्वा की आंत में सी डिफिसिल देने के लिए एक नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज प्रोटोकॉल बाद में वर्णित किया गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि स्वदेशी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल माइक्रोबायोटा सी डिफिसिल11के उपनिवेशीकरण के खिलाफ एक मेजबान की रक्षा करते हैं। इसलिए, गैंटोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा का उपयोग जेब्राफिश को संवेदनशील बनाने के लिए भी किया जाता है जो संक्रमित 12हैं। बाद में, आंतों के विच्छेदन व्यवहार्य सी डिफिसिल को ठीक करने और जेब्राफिश आंतों के इलाकों में उनकी उपस्थिति की अवधि को मान्य करने के लिए किया जाता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु काम कानूनी नियमों के अनुसार किया गया था (यूरोपीय संघ-निर्देश 2010/63, लाइसेंस AZ 325.1.53/56.1-TUBS और लाइसेंस AZ 33.9-42502-04-14/1418) ।

1. कम पिघलने वाले अगारोज, जेल प्लेट, और माइक्रोइंजेक्शन/माइक्रोगावेज सुई की तैयारी

  1. 30% डैनिएऊ के माध्यम (0.12 एमएम एमजीएसओ4,0.18 एमएम सीए [नंबर3]2),0.21 एमएम केसीएल, के 10 मीटर में 0.08 ग्राम कम पिघलने वाले अगारोज(सामग्रीकी तालिका, अगारोज A2576) को भंग करें, 1.5 mM HEPES (पीएच = 7.2), और 17.4 mM NaCl, कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत एक 0.8% समाधान प्राप्त करने के लिए।
    नोट: अगारोज की उच्च या कम सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, जमना करने के लिए आवश्यक समय अगारोज के विभिन्न ब्रांडों के लिए भिन्न होता है, यहां तक कि एक ही एकाग्रता पर भी।
  2. कांच केशिकाओं(सामग्री की तालिका)से माइक्रोइंजेक्शन और माइक्रोगावेज सुई तैयार करें।
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक माइक्रोपाइपेट पुलर का उपयोग करें (ध्यान दें कि इकाइयां यहां उपयोग किए जाने वाले पुलर के लिए विशिष्ट हैं; सामग्री की तालिकादेखें): माइक्रोइंजेक्शन सुई (वायु दबाव = 500; गर्मी = 400; पुल = 125; वेग = 75; समय = 150); और माइक्रोगावेज सुई (हवा का दबाव = 500; गर्मी = 400; पुल = 100; वेग = 75; समय = 150)। खींची गई सुई में न्यूस्लीज-फ्री एच2ओ के 3 माइक्रोन लोड करने के लिए माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करें।
    2. सुई को इंजेक्टर में पेश करें और उसे ठीक से जकड़ लें। इंजेक्शन के लिए एक उपयुक्त कोण के लिए सुई समायोजित करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई के लिए इंजेक्शन का दबाव 600-900 एचपीए और गेवेज सुई के लिए 200-300 एचपीए के बीच सेट करें।
    3. अंशांकन स्लाइड के काले सर्कल पर खनिज तेल की एक बूंद रखें। सुई की नोक को क्लिप करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। बूंद के आकार को मापने के लिए खनिज तेल में एक बूंद इंजेक्ट करें।
    4. माइक्रोइंजेक्शन के लिए, इंजेक्शन समय को 0.10-0.12 मिमी व्यास के साथ एक बूंद प्राप्त करने के लिए समायोजित करें, जो 0.5-1.0 nL की मात्रा के बराबर है। माइक्रोगावेज के लिए, 0.18-0.20 मिमी व्यास के साथ एक बूंद प्राप्त करें, जो 3-5 nL की मात्रा के बराबर है।
  3. माइक्रोगेवेज मोल्ड के रूप में प्लास्टिक मोल्ड का उपयोग करके 30% डैनिउ के माध्यम में 10 सेमी पेट्री डिश में अगारोज(सामग्री की तालिका,8050) के साथ 1.5% अगारोज प्लेट तैयार करें। जरूरत होने तक विलक्शन को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग से पहले आरटी या 28 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म करें।

