Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Clostridioides difficile infectie (CDI) wordt beschouwd als een van de meest voorkomende gezondheidszorg-geassocieerde gastro-intestinale infecties in de Verenigde Staten. De aangeboren immuunrespons tegen C. difficile is beschreven, maar de exacte rollen van neutrofielen en macrofagen in CDI zijn minder begrepen. In de huidige studie worden Danio rerio (zebravissen) larven gebruikt om een C. difficile infectiemodel vast te stellen voor beeldvorming van het gedrag en de samenwerking van deze aangeboren immuuncellen in vivo. Om C. difficilete controleren, is een etiketteringsprotocol met behulp van een fluorescerende kleurstof ingesteld. Een gelokaliseerde infectie wordt bereikt door micro-injecting gelabeld C. difficile, die actief groeit in de zebravissen darmkanaal en bootst de darmepitheel schade in CDI. Echter, dit directe infectie protocol is invasief en veroorzaakt microscopische wonden, die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Daarom wordt hier een meer niet-invasief microgavageprotocol beschreven. De methode omvat de levering van C. difficile cellen rechtstreeks in de darm van zebravissen larven door intubatie via de open mond. Deze infectie methode bootst nauw de natuurlijke infectie route van C. difficile.

Introduction

C. difficile is een gram-positieve, spore-vormende, anaërobe en toxine-producerende bacillus dat is de belangrijkste oorzaak van ernstige infecties in het maag-darmkanaal1. Typische symptomen van CDI zijn diarree, buikpijn en fatale pseudomembranous colitis, en het kan soms leiden tot de dood1,2. Bewijs heeft aangetoond dat gastheer immuunreacties een cruciale rol spelen in zowel de progressie als de uitkomst van deze ziekte3. Naast de immuunrespons is de inheemse darmmicrobiota cruciaal voor het begin en de pathogenese van CDI4. In het afgelopen decennium zijn zowel het aantal gevallen als het sterftecijfer van CDI aanzienlijk toegenomen als gevolg van de opkomst van een hypervirulente stam van C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Een beter begrip van onderliggende immuunmechanismen en de rol van microbiota tijdens CDI zal helpen leiden tot nieuwe therapeutische ontwikkelingen en vooruitgang, waardoor deze epidemie beter kan worden onder controle.

Verschillende diermodellen, zoals de hamster en de muis, zijn ontwikkeld om inzicht te geven in de immuunverdediging tegen C. difficile7,8. Echter, de rol van aangeboren immuuncellen is nog steeds slecht begrepen, vooral omdat aangeboren immuuncel gedrag is voornamelijk afgeleid van histologische analyse of gekweekte cellen in vitro. Daarom zal het vaststellen van een transparant zebravismodel om de aangeboren immuunrespons op C. difficile binnenkant van een levend gewerveld organisme aan het licht te brengen, dergelijke studies vergemakkelijken. Zebravissen larven hebben een functioneel aangeboren immuunsysteem, maar ze missen het adaptieve immuunsysteem tot 4-6 weken na de bevruchting9. Deze unieke functie maakt zebravissenlarven een uitstekend model om de geïsoleerde respons en functie van aangeboren immuuncellen in CDI te bestuderen.

Dit rapport beschrijft nieuwe methoden met behulp van zebravissen larven om de interacties tussen C. difficile en aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen te bestuderen. Ten eerste wordt een gelokaliseerd micro-injectieprotocol gepresenteerd dat C. difficile inoculum en kleuring omvat. Met behulp van in vivo confocale time-lapse beeldvorming wordt de respons van neutrofielen en macrofagen op de infectieplaats geregistreerd en wordt de fagocytose van bacteriën door neutrofielen en macrofagen waargenomen. Er is echter gemeld dat de injectie zelf weefselschade veroorzaakt en leidt tot de aanwerving van leukocyten onafhankelijk van de bacterie10. Daarom wordt vervolgens een niet-invasief microgavageprotocol beschreven om C. difficile in de darm van zebravissenlarven te leveren. Eerdere studies hebben aangetoond dat inheemse gastro-intestinale microbiota een gastheer te beschermen tegen de kolonisatie van C. difficile11. Daarom worden gnotoötische zebravissenlarven ook gebruikt om de zebravis die besmet zijn 12vatbaar te maken. Daarna wordt darmdissectie uitgevoerd om levensvatbare C. difficile te herstellen en de duur van hun aanwezigheid in zebravissen darmkanaal te valideren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven dierwerkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de wettelijke voorschriften (EU-Richtlijn 2010/63, licentie AZ 325.1.53/56.1-TUBS en licentie AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Bereiding van laagsmeltende Agarose, Gel Plate en Microinjection/Microgavage Naalden