2. फ्लोरोसेंट डाये के साथ सी डिफिसिल और बीजाणुओं की तैयारी और लेबलिंग

  1. फ्लोरोसेंट डाये(सामग्रीकी तालिका) का 1 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें। क्योंकि डाया पाउडर के 50 μg aliquots में बेचा जाता है, एक 1 mM शेयर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए शीशी के लिए DMSO के 69 μL जोड़ें।
  2. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में DMSO के 18 μL के लिए 1 mM स्टॉक समाधान के 2 μL जोड़कर फ्लोरोसेंट रंगे का 100 μM काम समाधान तैयार करें, और अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. संस्कृति सी डिफिसिल (R20291, एक राइबोटाइप 027 तनाव) रात भर झटकों के बिना एक एनारोबिक हुड में एक प्लेट से दो से तीन उपनिवेशों के साथ BHIS तरल माध्यम के 10 मीटर का उपयोग करके। भीस भी 0.5% (w/v) खमीर निकालने और 0.1% (w/v) एल-साइस्टीन के साथ पूरक है। डीएच2ओ के 10 मिलील में एल-साइस्टीन के 1 ग्राम को भंग करें और निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण करें, फिर ऑटोक्लेविंग से पहले 1 ग्राम/एल प्लेटों की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ऑटोक्लेव्ड माध्यम में जोड़ें। क्रोमआईडी सी डिफिसिल प्लेट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके सी डिफिसिल की चयनात्मक पुलिया की जाती है।
  4. फ्लोरोसेंट रंग के साथ धुंधला सी डिफिसिल
    1. हार्वेस्ट सी 1.0-1.2 के एक OD600 पर डिफिसिल और 1x PBS के 1 mL के साथ 1x धोने (आरटी में 3 मिन के लिए 5,000 x ग्राम)। 1 एक्स पीबीएस के 1 mL में फिर से सस्पेंड।
    2. बैक्टीरिया निलंबन के 1 mL में फ्लोरोसेंट रंगे के काम समाधान के 3 μL जोड़ें । अंधेरे में आरटी में 15 मिन के लिए नमूना इनक्यूबेट। अवशिष्ट रंग े और 1x पीबीएस में 1.0 के ओडी600 (1.0 ओडी600 लगभग 108 सीएफयू/एमएल के बराबर है) को हटाने के लिए 10 पीबीएस में अवशिष्ट रंग े और पुनर्निलंबित करने के लिए एक बार दाग सी डिफिसिल को धोएं।

3. जेब्राफिश लार्वा में दाग सी डिफिसिल का इंजेक्शन

  1. एनेस्थेटाइज़ 20-30 जेब्राफिश लार्वा 5 दिनों के बाद निषेचन (यहां 5 डीपीएफ के रूप में संदर्भित) 0.02%-0.04% ट्राइकेन (ट्राइकेन पाउडर डबल आसुत पानी में भंग कर दिया जाता है और पीएच = 7 के साथ 1 एम ट्रिस-एचसीएल समाधान में समायोजित किया जाता है) 30% डैनिएउ के माध्यम में ~ 10 कमरे इंजेक्शन. एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को एक ताजा 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और किसी भी अतिरिक्त 30% डैनिएउ के माध्यम को हटा दें।
  2. कवर करने के लिए जेब्राफिश लार्वा पर 0.8% कम पिघलने वाले अगारोज की एक बूंद रखें। लार्वा को धीरे-धीरे पार्श्व स्थिति में समायोजित करें। पेट्री डिश को 30-60 एस के लिए बर्फ पर रखें ताकि कम पिघलने वाले अगारोज को जमना हो सके। अगारोज को कवर करने के लिए 30% डैनिएऊ का माध्यम जोड़ें जिसमें 0.02%-0.04% ट्राइकेन हो।
  3. इंजेक्शन समाधान तैयार करें। इंजेक्शन प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए डीई-दाग सी डिफिसिल इनोकुलम के 9 माइक्रोन में पीबीएस समाधान में 0.5% फिनॉल लाल के 1 माइक्रोन जोड़ें।
  4. माइक्रोलोडर का उपयोग करके इंजेक्शन समाधान के साथ एक कैलिब्रेटेड माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करना। भरी हुई सुई को माइक्रोजोड़क पर माउंट करें और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  5. इंजेक्शन के दबाव को 600-900 एचपीए के बीच समायोजित करें। 0.5-1.0 nL प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन का समय 0.1-0.3 एस करने के लिए सेट करें। माइक्रोजोड़क में सुई को एम्बेडेड लार्वा की ओर इशारा करते हुए ~ 45 डिग्री कोण पर सेट करें।
  6. सुई की नोक को यूरोजननांग पोर के करीब गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के ऊपर रखें। अगारोज के माध्यम से पियर्स तो सुई टिप के साथ मांसपेशी, तो यह आंतों lumen में डालने और सी डिफिसिलके 0.5-1.0 nL सुई । इंजेक्शन लार्वा की निगरानी करने और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए ठीक से इंजेक्शन लार्वा लेने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

4. गैंटोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा की पीढ़ी

  1. ग्नोबायोटिक जेब्राफिश भ्रूण उत्पन्न करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्राकृतिक प्रजनन विधि का उपयोग करें, सहित: इन विट्रो निषेचन, एंटीबायोटिक युक्त माध्यम के साथ धोने (1 μg/mL एम्फोटेरिसिन बी, 10 μg/mL kanamycin, और 20 μg/mL ampicillin), ०.१% wt/vol पॉलीविनाइल pyrrolidone-आयोडीन (PVP-I) समाधान के साथ धोने, और एक सेल संस्कृति डाकू में भ्रूण की ऊष्मायन
  2. 5 डीपीएफ तक या गावसे से ठीक पहले जीनोबायोटिक स्थितियों के तहत सभी ग्नोटोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा बनाए रखें। गावज के बाद, जेब्राफिश लार्वा को एक मानक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया जाएगा लेकिन बाँझ 30% डैनिएउ के माध्यम के साथ।

5. जेब्राफिश लार्वा का गावज

  1. चरण 1.2 में वर्णित माइक्रोगावेज सुई को कैलिब्रेट करें।
  2. सुई को खनिज तेल की एक बूंद के साथ अंशांकन स्लाइड पर रखकर सुई के टिप के व्यास को मापें। सुनिश्चित करें कि टिप व्यास, कुंद, और चिकनी में 30-40 माइक्रोन है। तेज या उबड़-खाबड़ सुइयों को त्याग ें।
    नोट: सुइयों के तेज किनारों को त्वरित ज्वलंत द्वारा कुंद किया जा सकता है।
  3. चरण 3.3 में वर्णित गेवेज समाधान तैयार करें।
  4. लोड और एक माइक्रोजोड़तोड़ पर सुई माउंट के रूप में चरण ३.४ में वर्णित है । सुई को 45 डिग्री कोण पर रखने के लिए माइक्रोजोड़क को समायोजित करें।
  5. एनेस्थेटाइज़ जेब्राफिश लार्वा को चरण 3.1 में संदर्भित किया गया है। जब लार्वा आगे बढ़ना बंद कर देते हैं, तो उन्हें पाश्चर पिपेट का उपयोग करके माइक्रोगावेज मोल्ड की नाली में स्थानांतरित करें।
  6. कवर करने के लिए जेब्राफिश लार्वा पर 0.8% कम पिघलने वाले अगारोज की एक बूंद रखें। नाली की दीवार के खिलाफ नाली और पूंछ में 45 डिग्री कोणों पर सीधे सामना कर रहे सिर के साथ लार्वा को धीरे से समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि सिर के कोण लगभग समान हैं ताकि वे गावज सुइयों के कोण के साथ गठबंधन कर सकें। लार्वा की स्थिति को स्थिर करने के लिए कम पिघलने वाले अगारोज को जमना करने की अनुमति देते हुए, 30-60 एस के लिए बर्फ पर माइक्रोगावेज मोल्ड रखें।
  7. इंजेक्शन के दबाव को 200-300 एचपीए के बीच समायोजित करें। सी डिफिसिल के 3-5 nL के इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन का समय 0.1-0.3 एस तक सेट करें।
  8. धीरे-धीरे एगरोज के माध्यम से सुई को एसोफैगस के माध्यम से जेब्राफिश लार्वा के मुंह में संचालित करें। एक बार सुई की नोक पूर्वकाल आंतों के बल्ब के अंदर है, बैक्टीरिया को छोड़ने के लिए इंजेक्शन पेडल दबाएं। आंत के ल्यूमेन को डिलीवर वॉल्यूम से भरें। इसे घेघा या क्लोका से ओवरफ्लो न होने दें। धीरे-धीरे जेब्राफिश के मुंह से सुई निकाल लें।
  9. गावज के बाद, संक्रमित ज़ेब्राफिश लार्वा को एग्रोज से एक लचीले माइक्रोलोडर टिप के साथ पहले लार्वा उठाकर दूर एग्रोज काटकर बचाएं। इन लार्वा को बाँझ 30% डैनिएउ के माध्यम में स्थानांतरित करें। बाँझ माध्यम में लार्वा दो बार कुल्ला। लार्वा को एक ताजा 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। 11 डीपीएफ तक लार्वा रखा जाएगा।