  1. Los 0,08 g laagsmeltende agarose op (Tabel met materialen, agarose A2576) in 10 mL van 30% Danieau's medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) en 17,4 mM NaCl, opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) om een 0,8% oplossing te verkrijgen.
    OPMERKING: Hogere of lagere concentraties agarose kunnen worden gebruikt. Echter, de benodigde tijd om te stollen varieert voor verschillende merken van agarose, zelfs bij dezelfde concentratie.
  2. Bereid micro-injectie en microgavage naalden uit glazen haarvaten(Tabel met materialen).
    1. Gebruik een micropipette trekker met de volgende instellingen (merk op dat eenheden specifiek zijn voor de hier gebruikte trekker; zie Materiaaltabel):microinjectienaalden (luchtdruk = 500; warmte = 400; trekkracht = 125; snelheid = 75; tijd = 150); en microgavagenaalden (luchtdruk = 500; warmte = 400; trek = 100; snelheid = 75; tijd = 150). Gebruik een microloadertip om 3 μL nuclease-vrije H2O in de getrokken naald te laden.
    2. Introduceer de naald in de injector en bevestig hem goed. Pas de naald aan een geschikte hoek aan voor injectie. Stel de injectiedruk tussen 600-900 hPa in voor micro-injectienaald en 200-300 hPa voor gavagenaald.
    3. Plaats een druppel minerale olie op de zwarte cirkel van de kalibratieplaat. Gebruik fijne tangen om de punt van de naald te knippen. Injecteer een druppel in de minerale olie om de grootte van de druppel te meten.
    4. Voor micro-injectie moet u de injectietijd aanpassen om een druppel te verkrijgen met een diameter van 0,10-0,12 mm, wat overeenkomt met een volume van 0,5–1,0 nL. Voor microgavage, het verkrijgen van een druppel met een diameter van 0,18-0,20 mm, die gelijk is aan een volume van 3-5 nL.
  3. Bereid een 1,5 % agarose plaat met agarose (Tabel van materialen, 8050) in een 10 cm Petri schotel in 30% Danieau's medium met behulp van een kunststof mal als de microgavage mal. Bewaar bij 4 °C om uitdroging te voorkomen totdat dat nodig is. Warm tot RT of 28 °C voorafgaand aan het experiment.

2. Bereiding en etikettering van C. difficile en sporen met fluorescerende kleurstof

  1. Bereid een 1 mM voorraad oplossing van een fluorescerende kleurstof(Tabel met materialen). Omdat de kleurstof wordt verkocht in 50 μg aliquots poeder, voeg 69 μL DMSO toe aan de flacon om een voorraadconcentratie van 1 mM te verkrijgen.
  2. Bereid een 100 μM werkoplossing van de tl-kleurstof door 2 μL 1 mM-oplossing toe te voegen aan 18 μL DMSO in een centrifugebuis en meng goed.
  3. Cultuur C. difficile (R20291, een ribotype 027 stam) door het inenten van 10 mL BHIS vloeibaar medium met twee tot drie kolonies van een plaat in een anaerobe kap zonder te schudden 's nachts. BHIS is BHI aangevuld met 0,5% (w/v) gistextract en 0,1% (w/v) L-cysteïne. Los 1 g L-cysteïne op in 10 mL ddH2O en steriliseer door filtratie, voeg vervolgens toe aan het autoclaved medium om een definitieve concentratie van 1 g/L te verkrijgen. Selectief kweken van C. difficile wordt gedaan met behulp van chromID C. difficile platen (Tabel van materialen).
  4. Kleuring C. difficile met de fluorescerende kleurstof
    1. Oogst C. difficile bij een OD600 van 1,0–1,2 en was 1x met 1 mL 1x PBS (5.000 x g voor 3 min bij RT). Resuspend in 1 mL van 1 x PBS.
    2. Voeg 3 μL werkende oplossing van de fluorescerende kleurstof toe aan 1 mL bacteriënsuspensie. Incubeer het monster gedurende 15 min bij RT in het donker. Was de bevlekte C. difficile eenmaal met 1 mL PBS om restkleurstof te verwijderen en resuspendin e od600 van 1.0 (1.0 OD600 is ongeveer gelijk aan 108 cfu/mL).