6. इंजेक्शन जेब्राफिश लार्वा का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

  1. एनेस्थेटाइज़ जेब्राफिश लार्वा को चरण 3.1 के लिए संदर्भित किया जाता है। छेद से जुड़ी एक ग्लास स्लाइड के साथ 35 मिमी पेट्री डिश के नीचे एक छेद बनाएं, जिसे इमेजिंग चैंबर के रूप में जाना जाता है। 30% Danieau के माध्यम की पर्याप्त राशि के साथ इमेजिंग चैंबर के नीचे भ्रूण हस्तांतरण ।
  2. एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को कवर करने के लिए 1% कम पिघलने वाले अगारोज के 200-300 माइक्रोन जोड़ें। चूंकि एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, इसलिए लार्वा के संक्रमित क्षेत्र को ग्लास स्लाइड के खिलाफ यथासंभव बारीकी से रखें।
  3. 30-60 एस के लिए बर्फ पर जमना करते हैं। 30% डैनिएउ के साथ 0.02% -0.04% ट्राइकेन युक्त अगारोज को जलमग्न करें।
  4. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)के साथ लार्वा छवि।

7. व्यवहार्य सी डिफिसिल को ठीक करने के लिए लार्वा जेब्राफिश आंत का विच्छेदन

  1. बैक्टीरियल लोड का विश्लेषण करने के लिए लार्वा से गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को अलग करें। 0.4% ट्राइकेन के साथ जेब्राफिश लार्वा को इच्छामृत्यु से शुरू करें।
  2. बाँझ 1x पीबीएस के साथ संक्षेप में ज़ेब्राफिश कुल्ला और उन्हें एक ताजा agarose थाली में स्थानांतरित।
  3. जेब्राफिश का विच्छेदन
    1. जेब्राफिश को स्थिर करने के लिए सिर के करीब जेब्राफिश लार्वा के पृष्ठीय ट्रंक में सुई डालें। एक लैंसेट के साथ गिल्स के पीछे सिर निकालें।
    2. दूसरी सुई को पृष्ठीय ट्रंक के बीच में डालें। तीसरी सुई को जेब्राफिश के पेट में डालें और आंत को शरीर की गुहा से बाहर निकालें।
      नोट: अक्षुण्ण आंत को अलग करने के लिए चरम देखभाल की आवश्यकता है। यदि ऐसा करना मुश्किल है, तो शेष आंतरिक अंगों से आंत के बाकी हिस्सों को अलग करने के लिए अतिरिक्त खींचतान करें।
    3. 10-15 आंतों को 10-15 आंतों को 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन बाँझ वाली ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन सुई का उपयोग करें।
    4. ऊतक को बाधित करने और समरूपतैयार करने के लिए आंतों को मूसल के साथ समरूप करें। सुनिश्चित करें कि मूसल सभी आंतों को पूरी तरह से बाधित करने के लिए ट्यूब के नीचे तक पहुंचता है।
  4. सी डिफिसिल पालन माध्यम में समरूपता को इनक्यूबेट करें जिसमें डी-साइक्लोजिन और सेफॉक्साइटिसिन होता है, साथ या बिना तौररोक्लोलेट (टीसीए, सी डिफिसिल बीजाणुओं का अंकुर) एरोबिक चैंबर में।
  5. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए एनारोब्रक्टिक रूप से इनक्यूबेट करें।
  6. 16S rRNA-पीसीआर के लिए जीवाणु संस्कृति का उपयोग करें।
    1. एच2ओ के 50 माइक्रोन में एक कॉलोनी को फिर से निलंबित करें और इसे 15 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। 15 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें। 15 m0 के लिए सेंट्रलाइज्ड (आरटी में 2 मिन के लिए 14,000 आरपीएम) द्वारा लाइसेड मलबे को गोली मार दी और सी डिफिसिल-स्पेसिफिकप्राइमर (Cdiff16Sfw: 5' जीटी एजीजी एजीजी एजीजी एजीजी सीएजी जीएजी जीजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जीएजी जी एजीजी जी एजीजी जी Cdiff16Srev: 5 ' TTA AGG एजी एजी टीजीटी कैट टीजी जीजी 3') ।
    2. जब तरल संस्कृति से बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है, तो संस्कृति की फसल 1 मिलीएल और पीबीएस के 1 मिलील (आरटी में 2 मिन के लिए 14,000 आरपीएम) के साथ एक बार धोएं। एच2डीडी के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और ऊपर किए गए इलाज के रूप में इलाज करें। बैक्टीरियल उपनिवेशों को और अधिक चित्रित करने के लिए, एक भीएस-या क्रोमआईडी-प्लेट(सामग्री की तालिका)पर लकीर।