3. Injectie van bevlekte C. difficile in Zebrafish Larven

  1. Verdoven 20-30 zebravissen larven op 5 dagen na de bevruchting (hier aangeduid als 5 dpf) met 0,02%–0,04% tricaine (tricaine poeder wordt opgelost in dubbel gedestilleerd water en aangepast aan pH = 7 met 1 M Tris-HCL oplossing) in 30% Danieau's medium ~ 10 min voor Injectie. Breng de verdoofde larven over op een verse petrischaal van 10 cm en verwijder het medium van overtollige 30% Danieau.
  2. Plaats een daling van 0,8% laag smeltende agarose op de zebravissen larven te dekken. Pas de larven voorzichtig aan op een zijdelingse positie. Leg de petrischaal 30-60 s op ijs om de laagsmeltende agarose te laten stollen. Voeg 30% Danieau's medium met 0,02%–0,04% tricaine om de agarose te dekken.
  3. Bereid de injectieoplossing voor. Voeg 1 μL 0,5% fenolrood toe aan PBS-oplossing in 9 μL van het met kleurstof bevlekte C. difficile-inoculum om het injectieproces te visualiseren.
  4. Laad een gekalibreerde microinjectienaald met de injectieoplossing met behulp van een microloader. Monteer de geladen naald op een micromanipulator en plaats deze onder een stereomicroscoop.
  5. Stel de injectiedruk tussen 600-900 hPa aan. Stel de inspuittijd in op 0,1–0,3 s om 0,5–1,0 nL te verkrijgen. Zet de naald in de micromanipulator op een ~ 45 ° hoek wijzend naar de ingebedde larven.
  6. Plaats de naaldpunt boven het maag-darmkanaal dicht bij de urogenitale porie. Doorboor agarose dan de spier met de naald tip, dan steek het in het darmlumen en injecteren 0,5-1,0 nL van C. difficile. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde larven te monitoren en de goed geïnjecteerde larven op te pikken voor confocale beeldvorming.

4. Generatie van gnotobiotic zebravissen larven

  1. Gebruik de gevestigde natuurlijke fokmethode om gnotobiotische zebravisembryo's te genereren, waaronder: in vitro fertilisatie, wassen met antibioticahoudende medium (1 μg/mL amphotericine B, 10 μg/mL kanamycine en 20 μg/mL ampicillin), wassen met 0,1% wt/vol polyvinyl pyrrolidone-jodium (PVP-I) en incubatie van de embryo's in een celkweekkap12.
  2. Houd alle gnotobiotic zebravislarven onder gnotobiotic voorwaarden tot 5 dpf of net vóór de gavage. Na de gavage worden zebravissenlarven overgebracht naar een standaard incubator, maar met steriel 30% Danieau's medium.

5. Gavage van ZebravisLarven

  1. Kalibreer de microgavagenaald zoals beschreven in stap 1.2.
  2. Meet de diameter van de punt van de naald door de naald op een kalibratieplaat te plaatsen met één druppel minerale olie. Zorg ervoor dat de tip 30-40 μm in diameter, bot en glad is. Gooi de scherpe of ruwe naalden weg.
    LET OP: Scherpe randen van naalden kunnen worden afgemaakt door snel vlammen.
  3. Bereid de gavageoplossing zoals beschreven in stap 3.3.
  4. Laad en monteer de naald op een micromanipulator zoals beschreven in stap 3.4. Stel de micromanipulator aan om de naald in een hoek van 45° te plaatsen.
  5. Verdoven de zebravislarven waarnaar in stap 3.1 wordt verwezen. Wanneer de larven stoppen met bewegen, breng ze naar de groef van een microgavage mal met behulp van een Pasteur pipet.
  6. Plaats een daling van 0,8% laag smeltende agarose op de zebravissen larven te dekken. Pas de larven voorzichtig aan met koppen rechtop gericht bij 45° hoeken in de groef en staarten tegen de wand van de groef. Zorg ervoor dat de hoeken van de koppen ongeveer hetzelfde zijn, zodat ze zijn uitgelijnd met de hoek van de gavagenaalden. Plaats de microgavagemal 30-60 s op ijs, waardoor de laag smeltende agarose kan stollen om de posities van de larven te stabiliseren.
  7. Stel de injectiedruk tussen 200-300 hPa aan. Stel de injectietijd in op 0,1–0,3 s om een injectievolume van 3-5 nL C. difficile te verkrijgen.
  8. Bedien de naald voorzichtig door de agarose en vervolgens in de mond van zebravissenlarven, via de slokdarm. Zodra de punt van de naald zich in de voorste darmbol bevindt, drukt u op het injectiepedaal om de bacteriën vrij te geven. Vul het lumen van de darm met het geleverde volume. Laat het niet overlopen van de slokdarm of cloaca. Trek de naald voorzichtig uit de mond van de zebravis.
  9. Na gavage, red de geïnfecteerde zebravissen larven uit de agarose met een flexibele microloader tip door eerst het snijden van de agarose weg dan door het opheffen van de larven. Breng deze larven over in steriel 30% Danieau's medium. Spoel de larven twee keer in steriel medium. Breng de larven over op een verse petrischaal van 10 cm. De larven worden tot 11 dpf onderhouden.

6. Confocale microscopieanalyse van geïnjecteerde zebravissenlarven

  1. Verdovende zebravislarven aangeduid als stap 3.1. Maak een gat in de bodem van een 35 mm petrischaal met een glazen schuif aan het gat, aangeduid als de beeldkamer. Breng embryo's naar de bodem van de beeldkamer met een voldoende hoeveelheid van 30% Danieau's medium.
  2. Voeg 200-300 μL van 1% laag smeltende agarose toe om de verdoofde larven te bedekken. Aangezien een omgekeerde confocale microscoop wordt gebruikt, plaats het besmette gebied van de larven tegen de glasdia zo dicht mogelijk.
  3. Laat de agarose stollen op ijs voor 30-60 s. Dompel de agarose onder met 30% Danieau's met 0,02%–0,04% tricaine.
  4. Beeld de larven met een confocale laser scanning microscoop(Tabel met materialen).

7. Dissectie van Larvale Zebrafish Darm om levensvatbare C. difficile terug te vorderen

  1. O-darmkanaal van larven isoleren om bacteriële belasting te analyseren. Begin met het euthanaseren van zebravislarven met 0,4 % tricaine.
  2. Spoel de zebravis kort af met steriele 1x PBS en breng ze over op een verse agaroseplaat.
  3. Dissectie van zebravissen
    1. Steek een naald in de rugromp van zebravissenlarven dicht bij het hoofd om de zebravissen te immobiliseren. Verwijder het hoofd achter de kieuwen met een lancet.
    2. Steek de tweede naald in het midden van de rugstam. Steek de derde naald in de buik van de zebravis en trek de darm uit de lichaamsholte.
      OPMERKING: Extreme zorg is nodig om de intacte darm te isoleren. Als het moeilijk is om dit te doen, uit te voeren extra trekt om de rest van de darm te scheiden van de resterende inwendige organen.
    3. Gebruik een micro-injectienaald om 10-15 darmen over te brengen in een 1,5 mL buis met 200 μL steriel van 1x PBS.
    4. Homogeniseren van de darmen met een stamper om het weefsel te verstoren en homogenaten voor te bereiden. Zorg ervoor dat de stamper de bodem van de buis bereikt om alle darmen volledig te verstoren.
  4. Incubeer de homogenaten in C. difficile kweekmiddel met D-cycloserine en cefoxitine, met of zonder taurocholate (TCA, een kiemmiddel van C. difficile sporen) in een anaërobe kamer.
  5. Incubeer de plaat anaeroob gedurende 48 uur bij 37 °C.
  6. Gebruik bacteriële cultuur voor 16S rRNA-PCR.
    1. Zet een kolonie opnieuw op in 50 μL van H2O en kook deze op 95 °C gedurende 15 min. Pellet het lysed debris door centrifugatie (14.000 rpm voor 2 min bij RT) en gebruik 2 μL van de supernatant als sjabloon in 25 μL PCR-reactie met behulp van C. difficile-specifieke primers (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Wanneer bacteriën uit vloeibare cultuur worden gebruikt, oogst dan 1 mL cultuur en was één keer met 1 mL PBS (14.000 rpm voor 2 min bij RT). Resuspend de pellet in 100 μL van H2Odd en behandelen zoals hierboven gedaan. Om bacteriële kolonies verder te karakteriseren, streep op een BHIS- of chromID-plaat (Tabel van materialen).