   

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Representative Results

सी डिफिसिल सख्ती से एनारोबिक होता है, लेकिन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्रोमोफोर को आमतौर पर परिपक्व होने के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। इस समस्या को दूर करने के लिए, लाइव सी डिफिसिल कोशिकाओं को दागने के लिए एक फ्लोरोसेंट डाया का उपयोग किया गया था जो सक्रिय रूप से बढ़ रहे थे (R20291, एक राइबोटाइप 027 तनाव; चित्रा 1ए)। Gal4/UAS प्रणाली का उपयोग करना, स्थिर ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों लाइव इमेजिंग के लिए उत्पन्न किए गए थे, जिसमें mpeg1.1 या lyZ प्रमोटरों ने एक Gal4-निर्भर तरीके से मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल (क्रमशः) में ईजीएफपी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को खदेड़ दिया ।

दाग सी डिफिसिल को 5 डीपीएफ पर जेब्राफिश आंतों के ट्रैक्ट में इंजेक्ट किया गया था, और संक्रमित साइटों को 1 एच के ऊष्मायन के बाद इमेज किया गया था। टाइम-लैप्स इमेजिंग से पता चला कि न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज दोनों ही संक्रमण साइटों(चित्रा 1बी)तक पहुंच गए और सी डिफिसिल को मंजूरी देने तक इन दो जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या बढ़ गई। लेबल वाले सी डिफिसिल े के फेगोसाइटोसिस और पाचन से हुई क्लीयरिंग। चित्रा 1सी से पता चलता है कि एक सक्रिय मैक्रोफेज फागोसाइटाइज्ड दो सी डिफिसिल बैक्टीरिया (सप्लीमेंट्री मूवी 1देखें) ।

Figure 1
चित्रा 1: जेब्राफिश में सी डिफिसिल का धुंधला और संक्रमण। (A)माइक्रोइंजेक्शन के बाद संक्रमित जेब्राफिश के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल सी डिफिसिल बैक्टीरिया। स्केल बार = 5 μm.(B)Confocal Z-ढेर प्रक्षेपण डबल ट्रांसजेनिक जेब्राफिश टीजी में हरे फ्लोरोसेंट न्यूट्रोफिल दिखा (lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)2 घंटे के बाद संक्रमण (एचपीआई) में सी डिफिसिल संक्रमण स्थल पर संचितhzm3 । न्यूट्रोफिल लाल रंग में हरे और सी डिफिसिल में दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन.(सी)कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग जिसमें जीएफपी-लेबल मैक्रोफेज फागोसाइटोसिंग रेड फ्लोरोसेंट दाग सी डिफिसिलदिखाया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हालांकि रोगाणुओं के साथ जेब्राफिश लार्वा को संक्रमित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन सबसे आम तरीका है, यह विधि हमेशा ऊतक क्षति का कारण बनती है, जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इस समस्या से बचने के लिए, माइक्रोगावेज का उपयोग 5 डीपीएफ पर मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल रिपोर्टर लाइनों के आंतों के लुमेन में फ्लोरेसेंस-लेबल सी डिफिसिल देने के लिए किया गया था, जो सीडीआई(चित्रा 2ए)के प्राकृतिक पथ की नकल करता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज ने माइक्रोगेवेज(चित्रा 2बी)के बाद 12 घंटे तक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में स्पष्ट माइग्रेशन नहीं दिखाया। इस बीच, लेबल सी डिफिसिल की फ्लोरेसेंस लगभग 5 घंटे पोस्ट-माइक्रोगावेज के बाद गायब हो गई, या तो 1) एंजाइमैटिक विनाश के कारण होने की संभावना, 2) जेब्राफिश की आंत में अनुचित पीएच स्तर, या 3) बीजाणु गठन की शुरुआत और बैक्टीरिया में झिल्लीदार परिवर्तन के साथ(चित्रा 2बी)। इसलिए, सी डिफिसिलका पता लगाने के लिए आंतों की विच्छेदन विधि स्थापित की गई थी।