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. difficile is strikt anaeroob, maar de chromofhore van fluorescerende eiwitten vereist meestal zuurstof om te rijpen. Om dit probleem te overwinnen, werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om levende C. difficile cellen die actief groeiden vlekken (R20291, een ribotype 027 stam; Figuur 1A). Met behulp van het Gal4/UAS-systeem werden stabiele transgene zebravislijnen gegenereerd voor live beeldvorming, waarbij de mpeg1.1- of lyZ-promotors de expressie van EGFP fluorescerend eiwit in macrofagen en neutrofielen (respectievelijk) op een Gal4-afhankelijke manier aandrenktoonden.

De bevlekte C. difficile werd geïnjecteerd in het darmkanaal van de zebravis op 5 dpf, en de geïnfecteerde sites werden afgebeeld na 1 uur van incubatie. Time-lapse beeldvorming toonde aan dat zowel neutrofielen als macrofagen de infectieplaatsen bereikten(figuur 1B), en het aantal van deze twee aangeboren immuuncellen steeg totdat de C. difficile werd gewist. Clearing vond plaats door fagocytose en de vertering van het gelabelde C. difficile. Figuur 1C toont aan dat een geactiveerde macrofaagfaagfaagocytized twee C. difficile bacteriën (zie Aanvullende Film 1).

Figure 1
Figuur 1: Vlekken en infectie van C. difficile bij zebravis. (A) Fluorescerend gelabeld C. difficile bacteriën binnen geïnfecteerde zebravissen na micro-injectie. Scale bar = 5 μm. (B) Confocale Z-stack projectie met groene fluorescerende neutrofielen in dubbele transgene zebravis Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 verzameld op de C. difficile infectie site op 2 uur na infectie (hpi). Neutrofielen worden getoond in groen en C. difficile in rood. Schaalbalk = 50 μm. (C) Confocale time-lapse imaging met gfp-gelabelde macrofagen fagocytosing rood fluorescerend gekleurd C. difficile. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Hoewel micro-injectie de meest voorkomende methode is om zebravissenlarven te infecteren met ziekteverwekkers, veroorzaakt deze methode steevast weefselschade, wat de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Om dit probleem te voorkomen, werd microgavage gebruikt om fluorescentie-gelabelde C. difficile te leveren in het darmlumen van macrofaag en neutrofiele reporter lijnen op 5 dpf, die het natuurlijke pad van CDI nabootst (figuur 2A). Neutrofielen en macrofagen toonden echter geen duidelijke migratie naar het maag-darmkanaal voor maximaal 12 uur na microgavage (figuur 2B). In de tussentijd verdween de fluorescentie van het gelabelde C. difficile na ongeveer 5 uur na microgavage, waarschijnlijk als gevolg van 1) enzymatische vernietiging, 2) ongepaste pH-niveaus in de darm van zebravissen, of 3) het begin van sporenvorming en begeleidende membraanveranderingen in de bacteriën (figuur 2B). Daarom werd een darmdissectiemethode ingesteld om C. difficilete detecteren.

Figure 2
Figuur 2: Microgavage van zebravissenlarven met C. difficile. (A) Representatief beeld van zebravissen larven op 5 dpf gavaged met fluorescentie-gekleurde C. difficile. Het beeld werd opgenomen rond 3 uur post-gavage, waaruit blijkt dat C. difficile aanwezig waren in de achterste darm van zebravissen. Schaalbalk = 100 μm. (B) Confocale time-lapse imaging die de beweeglijkheid van macrofaag aantoont. Dubbele transgene zebravislarven Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 bij 5 dpf werden met fluorescentie-gelabelde C. difficile. Confocale time-lapse imaging werd uitgevoerd voor maximaal 12 uur. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Om te bevestigen of C. difficile in staat was om zebravissen te bewonen, werden zebravissen darmen gescheiden op verschillende tijdpunten na de gavage. Vervolgens werden de geïsoleerde darmen gehomogeniseerd met plastic stamperen, en homogenaten werden geïncubeerd in C. difficile medium met D-cycloserine en cefoxitin, met of zonder TCA. Echter, actief groeiende C. difficile cellen werden alleen gedetecteerd tot 24 uur post-infectie, zowel met als zonder TCA (gegevens niet getoond). Er wordt gespeculeerd dat de inheemse microbiële gemeenschappen in conventionele larven c. difficile invasie verhinderd vanwege hun kolonisatie resistentie.