Figure 2
चित्रा 2: सी डिफिसिलके साथ जेब्राफिश लार्वा का माइक्रोगावेज। (A)फ्लोरेसेंस-दाग सी डिफिसिलके साथ 5 डीपीएफ गावज में जेब्राफिश लार्वा की प्रतिनिधि छवि । छवि 3 घंटे के बाद gavage के आसपास दर्ज की गई थी, दिखा रहा है कि सी डिफिसिल जेब्राफिश के पीछे आंत में मौजूद थे । स्केल बार = 100 माइक्रोन.(बी)कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग मैक्रोफेज मोटिटी का प्रदर्शन। डबल ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा टीजी (mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 पर 5 dpf फ्लोरेसेंस लेबल सी डिफिसिलके साथ gavaged थे । कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग 12 घंटे तक के लिए किया गया था स्केल बार = 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस बात की पुष्टि करने के लिए कि क्या सी डिफिसिल जेब्राफिश में निवास करने में सक्षम था, गैवेज के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर ज़ेब्राफिश आंतों को अलग किया गया था। फिर, अलग आंतों को प्लास्टिक कीटों के साथ समरूप किया गया था, और सी डिफिसिल माध्यम में समरूप थे, जिसमें डी-साइकरीबिन और सेफॉक्साइटिसिन, टीसीए के साथ या बिना थे। हालांकि, सक्रिय रूप से बढ़ रही सी डिफिसिल कोशिकाओं को टीसीए (डेटा नहीं दिखाया गया) दोनों के साथ और बिना 24 घंटे के बाद संक्रमण तक का पता लगाया गया था। यह अनुमान लगाया गया है कि पारंपरिक लार्वा में स्वदेशी माइक्रोबियल समुदायों ने अपने उपनिवेश प्रतिरोध के कारण सी डिफिसिल आक्रमण को रोका।

ग्नोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा का भी उपयोग किया गया था। आंतों के नमूनों 24 एचपीआई विच्छेदन और टीसीए के साथ या टीसीए के बिना माध्यम में जीवाणु वृद्धि दिखाई गई, जबकि नियंत्रण समूह में कोई बैक्टीरिया नहीं बढ़ा(चित्रा 3ए)। हालांकि, बाद के टाइमपॉइंट्स (यानी, 48 एचपीआई, 72 एचपीआई और 120 एचपीआई) इनक्यूबेटेड नमूनों में केवल टीसीए युक्त माध्यम में वृद्धि हुई, जिसमें सुझाव दिया गया था कि आंत में कुल सी डिफिसिल ने बीजाणुओं(चित्रा 3बी)का गठन किया था। यह फ्लोरेसेंस लेबलिंग के नुकसान के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण प्रदान करता है।

16S आरडीएनए पीसीआर का उपयोग बड़े बैक्टीरिया को सी डिफिसिलके रूप में पहचानने के लिए किया गया था, जिसने उम्मीद के मुताबिक आकार के विशिष्ट पीसीआर एम्प्लिस (~ 800 बीपी) का उत्पादन किया था; चित्रा 3सी)। इन पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करके इस परिणाम को और सत्यापित किया गया था। बाद में, जीवाणु संस्कृतियों एक भीएस प्लेट पर फैल रहे थे । कई एकल उपनिवेशों को तब क्रोमिड-प्लेट पर स्थानांतरित किया गया था, जिसने केवल सी डिफिसिल विकास का समर्थन किया था। बैक्टीरिया ठेठ काले उपनिवेशों के रूप में दिखाई दिया, जो आगे संकेत दिया है कि जेब्राफिश आंतों से बैक्टीरिया सी डिफिसिल (चित्रा 3डी)थे ।