Gnotobiotic zebravis larven werden ook gebruikt. Darmmonsters 24 pk werden ontleed en vertoonden bacteriële groei in medium met TCA of zonder TCA, terwijl er geen bacteriën groeiden in de controlegroep (figuur 3A). Echter, op latere timepoints (dat wil zeggen, 48 pki, 72 pki, en 120 pki) geïncubeerd monsters alleen groeide in het medium met TCA, die suggereerde dat de totale C. difficile in de darm had gevormd sporen (Figuur 3B). Dit geeft een mogelijke verklaring voor het verlies van fluorescentieetikettering.

16S rDNA PCR werd vervolgens gebruikt om de gekweekte bacteriën te identificeren als C. difficile, die specifieke PCR amplicons van voorspelbare grootte (~ 800 bp; Figuur 3C). Dit resultaat werd verder geverifieerd door sequencing van deze PCR-producten. Daarna werden bacteriële culturen verspreid op een BHIS plaat. Verscheidene enige kolonies werden toen overgebracht op een chromID-plaat, die slechts C. difficile groei steunde. De bacteriën verschenen als typische zwarte kolonies, die verder aangaven dat de bacteriën van de zebravissendarmen C. difficile (Figuur 3D)waren.

Figure 3
Figuur 3: Detectie van C. difficile in de darm van zebravissen na infectie. Voor elk van de onafhankelijke experimenten werden 15-20 gnotobiotische zebravissenlarven bij 5 dpf besmet met 3-5 nL van 108 CFUs/mL C. difficile of PBS als negatieve controle door microgavage. (A) De homogenaten van ontleede darmen werden gekweekt. Bacteriën groeiden in het medium met TCA 72 uur na infectie van gnotobiotic zebravissen larven (1, niet-geïnfecteerde controlegroep; 2, R20291-geïnfecteerde zebravissen; n = 3). (B) Schematische illustratie van de totale resultaten van het experiment na 24 uur, 48 uur, 72 uur en 120 uur na infectie met C. difficile (n = 3) (C) Bacteriële monsters werden getest door 16S rDNA PCR bij 72 h post-microgavage (1, niet-geïnfecteerde controlegroep; 2, R20291-geïnfecteerde zebravissen; n = 3). (D) De groei van C. difficile op chromID-plaat; let op de zwarte kleur van C. difficile, dat is een kenmerk van deze platen (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Movie 1
Aanvullende film 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De gepresenteerde methoden wijzigen en breiden een bestaande aanpak uit om zebravissenlarven te infecteren door zowel injectie als microgavage10,14uit te voeren. Het toont ook een benadering aan om anaërobe ziekteverwekkers met zebravissenlarven te bestuderen22. Bovendien vergemakkelijkt het protocol de analyse van aangeboren immuuncelreacties in vivo op CDI en bij kolonisatie van C. difficile bij zebravissen. De methode is reproduceerbaar en gemakkelijk uit te voeren in een routinelaboratorium of klinische omgeving.