Figure 3
चित्रा 3: संक्रमण के बाद जेब्राफिश आंत में सी डिफिसिल का पता लगाना। प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोगों के लिए, 5 डीपीएफ पर 15-20 जीनोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा माइक्रोगेज द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 108 सीयू/एमएल सी डिफिसिल या पीबीएस के 3-5 nL से संक्रमित थे। (क)विच्छेदित आंतों के समरूपों को सुसंस्कृत किया गया था। बैक्टीरिया जीनोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा (1, गैर संक्रमित नियंत्रण समूह; 2, R20291-संक्रमित जेब्राफिश; एन = 3) के संक्रमण के बाद टीसीए 72 एच वाले माध्यम में वृद्धि हुई। (ख)24 घंटे, 48 एच, 72 एच के बाद समग्र प्रयोग परिणामों का योजनाबद्ध उदाहरण, और सी डिफिसिल (एन = 3)(सी)बैक्टीरियल नमूनों के साथ 12S आरडीएनए पीसीआर द्वारा 72 घंटे पोस्ट-माइक्रोगेवेज (1, गैर-संक्रमित नियंत्रण समूह; 2, आर20291-संक्रमित जेब्राफिश; एन = 3) पर परीक्षण किया गया। (D)क्रोमिड-प्लेट पर सी डिफिसिल की वृद्धि; सी डिफिसिले के काले रंग पर ध्यान दें, जो इन प्लेटों (एन = 3) की एक विशेषता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Movie 1
अनुपूरक मूवी 1 । कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

प्रस्तुत किए गए तरीकों में इंजेक्शन और माइक्रोगावेज10,14दोनों का प्रदर्शन करके जेब्राफिश लार्वा को संक्रमित करने के लिए मौजूदा दृष्टिकोण को संशोधित और विस्तारित किया जाता है । यह जेब्राफिश लार्वा22के साथ एनारोबिक रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण भी दर्शाता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल सीडीआई पर वीवो में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण और जेब्राफिश में सी डिफिसिल के उपनिवेश पर सुविधा प्रदान करता है। विधि एक नियमित प्रयोगशाला या नैदानिक वातावरण में संचालित करने के लिए प्रजनन योग्य और आसान है।

ल्यूकोसाइट्स द्वारा सी डिफिसिल के फागोसाइटोसिस की निगरानी करने के लिए, मैक्रोफेज (KalTA4: एक ज़ेब्राफिश-अनुकूलित Gal4-संस्करण) और टीजी(lyz: KalTA4)bz17 की कल्पना करने के लिए दो स्थिर ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों का उपयोग किया गया (उदाहरण के लिए, टीजी[mpeg1.1: KalTA4]bz16)और टीजी (lyz: KalTA4)bz17 और टीजी (4xUAS: EGFPFP)hz3 वाहक ों की ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि के साथ पार करते समय न्यूट्रोफिल की कल्पना करें। सी डिफिसिलके विकास के लिए आवश्यक एनारोबिक वातावरण के कारण, सी डिफिसिल का पता लगाने के लिए आनुवंशिक उपकरण सीमित हैं। हालांकि उन्हें लेबल करने के लिए एक कोडन-अनुकूलित mCherryOpt की सूचना दी गई है, लेकिन लाइव इमेजिंग सेटिंग्स13में इसके उपयोग से पहले फ्लोयोरसेंस का प्रदर्शन करने से पहले सी डिफिसिल बैक्टीरिया को तय किया जाना चाहिए। इसलिए, लाल फ्लोरेसेंस के साथ लाइव सी डिफिसिल को दागने के लिए यहां फ्लोरोसेंट डाया का उपयोग किया गया था, जिसे कई उपलब्ध हरे फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश उपभेदों के साथ जोड़ा जा सकता है। इस विधि को आसानी से अन्य आंतों के एनारोबिक बैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है, जैसे बैक्टरॉइड नाजुक और हेलीकोबैक्टर हेपेटिकस। प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज दोनों संक्रमित जेब्राफिश में सी डिफिसिल को पहचान सकते हैं और फागोसाइटोज सी डिफिसिल कर सकते हैं।

जेब्राफिश 20,21,22को संक्रमित करने के लिए विसर्जन और माइक्रोइंजेक्शन दोनों विधियों का नियमित रूप से उपयोग किया जाता रहा है . विसर्जन विधियों का उपयोग सीधा है, फिर भी इस दृष्टिकोण से आंत में बैक्टीरिया के आक्रमण के समय को सही ढंग से नियंत्रित करना मुश्किल हो जाता है। माइक्रोइंजेक्शन रोगजनकों के साथ जेब्राफिश भ्रूण को संक्रमित करने के लिए सबसे आम तरीका है, लेकिन यह हमेशा ऊतक क्षति का कारण बनता है। इसलिए, प्राकृतिक संक्रमण मार्ग की नकल करने के लिए माइक्रोगावेज का उपयोग किया गया था।

हालांकि, यह पाया गया कि रंगसे दाग सी डिफिसिल 5 एच पोस्ट-माइक्रोगेवेज के आसपास अज्ञेय हो गया। इसके कारण वर्तमान में अस्पष्ट हैं, लेकिन आंतों की स्थितियों के तहत फ्लोरोफोर की 1) असहिष्णुता या 2) सी डिफिसिल कोशिकाओं के बीजाणु गठन की शुरुआत से संबंधित हो सकते हैं। यह भी पाया गया कि सी डिफिसिल पूरे लार्वा समरूपों की संस्कृति में पता नहीं लगाया जा सकता है। इसलिए, प्रत्येक संक्रमित जेब्राफिश के पेट को विच्छेदित किया गया था, यह निर्धारित करने के लिए संस्कारित किया गया था कि क्या सी डिफिसिल अभी भी जेब्राफिश के आंतों के ऊतकों में निवास करता है।

पारंपरिक चूहों के स्वदेशी माइक्रोबायोटा के कारण, एंटीबायोटिक कॉकटेल या टेक्नोबायोटिक चूहों के साथ पूर्वशोधित केवल चूहे सी डिफिसिल16के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसी तरह, यह पाया गया कि सी डिफिसिल केवल ग्नोटोबायोटिक जेब्राफिश की आंतों में पाया गया था लेकिन पारंपरिक जंगली प्रकार के जेब्राफिश 24 एच पोस्ट-इंफेक्शन में नहीं। दिलचस्प बात यह है कि 48 एच, 72 एच और 120 एच के संक्रमण के बाद जेब्राफिश के आंतों के नमूने केवल टीसीए युक्त मीडिया में बढ़े। जैसा कि ऊपर वर्णित है, टीसीए विट्रो में सी डिफिसिल बीजाणु अंकुरण को उत्तेजित करता है। इस परिणाम से पता चलता है कि सक्रिय सी डिफिसिल कोशिकाओं ने पहले से ही जेब्राफिश आंत में वनस्पति बीजाणु का गठन किया है, और बीजाणु-व्युत्पन्न उपनिवेशों को माइक्रोगावेज दृष्टिकोण का उपयोग करके पाया गया था।

दिलचस्प बात यह है कि रोगाणु मुक्त जेब्राफिश ने अभी भी सीडीआई के कोई लक्षण पेश नहीं किए, जैसे आंतों की न्यूट्रोफिल आमद या जेब्राफिश की मौत भी । इससे पता चलता है कि इंजेक्शन द्वारा संक्रमण घायल होने से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय कर सकता है और केवल सक्रिय मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल सी डिफिसिलका जल्दी से पता लगाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, जेब्राफिश में प्रमुख सीडीआई की कमी के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण जेब्राफिश और स्तनधारी आंतों17के बीच संरचनात्मक मतभेदों पर आधारित है। जेब्राफिश आंत आंतों के तहखाने का अभाव है, जहां सी डिफिसिल अक्सर18स्थित होते हैं। स्तनधारियों की तुलना में जेब्राफिश के कम रखरखाव तापमान के साथ, यह अनुमानित था कि जेब्राफ़िश में सीडीआई की शुरुआत स्तनधारी मॉडल ों की तरह तेजी से नहीं होती है। हालांकि, मानव माइक्रोबायोटा, लैक्टोबेसिलस पैराकेसी और यूबेसेरियम लिमोसम के दो एनारोबिक बैक्टीरिया जेब्राफिश आंत19के अंदर बढ़ने के लिए साबित हुए हैं। यहां प्रस्तुत तकनीकी प्रगति इस विधि के अनुप्रयोगों को प्रोत्साहित करेगी सी डिफिसिल और अन्य बैक्टीरिया या रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए जो वीवो में आणविक रूप से ट्रैककरने योग्य जेब्राफिश लार्वा में स्तनधारी पेट से प्राप्त होते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट पशु देखभाल के लिए टिमो फ्रिट्सच के आभारी हैं। हम समर्थन और उपयोगी चर्चा के लिए कोस्टर और Steinert प्रयोगशालाओं के सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि को महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए हम डॉ ददन हान को धन्यवाद देते हैं । हम कृतज्ञता से लोअर सैक्सनी, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) के संघीय राज्य द्वारा धन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

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References

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