Om de phagocytose van C. in de gaten te houden. difficile door leukocyten, twee stabiele transgene zebravislijnen werden gebruikt (bijvoorbeeld, Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16) om macrofagen te visualiseren (KalTA4: een zebravis-geoptimaliseerde Gal4-variant) en Tg(lyz: KalTA4)bz17 en visualizetro neuphils wanneer gekruist met de transgene achtergrond van Tg(4xUAS EG: FP)hzm3 dragers. Als gevolg van de anaerobe omgeving die nodig is voor de groei van C. difficile, genetische instrumenten om C. difficile te traceren zijn beperkt. Hoewel een codon-geoptimaliseerde mCherryOpt is gemeld om ze te etiketteren, C. difficile bacteriën moeten worden vastgesteld voordat fluorescentie voorafgaand aan het gebruik ervan in live imaging instellingen13. Daarom werd hier een fluorescerende kleurstof gebruikt om levende C. difficile te bevlekken met rode fluorescentie, die kan worden gecombineerd met de talrijke beschikbare groene fluorescerende transgene zebravissenstammen. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op andere darmanaërobe bacteriën, zoals Bacteroides fragilis en Helicobacter hepaticus. De representatieve resultaten tonen aan dat zowel neutrofielen als macrofagen kunnen herkennen en fagocytose C. difficile in geïnfecteerde zebravissen.

Zowel onderdompelings- als micro-injectiemethoden worden regelmatig gebruikt om zebravis20,21,22te infecteren. Het gebruik van onderdompelingsmethoden is eenvoudig, maar deze aanpak maakt het moeilijk om de invasietijd van bacteriën in de darm nauwkeurig te controleren. Micro-injectie is de meest voorkomende methode om zebravissen embryo's te infecteren met ziekteverwekkers, maar het veroorzaakt steevast weefselschade. Vandaar dat microgavage werd gebruikt om de natuurlijke infectieroute na te bootsen.

Echter, het bleek dat kleurstof-bevlekte C. difficile werd niet op te sporen rond 5 uur post-microgavage. De redenen hiervoor zijn momenteel onduidelijk, maar kan worden gerelateerd aan ofwel de 1) intolerantie van het fluorophore onder darmaandoeningen of 2) inleiding van sporenvorming van C. difficile cellen. Verder werd vastgesteld dat C. difficile niet detecteerbaar waren in de cultuur van hele larven homogenates. Daarom werd de darm van elke besmette zebravis ontleed om te bepalen of C. difficile nog steeds het darmweefsel van zebravissen bewoonde.

Vanwege de inheemse microbiota van conventionele muizen, alleen muizen voorbehandeld met een antibioticum cocktail of gnotobiotic muizen zijn gevoelig voor C. difficile16. Ook bleek dat C. difficile alleen werd gedetecteerd in de darmen van gnotobiotic zebravis, maar niet in conventionele wild-type zebravis 24 uur post-infectie. Interessant is dat darmmonsters van 48 uur, 72 uur en 120 uur post-infectie zebravissen alleen groeiden in media met TCA. Zoals hierboven beschreven, tca stimuleert C. difficile spore kieming in vitro. Dit resultaat suggereert dat actieve C. difficile cellen al vegetatieve sporen in de zebravisdarm vormden, en sporen-afgeleide kolonies werden gedetecteerd met behulp van de microgavage benadering.

Intrigerend, kiemvrije zebravissen nog steeds geen symptomen van CDI, zoals intestinale neutrofiele instroom of zelfs de dood van zebravissen. Dit toont aan dat infectie door injectie aangeboren immuuncellen kan activeren door te verwonden en dat alleen geactiveerde macrofagen en neutrofielen in staat zijn om C. difficilesnel te detecteren. Bovendien is een waarschijnlijke verklaring voor het ontbreken van prominente CDI bij zebravis gebaseerd op de structurele verschillen tussen zebravis en zoogdierdarmen17. De darm van de zebravissen mist darmcrypten, waar C. difficile vaak18wordt gevestigd. Samen met de lagere onderhoudstemperatuur van zebravissen in vergelijking met die bij zoogdieren, werd geconcludeerd dat het begin van CDI bij zebravissen niet zo snel voorkomt als in zoogdiermodellen. Echter, twee anaërobe bacteriën van de menselijke microbiota, Lactobacillus paracasei en Eubacterium limosum, zijn bewezen te groeien in de zebravis darm19. De hier gepresenteerde technische vooruitgang zal de toepassingen van deze methode aanmoedigen om C. difficile en andere bacteriën of ziekteverwekkers afkomstig van de zoogdierdarm in moleculair hardnekkige zebravissenlarven in vivo te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn Timo Fritsch dankbaar voor uitstekende dierenverzorging. Wij danken de leden van de Köster en Steinert labs voor steun en nuttige discussies. We danken Dr. Dandan Han voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de financiering van de deelstaat Nedersaksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81, (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics