एकल डीएनए अणुओं से बड़े पैमाने पर समानांतर प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक फेमोलीटर ड्रॉपलेट सरणी

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Chemistry

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Summary

प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य 1 सेमी2 प्लैनर सब्सट्रेट पर 1 मिलियन से अधिक ऑर्डर किए गए, समान, स्थिर और बायोस्पांथीय फेमेटोलिएटर बूंदों को तैयार करना है जिसका उपयोग सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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Abstract

स्थानिक संकल्प में प्रगति और वैज्ञानिक उपकरणों की संवेदनशीलता का पता लगाने से जैविक और रासायनिक अनुसंधान के लिए छोटे रिएक्टरों को लागू करना संभव हो जाता है । उच्च प्रदर्शन वाले माइक्रोरिएक्टरों की मांग को पूरा करने के लिए, हमने एक फेमटोलिएटर ड्रॉपलेट सरणी (फेमडीए) डिवाइस विकसित किया और बड़े पैमाने पर समानांतर सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाओं में इसके आवेदन का उदाहरण दिया। दो कदम तेल-सीलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके उंगली के आकार के क्षेत्र के भीतर १,०००,००० से अधिक वर्दी की बूंदों को आसानी से उत्पन्न किया गया था । हर बूंद एक हाइड्रोफिलिक नीचे और एक हाइड्रोफोबिक साइडवॉल से बना एक फेमटोलिएटर माइक्रोचैंबर में लंगर डाले हुए था । हाइब्रिड हाइड्रोफिलिक-इन-हाइड्रोफोबिक संरचना और समर्पित सीलिंग तेल और सर्फेक्टेंट वाष्पीकरण हानि के बिना फेमोलीटर अंतरिक्ष में फेमोलीटर जलीय समाधान को स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। फेमडा डिवाइस की फेमोलीटर कॉन्फ़िगरेशन और सरल संरचना ने न्यूनतम अभिकर्मक खपत की अनुमति दी। बूंद रिएक्टरों के एक समान आयाम बड़े पैमाने पर मात्रात्मक और समय पाठ्यक्रम माप कायल और विश्वसनीय बना दिया । फेमडीए प्रौद्योगिकी प्रत्येक बूंद में डीएनए अणुओं की संख्या के साथ CFPS प्रतिक्रिया के प्रोटीन उपज सहसंबद्ध । हमने डिवाइस के माइक्रोफैब्रिकेशन, फेमोलीटर बूंदों के गठन और सूक्ष्म छवि डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के बारे में प्रक्रियाओं को सुव्यवस्थित किया। अनुकूलित कम रनिंग लागत के साथ विस्तृत प्रोटोकॉल फेमडीए तकनीक को हर किसी के लिए सुलभ बनाता है, जिसके पास मानक क्लीनरूम सुविधाएं और अपनी जगह पर एक पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप है।

Introduction

शोधकर्ता जैव/रासायनिक प्रतिक्रियाओं को पूरा करने के लिए रिएक्टरों का उपयोग करते हैं । कार्य दक्षता में सुधार करते हुए अभिकर्षक खपत को कम करने के लिए रिएक्टर के आकार को कम करने और प्रायोगिक थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए हैं । दोनों पहलुओं का उद्देश्य शोधकर्ताओं को भारी कार्यभार से मुक्त करना, लागत कम करना और अनुसंधान और विकास को तेज करना है । हमारे पास प्रतिक्रिया की मात्रा और थ्रूपुट के दृष्टिकोण से रिएक्टर प्रौद्योगिकियों के विकास के बारे में एक स्पष्ट ऐतिहासिक रोडमैप है: एकल बीकर्स/फ्लास्क/टेस्ट-ट्यूब, मिलीलीटर ट्यूब, माइक्रोलीटर ट्यूब, माइक्रोलीटर 8-ट्यूब स्ट्रिप्स, माइक्रोलीटर 96/384/1536-वेल प्लेट, और माइक्रोफ्लुइडिक नैनोलीटर/पिकोलिटर/फेमोलीटर रिएक्टर1,,2,,3,,4,5,,6,,7, पिछले दशकों में सेमीकंडक्टर उद्योग में एकीकृत सर्किट चिप्स पर ट्रांजिस्टर के फीचर आकार को आकार देने के अनुरूप बायो/केमिकल माइक्रोरिएक्टर वॉल्यूम डिडक्शन और सिस्टम इंटीग्रेशन से गुजर रहे हैं । इस तरह के छोटे पैमाने के उपकरणों का सेल-आधारित या सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान, बायोमैन्यूफैक्चरिंग, और उच्च-थ्रूपुट प्रोटोटाइप और स्क्रीनिंग8,,9,10, 11,,,12पर गहरा प्रभाव पड़ा है।,11 यह पत्र एक अद्वितीय बूंद सरणी प्रौद्योगिकी के विकास पर हमारे हाल के प्रयास का वर्णन करता है और सीएफपीएस13में अपने आवेदन को दर्शाता है, जो सिंथेटिक जीव विज्ञान और आणविक स्क्रीनिंग समुदायों के लिए एक मौलिक तकनीकहै। विशेष रूप से, हम जानबूझकर फेमडा डिवाइस को सभी के लिए सुलभ बनाने के लिए एक अनुकूलित और कम लागत वाला प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। लघुकृत डिवाइस के लिए कम लागत और आसानी से संभाल प्रोटोकॉल विश्वविद्यालयों के शैक्षिक प्रयोजनों में योगदान देगा और प्रौद्योगिकी को फैलाने में मदद करेगा।

फेमडा एक प्लैनर ग्लास सब्सट्रेट पर 10 6 प्रति1 सेमी2 के अल्ट्राहाई डेंसिटी पर फेमोलीटर बूंदों को तैयार करता है। हमने सब्सट्रेट पर माइक्रोचैम्बर सरणी उत्पन्न करने के लिए पूर्वनिर्धारित स्थितियों पर एक हाइड्रोफोबिक बहुलक, CYTOP15,ग्लास सब्सट्रेट पर और चुनिंदा रूप से नक़्क़ाशीदार (हटाया) CYTOP को लेपित किया। इस प्रकार, परिणामी माइक्रोचैम्बर एक हाइड्रोफोबिक साइडवॉल (CYTOP) और एक हाइड्रोफिलिक बॉटम (ग्लास) से बना है। जब क्रमिक रूप से नमूनों की सतह पर पानी और तेल बहते हैं, तो पानी को फंसाया जा सकता है और माइक्रोचेम्बर्स में सील किया जा सकता है। हाइड्रोफिलिक-इन-हाइड्रोफोबिक संरचना माइक्रोचेम्बर्स के बाहर पानी को पीछे हटाने, व्यक्तिगत माइक्रोरिएक्टरों को अलग करने और फेमोलीटर अंतरिक्ष के अंदर एक छोटे जलीय समाधान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अद्वितीय संपत्ति को पानी में तेल की बूंदों और लिपिड बाइलेयर माइक्रोकंभागणियों16, 17,17की तैयारी के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। प्रोटोटाइप डिवाइस16की तुलना में, हमने सबसे पहले CYTOP बहुलक को पूरी तरह से हटाने के साथ-साथ ग्लास बॉटम के पूर्ण जोखिम का एहसास करने के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया को अनुकूलित किया। CYTOP एक विशेष फ्लोरोपॉलिमर है जिसमें ग्लास, प्लास्टिक और सिलिकॉन जैसे पारंपरिक माइक्रोरिएक्टर सामग्रियों की तुलना में बेहद कम सतह तनाव (19 mN/m) कम है। इसके अच्छे ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और केमिकल परफॉर्मेंस का उपयोग माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों 18 ,,,,19, 20, 21,1822,,23,,,24के सतह उपचार में पहले ही किया जा चुका है ।2324 फेमडा प्रणाली में, CYTOP सतह पर तेल की अच्छी गीलाई प्राप्त करने के लिए, तेल की सतह तनाव ठोस सतह25की तुलना में कम होना चाहिए। अन्यथा, ठोस सतह के संपर्क में तरल तेल सतह पर फैलने के बजाय गोलाकार हो जाता है। इसके अलावा, हमने पाया कि कुछ लोकप्रिय परफ्लोरोकार्बन तेल (जैसे, 3एम एफसी-40)16 और हाइड्रोफ्लोरोरोथर तेल (उदाहरण के लिए, 3M नोवेक श्रृंखला) CYTOP के अरूपात्मक आकृति विज्ञान के परिणामस्वरूप CYTOP को भंग कर सकते हैं, जो मात्रात्मक माप के लिए घातक है और बूंदों के बीच क्रॉस-संदूषण के मामले में संदिग्ध होगा। सौभाग्य से, हमने एक जैव संगत और पर्यावरण के अनुकूल तेल की पहचान की जो कम (< 19 mN/m) सतह तनाव13का प्रदर्शन करता है । हमें एक नया सर्फेक्टेंट भी मिला जो चयनित तेल में घुल सकता है और कम एकाग्रता में कार्य कर सकता है (0.1%, कम से कम 10 गुना कम पहले की रिपोर्ट किए गए लोकप्रिय लोगों की तुलना में26,,27)13। परिणामस्वरूप पानी/तेल इंटरफेस को सर्फेक्टेंट द्वारा स्थिर किया जा सकता है। तेल की उच्च वाष्पीकरण दर के कारण, तेल के साथ फ्लश के बाद, हमने माइक्रोचेम्बर्स को सील करने के लिए पहले एक को बदलने के लिए एक और जैव संगत और पर्यावरण के अनुकूल तेल लागू किया। हम पहले तेल (ASAHIKLIN AE-3000 के साथ 0.1 wt% SURFLON एस-386) "फ्लश तेल" और दूसरा तेल (Fomblin Y25) "सीलिंग तेल," क्रमशः कहते हैं।

दो कदम तेल-सीलिंग रणनीति मिनटों के भीतर और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन के बिना फेमोलेटर बूंद सरणी के एक मजबूत गठन का एहसास कर सकती है। वाष्पीकरण की समस्या के कारण,28की मात्रा से छोटे माइक्रोरिएक्टर उत्पन्न करना चुनौतीपूर्ण माना गया है। फेमडीए ने माइक्रोरिएक्टर/बूंदों की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और प्रक्रियाओं को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करके इस मुद्दे को संबोधित किया । परिणामी बूंदों की कई उल्लेखनीय विशेषताओं में उच्च एकरूपता (या मोनोडिस्पर्सिटी), स्थिरता और फेमटोलिटर पैमाने पर जैव अनुकूलता शामिल है। बूंद की मात्रा का भिन्नता (सीवी) का गुणांक केवल 3% है (सूक्ष्म छवियों के लिए सुधार के बिना), दुनिया में बूंद प्लेटफार्मों के बीच सबसे छोटा सीवी, जो अत्यधिक समानांतर और मात्रात्मक माप सुनिश्चित करता है। फेमटोलिनर बूंद कमरे के तापमान पर बूंदों के बीच क्रॉस-संदूषण के बिना कम से कम 24 घंटे के लिए स्थिर है, जो एक विश्वसनीय समय-पाठ्यक्रम माप के लिए मूल्यवान है। जैव अनुकूलता के बारे में, हम फेमटोलिटर बूंद में एक एकल-कॉपी टेम्पलेट डीएनए से विभिन्न प्रोटीनों को संश्लेषित करने में सफल रहे, जिन्हें पहले कठिन या अक्षम29,,30माना गया था। यह स्पष्ट करने के योग्य होगा कि फेमडा में संश्लेषित होने में सक्षम कुछ प्रोटीन को अन्य बूंद प्रणालियों में संश्लेषित क्यों नहीं किया जा सकता है। फेमडा केवल एक तकनीकी उन्नति नहीं थी, बल्कि एक अभूतपूर्व मात्रात्मक माप का भी एहसास हुआ जो प्रोटीन उपज (जैसा कि बूंद की फ्लोरेसेंस तीव्रता से परिलक्षित होता है) को प्रत्येक बूंद में टेम्पलेट डीएनए अणुओं की संख्या में सहसंबंधित कर सकता है। नतीजतन, फेमडा-आधारित सीएफपीएस से बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता के हिस्टोग्राम ने एक असतत वितरण दिखाया जिसे समान पीक-टू-पीक अंतराल के गॉसियन वितरण की राशि से अच्छी तरह से फिट किया जा सकता है। इसके अलावा, डीएनए अणुओं की विभिन्न संख्याओं वाली बूंदों की घटना की संभावना एक पॉइसन वितरण31के लिए एकदम सही फिट थी। इस प्रकार, प्रत्येक बूंद में विभिन्न प्रोटीन उपज असतत वितरण के आधार पर सामान्यीकृत किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण सुविधा हमें स्पष्ट तीव्रता से एंजाइमेटिक गतिविधि जानकारी को अलग करने की अनुमति देती है, जो अभी तक अन्य माइक्रोरिएक्टर प्लेटफार्मों के साथ उपलब्ध नहीं है। मौजूदा माइक्रोफ्लुइडिक सेल /ड्रॉपलेट सॉर्टिंग सिस्टम पूरी तरह से स्वचालित छंटाई में कुशल होते हैं और नमूनों को ध्यान केंद्रित करने में अच्छे होते हैं लेकिन कभी - कभी विश्लेषणात्मक पहलू32,,33में अपेक्षाकृत व्यापक या लंबी पूंछ वाले हिस्टोग्राम का उत्पादन कर सकते हैं। हमारी अत्यधिक मात्रात्मक और जैव संगत फेमडीए प्रणाली माइक्रोरिएक्टर विकास के क्षेत्र में एक नया बेंचमार्क और एक उच्च विश्लेषणात्मक मानक सेट करता है।

बूंदों को तैयार करने के लिए जिन तेलों और सर्फेक्टेंट का उपयोग किया जा सकता है , वे अभी भी बहुतसीमितहैं . फेमडा में स्थापित ASAHIKLIN AE-3000 और SURFLON S-386 का संयोजन जलीय चरण और तेल चरण13के बीच फिजियोकेमिकल इंटरफेस के बढ़ते शस्त्रागार का एक नया सदस्य है। फेमडा में नया इंटरफ़ेस शारीरिक रूप से स्थिर, रासायनिक रूप से निष्क्रिय है, और कई प्रकार के प्रोटीन13के लिए जटिल प्रतिलेखन, अनुवाद और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन मशीनरी के साथ जैविक रूप से संगत है। यह एक प्रोटीन खोजने के लिए आकर्षक होगा जिसे बूंद सेटिंग्स में संश्लेषित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, नैनोलीटर और पिकालिएटर रिएक्टर सिस्टम35,,36की तुलना में फेमोलीटर ड्रॉपलेट सिस्टम में अभिकर् ता की लागत की बचत अधिक स्पष्ट है। विशेष रूप से, अक्सर एक बड़ी मृत मात्रा होगी, जो मुख्य रूप से ट्यूबिंग या बाहरी आपूर्ति के कारण होती है, माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेशन सिस्टम में लेकिन हमारे फेमडा में नहीं। सरणी प्रारूप को हर एक रिएक्टर37के लिए दोहराया और विस्तृत सूक्ष्म लक्षण वर्णन (तथाकथित उच्च सामग्री विश्लेषण के समान) द्वारा भी इष्ट किया जाता है, न कि तेजी से चलती वस्तु के लिए केवल एक स्नैपशॉट के बजाय। फेमटोलिएटर स्केल ने उंगली के आकार के क्षेत्र में १,०००,००० से अधिक रिएक्टरों के एकीकरण को सक्षम किया, जबकि नैनोलिटर रिएक्टरों की एक ही संख्या (यदि यह मौजूद है) को वर्ग मीटर क्षेत्र में आवश्यकता होती है, जो निस्संदेह ऐसी प्रणाली का निर्माण या उपयोग करने के लिए अव्यावहारिक होगा ।

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Protocol

1. फेमेटोलिएटर माइक्रोचैंबर सरणी सब्सट्रेट का माइक्रोफैब्रिकेशन

नोट: एक क्लीनरूम में निम्नलिखित माइक्रोफैब्रिकेशन प्रयोग का संचालन करें। क्लीनरूम में प्रवेश करने से पहले दस्ताने और एक क्लीनरूम सूट पहनें।

  1. कवर ग्लास सब्सट्रेट की सफाई
    1. कवर ग्लास को कवर ग्लास धुंधला रैक पर सेट करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 8 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) में कवर ग्लास को सोनिकेट करें।
      सावधानी: उच्च सांद्रता में NaOH त्वचा और आंख के लिए बेहद खतरनाक है। बिना किसी दिखावे के धीरे-धीरे इसे संभाल लें।
    2. नाओएच समाधान से रैक लें और दस बार पानी का उपयोग करके कवर ग्लास कुल्ला करें। कवर ग्लास को शुद्ध पानी में रखें।
      नोट: क्षारीय कचरे को निर्धारित टैंक में फेंकें। NaOH समाधान मूल बोतल को पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है और पांच बार तक उपयोग किया जा सकता है।
    3. एक एयर ब्लो गन के साथ कवर ग्लास के प्रत्येक टुकड़े को सुखाएं।
    4. सूखे कवर ग्लास को 5 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर बेक करें। निम्नलिखित हैंडलिंग प्रक्रियाओं के दौरान ग्लास सब्सट्रेट के ऊपरी हिस्से का अभिविन्यास लगातार रखें।
  2. कांच की सतह का सीलनीकरण
    1. एक सूखी धुंधला रैक पर साफ कवर ग्लास रीसेट करें।
    2. एक पीएफई बीकर में इथेनॉल के 150 एमएल जोड़ें। एक सुई (22 जी x 70 मिमी) सुसज्जित 1 मिली सीरिंज का उपयोग करें (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइएथोक्सीलेन के 0.075 एमएल आकर्षित करने के लिए और तुरंत इसे इथेनॉल (यानी, 0.05 vol%) को इंजेक्ट करें। सिरिंज के अंदर कुल्ला करने के लिए कई बार सिरिंज को खींचें और पुश करें। इसे सजातीय बनाने के लिए सुई के साथ समाधान हिलाओ।
      नोट: (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइथॉक्सीलेन को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और दो साल तक 1 एटीएम दबाव को कसी हुई सीलिंग के साथ रखा जा सकता है। उपयोग के बाद पूर्ण इथेनॉल को कसकर सील किया जाना चाहिए। हम किसी भी समाप्त हो चुके अभिकर् में उपयोग करने की सलाह नहीं देते हैं।
    3. आरटी में 1 एच के लिए 0.05% अमीनोसिलेन समाधान में कवर ग्लास को इनक्यूबेट करें।
    4. पांच बार के लिए शुद्ध पानी का उपयोग कर कवर ग्लास कुल्ला। कवर ग्लास को शुद्ध पानी में रखें।
      नोट: कचरे को निर्धारित टैंक में फेंकें।
    5. एयर ब्लो गन के साथ कवर ग्लास के प्रत्येक टुकड़े को सुखा लें।
    6. एल्यूमीनियम पन्नी पर सभी सूखे कवर ग्लास रखें। 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर कवर ग्लास बेक करें।
  3. स्पिन-कोटिंग साइटॉप परफ्लोरोपॉलिमर
    1. कवर ग्लास को स्पिन कोटर(चित्रा 1A)के अनुकूलित वैक्यूम चक पर रखें। ग्लास सब्सट्रेट को ठीक करने के लिए वैक्यूम स्विच चालू करें।
      नोट: वैक्यूम चक का डिजाइन आयताकार (24 मिमी × 32 मिमी) और पतली (0.13-0.17 मिमी) सब्सट्रेट(चित्रा 1 ए)पर चिपचिपा बहुलक की एक समान कोटिंग के लिए महत्वपूर्ण है। हमने पाया कि वैक्यूम चैनल से जोड़ने वाले कई छेद (48 छेद, प्रत्येक के साथ एक आयताकार नमूना चरण एक केंद्रीय छेद के साथ गोल चरण से बेहतर काम करता था।
    2. ग्लास सब्सट्रेट के केंद्र में टाइप-ए CYTOP बहुलक के 70-90 माइक्रोन ड्रॉप करें। तुरंत स्पिन-कोट बहुलक(चित्रा 1B)।
      नोट: स्पिन कोटिंग स्थिति (3,400 आरपीएम, 30 एस) 3 माइक्रोन मोटाई प्रदान करती है। चिपचिपा तरल के लिए डिज़ाइन किए गए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। सब्सट्रेट पर पॉलीमर ड्रॉप को पूरी तरह से सर्कल बनाने के लिए माइक्रोपिपेट को सीधा रखें। एक हवा बुलबुला अक्सर पिपेट टिप के अंदर उत्पन्न होता है क्योंकि प्लंजर नीचे की ओर बढ़ता है। बुलबुले के साथ CYTOP की आखिरी बूंद ड्रॉप मत करो।
    3. कांच सब्सट्रेट के कोनों को पकड़े उंगलियों के साथ लेपित ग्लास उठाओ, और यह एल्यूमीनियम पन्नी पर जगह है ।
    4. कवर ग्लास के शेष टुकड़ों को स्पिन-कोट करने के लिए चरण 1.3.1-1.3.3 दोहराएं।
    5. 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर लेपित ग्लास बेक करें और फिर 1 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: यह प्रसंस्करण पूरी तरह से CYTOP का इलाज करता है और ग्लास की सतह पर CYTOP को सहसंबद्ध रूप से बॉन्ड करता है। लंबे समय तक पाक प्रक्रिया के दौरान संभावित धूल से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी से बने ढक्कन के साथ बेकिंग क्षेत्र को कवर करें।
    6. साइटॉप-कोटेड कवर ग्लास को हॉटप्लेट से निकालें और आरटी में ठंडा करें। ध्यान से कोटेड ग्लास के प्रत्येक टुकड़े को उठाएं और यह देखने के लिए निरीक्षण करें कि क्या यह ठीक से लेपित है। सब्सट्रेट को अशोभनीय कोटिंग प्रदर्शित करते हुए त्यागें।
      नोट: एक अच्छी तरह से लेपित CYTOP की सतह अनियमित इंद्रधनुष की तरह पैटर्न(चित्रा 1C)के बिना फ्लैट दिखना चाहिए । एक उचित कोण से दृश्य निरीक्षण तेजी से फ्लैटनेस के साथ-साथ कोटिंग गुणवत्ता का न्याय कर सकता है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
  4. स्पिन-कोटिंग फोटोरेसिस्ट
    1. स्पिन कोटर के वैक्यूम चक (चरण 1.3.1 देखें) पर CYTOP-लेपित कवर ग्लास रखें। कवर ग्लास को ठीक करने के लिए वैक्यूम स्विच चालू करें।
    2. सब्सट्रेट के केंद्र में फोटोरेसिस्ट की 0.2-0.3 एमएल गिराएं। तुरंत स्पिन-कोट 60 एस के लिए 6,000 आरपीएम पर फोटोरेसिस्ट।
      नोट: बुलबुले के साथ फोटोरेसिस्ट की आखिरी बूंद न छोड़ें। अगर स्पिन कोटर उच्च स्पिन गति का समर्थन करता है, तो स्पिन गति पतले कोटिंग को प्राप्त करने के लिए 7,500 आरपीएम तक हो सकती है। CYTOP की कम सतह ऊर्जा अधिकांश फोटोरेसिस्टों को इसकी सतह का पालन करने से रोकती है। यदि AZ P4903 फोटोरेसिस्ट उपलब्ध नहीं है, तो AZ P4620 फोटोरेसिस्ट एक अच्छा विकल्प है।
    3. सब्सट्रेट के कोनों को पकड़े हुए दो उंगलियों के साथ लेपित सब्सट्रेट उठाएं। इथेनॉल से लथपथ क्लीन वाइपर(चित्रा 1D)का उपयोग करके सब्सट्रेट किनारे (जिसे अक्सर एज बीड रिमूवल या ईबीआर कहा जाता है) के पास अतिरिक्त फोटोरेसिस्ट को मिटा दें। एल्यूमीनियम पन्नी पर सब्सट्रेट रखें।
      नोट: EBR के लिए एसीटोन की सिफारिश नहीं की जाती है।
    4. CYTOP-लेपित कवर ग्लास के शेष टुकड़ों के लिए फोटोरेसिस्ट को स्पिन-कोट करने के लिए चरण 1.4.1-1.4.3 दोहराएं। लेपित ग्लास के हर टुकड़े को उठाएं और यह देखने के लिए निरीक्षण करें कि क्या यह ठीक से लेपित है।
      नोट: एक अच्छी तरह से लेपित फोटोरेसिस्ट की सतह अनियमित पैटर्न(चित्रा 1D) केबिना फ्लैट दिखना चाहिए । एक उचित कोण से दृश्य निरीक्षण तेजी से फ्लैटनेस के साथ-साथ कोटिंग गुणवत्ता का न्याय कर सकता है। इन्सोजेनियस कोटिंग का प्रदर्शन करने वाले सब्सट्रेट को क्रम में एसीटोन, 2-प्रोपेनोल और एच2ओ के साथ धोने के माध्यम से पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है, और पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    5. हॉटप्लेट पर 5 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर लेपित सब्सट्रेट बेक करें।
    6. हॉटप्लेट से लेपित सब्सट्रेट निकालें और आरटी को ठंडा करें। फोटोरेसिस्ट के रिहाइड्रेशन के लिए 40%-60% की सापेक्ष आर्द्रता पर 30 मिनट के लिए खड़े होने दें।
      नोट: एच2O निम्नलिखित फोटोकेमिकल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है। बेक्ड फोटोरेसिस्ट ने फोटोरेसिस्ट के अंदर एच2ओ कंटेंट खो दिया । रिहाइड्रेशन प्रक्रिया एच2ओ को हवा से अवशोषित करने की अनुमति देती है। सापेक्ष आर्द्रता 20% से कम या 80% से अधिक पुनर्हाइड्रेशन प्रक्रिया के लिए उपयुक्त नहीं है।
  5. फोटोलिथोग्राफी
    1. रिहाइड्रेशन के प्रतीक्षा समय के दौरान (चरण 1.4.6 देखें), मास्क एलाइनर शुरू करें। प्रकाश स्रोत को गर्म करें। क्रोम फोटोमास्क लोड करें।
      नोट: मास्क एलाइनर संचालित करने के लिए अनुदेश मैनुअल का पालन करें। यदि ईबी सुविधा उपलब्ध है तो फोटोमास्क को इलेक्ट्रॉन बीम (ईबी) लिथोग्राफी के माध्यम से गढ़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, फोटोमास्क को स्थानीय कंपनी को आउटसोर्स किया जा सकता है।
    2. चक(चित्रा 1E)पर रीहाइड्रेटेड सब्सट्रेट (चरण 1.4.6 परिष्करण के बाद) लोड करें।
    3. एक्सपोजर पैरामीटर सेट करें। वैक्यूम-कॉन्टैक्ट मोड में 13 एमडब्ल्यू/सेमी 2 (एच-लाइन) की यूवी तीव्रता के साथ25 एस के लिए सब्सट्रेट का पर्दाफाश करें । फिर सब्सट्रेट उतारें और इसे कवर ग्लास स्टेनिंग रैक (एक ही रैक चरण 1.1.1 में उपयोग किया जाता है) पर सेट करें।
    4. रिहाइड्रेटेड सब्सट्रेट के शेष टुकड़ों को बेनकाब करने के लिए चरण 1.5.2-1.5.3 दोहराएं।
  6. विकास
    1. उजागर फोटोरेसिस्ट(चित्रा 1F)को भंग करने के लिए 5 मिनट के लिए सब्सट्रेट विकसित करें। जिसके दौरान, धीरे से 4 मिनट के समय बिंदु पर एक बार डेवलपर में रैक हिला।
      नोट: डेवलपर AZ 300 MIF था। वैकल्पिक क्षारीय डेवलपर्स (जैसे, AZ 400 K) आम तौर पर विकास के लिए लागू होते हैं, लेकिन विकास की स्थिति (जैसे, समय, तापमान, आंदोलन) के अनुकूलन की आवश्यकता होनी चाहिए। डेवलपर कंटेनर के रूप में ग्लास बीकर्स का उपयोग न करें।
    2. दस बार के लिए शुद्ध पानी का उपयोग कर सब्सट्रेट कुल्ला। कवर ग्लास को शुद्ध पानी में रखें।
      नोट: डेवलपर को नामित टैंक में छोड़ दें।
    3. एयर ब्लो गन के साथ सब्सट्रेट के हर टुकड़े को अच्छी तरह से सुखा लें।
  7. प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी
    1. रिएक्टिव आयन नक़्क़ाशी (RIE) मशीन के रिएक्शन चैंबर में सूखे सब्सट्रेट (चरण 1.6.3 से) रखें।
      नोट: सुविधा के रखरखाव के नियम के अनुसार, RIE मशीन या तो हमेशा पर या हर बार बंद किया जा सकता है । अगर स्विच ऑफ था तो मैनुअल के हिसाब से स्विच चालू कर दें।
    2. 2 प्लाज्मा(चित्रा 1G)के साथ फोटोरेसिस्ट-खुला CYTOP Etch ।
      नोट: RIE हालत इस प्रकार था । O2 गैस प्रवाह दर: 50 एससीएम; चैंबर दबाव: 10.0 Pa; आरएफ पावर: 50 डब्ल्यू; समय नक़्क़ाशी: 27 मिनट। साइटॉप की पूरी तरह से नक़्क़ाशी 3 माइक्रोन मोटाई के लिए नक़्क़ाशी समय अनुकूलित किया गया था।
    3. चिमटी का उपयोग कर प्रतिक्रिया कक्ष से सब्सट्रेट के हर टुकड़े को उठाएं और उन्हें कवर ग्लास धुंधला रैक पर रखें।
      नोट: सुविधा के रखरखाव नियम के अनुसार, प्रतिक्रिया कक्ष को हर रन के बाद प्रतिक्रिया कक्ष को साफ रखने के लिए एक छोटी ओ2 प्लाज्मा सफाई प्रक्रिया (जैसे, नक़्क़ाशी समय: 5 मिनट) की आवश्यकता हो सकती है।
  8. फोटोरेसिस्ट और सफाई को हटाना
    1. शेष फोटोरेसिस्ट को भंग करने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए एसीटोन में सब्सट्रेट को सोनिकेट करें।
    2. आरटी में 5 मिनट के लिए 2-प्रोपेरोल में सब्सट्रेट को सोनिकेट करें।
    3. पांच बार के लिए शुद्ध पानी का उपयोग कर सब्सट्रेट कुल्ला। आर टी में 5 मिनट के लिए सब्सट्रेट को सोनिकेट करें । एक और पांच बार के लिए शुद्ध पानी का उपयोग कर नमूना कुल्ला । सब्सट्रेट को शुद्ध पानी में रखें।
    4. हवा उड़ा बंदूक(चित्रा 1H)के साथ सब्सट्रेट के हर टुकड़े को सुखा लें।
      नोट: सब्सट्रेट को प्लास्टिक पेट्री डिश में स्टोर किया जा सकता है। गढ़े सब्सट्रेट कम से कम एक वर्ष के लिए आरटी में संरचनात्मक रूप से स्थिर है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
    5. तीन आयामी (3 डी) लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, सफेद प्रकाश इंटरफेरोमेट्री (या जुटना स्कैनिंग इंटरफेरोमेट्री), या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा तैयार सब्सट्रेट की सतह प्रोफ़ाइल की विशेषता है। परिणामस्वरूप माइक्रोचेम्बर के व्यास और गहराई को मापने के लिए संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
      नोट: नमूने को गैर-संपर्क और गैर-विनाशकारी 3डी लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या सफेद प्रकाश इंटरफेरोमीटर के साथ लक्षण वर्णन के बाद अन्य प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

2. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) माइक्रोचैनल की तैयारी

नोट: पीडीएमएस को संभालने के लिए लेटेक्स दस्ताने न पहनें। इसके बजाय पॉलीथीन (पीई) दस्ताने पहनें।

  1. माइक्रोचैनल मास्टर बनाना
    1. डेस्कटॉप कटर का उपयोग करके एक डबल-लेपित चिपकने वाला कप्टन फिल्म टेप को एक परिभाषित (3 मिमी x 19 मिमी) माइक्रोचैनल आकार में काटें।
      नोट: काप्टन टेप नंबर 7602 #25 (टेराओका सेसाकुशो) था, जिसके परिणामस्वरूप 135 माइक्रोन की चैनल ऊंचाई थी। STIKA डेस्कटॉप कटर एडोब इलस्ट्रेटर फाइल में ड्राइंग के अनुसार कटिंग चलाने के लिए एडोब इलस्ट्रेटर के एक प्लगइन (रोलाण्ड वेबसाइट: https://www.rolanddga.com) से उपलब्ध का उपयोग करता है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
    2. पेट्री डिश के फ्लैट बॉटम पर हर कट काप्टन टेप चिपकाएं। मानक 90 मिमी पेट्री डिश टेप के 12 टुकड़ों को समायोजित कर सकती है।
      नोट: राहत संरचना पीडीएमएस की प्रतिकृति मोल्डिंग के लिए एक मास्टर के रूप में कार्य करती है। टेप और पेट्री डिश सब्सट्रेट के बीच सैंडविच किए गए किसी भी हवा के बुलबुले हैं तो टेप की सतह को चिमटी के साथ धीरे-धीरे दबाएं। वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन वेफर38पर मास्टर तैयार करने के लिए शास्त्रीय नरम-लिथोग्राफी लागू की जा सकती है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
  2. टेप पैटर्न पेट्री डिश में पीडीएमएस राल का इलाज
    1. नए पीई दस्ताने पहनें, और निर्दिष्ट प्लास्टिक बीकर (चित्रा 2A) में डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके SYLGARD 184 सिलिकॉन इलास्टोमर के इलाज एजेंटके 2.5ग्राम स्थानांतरित करें।
    2. नए दस्ताने में बदलें, और ऊपर प्लास्टिक बीकर में डिस्पोजेबल 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके SYLGARD 184 सिलिकॉन इलास्टोमर के प्रीपॉलिमर बेस के 25 ग्राम स्थानांतरित करें।
      नोट: आधार करने के लिए इलाज एजेंट के संभावित पार संदूषण को रोकने के लिए यहां दस्ताने बदलें ।
    3. मिश्रण को मिलाने और डीएरेट करने के लिए एक डेएरेशन मिक्सर का उपयोग करें (कार्यक्रम: 3 मिनट मिश्रण 2 मिनट डीएरेशन के बाद)।
      नोट: यदि डीएरेशन मिक्सर उपलब्ध नहीं है, तो मैन्युअल रूप से उत्तेजित (लगभग 15 मिनट के लिए) मिश्रण को वैक्यूम कक्ष में डगैस किया जा सकता है।
    4. टेप पैटर्न पेट्री डिश(चित्रा 2B)में पीडीएमएस मिश्रण डालो । पेट्री डिश को एक मिनी वैक्यूम चैंबर में सेट करें और पीडीएमएस मिश्रण को 1-3 घंटे(चित्रा 2C)के लिए डीएरेट करें।
      नोट: यदि कोई हवा 1 घंटे के बाद पीडीएमएस मिश्रण में रहती है, तो पेट्री डिश को वैक्यूम चैंबर से बाहर निकालें, एयर ब्लोअर का उपयोग करके हवा के बुलबुले को तोड़ें, और फिर पेट्री डिश को वैक्यूम चैंबर में वापस रखें और डीएरेशन प्रक्रिया जारी रखें।
    5. पीडीएमएस(चित्रा 2डी)को ठीक करने के लिए रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पेट्री डिश रखें।
      नोट: हालांकि तापमान में वृद्धि इलाज के समय को छोटा कर सकती है, लेकिन शारीरिक विरूपण के बिना पॉलीस्टीरीन पेट्री डिश द्वारा सहन किया जा सकता है कि अधिकतम तापमान लगभग 60 डिग्री सेल्सियस है।
  3. पीडीएमएस चैनल की प्रतिकृति मोल्डिंग
    1. पेट्री डिश(चित्रा 2E)से ठीक पीडीएमएस इलास्टोमर को छील लें।
    2. एक फ्लैट केबल कटर(चित्रा 2F)का उपयोग कर PDMS चैनल ब्लॉक के हर टुकड़े को काट दें ।
    3. पीडीएमएस इलास्टोमर को चैनल साइड का सामना करने वाली कटिंग मैट पर रखें। बायोप्सी पंच(चित्रा 2G)का उपयोग करके चैनल के प्रत्येक छोर पर एक छेद पंच करें।
    4. स्कॉच टेप से पीडीएमएस चैनल की सतह को साफ करें। फिर उपयोग से पहले इसे साफ रखने के लिए पीडीएमएस राल को स्कॉच टेप के दूसरे टुकड़े में लपेटें। तैयार पीडीएमएस चैनल को साफ पेट्री डिश में स्टोर करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. फेमटोलिएटर माइक्रोचैम्बर सरणी डिवाइस की विधानसभा

  1. एक सरलीकृत आर्द्रीकरण कक्ष बनाने के लिए पेट्री डिश की अंदर की दीवार के साथ पानी से लथपथ साफ वाइपर के कुछ टुकड़े रखें। स्कॉच टेप द्वारा कवर किए गए पीडीएमएस राल को ह्यूमिडिफाइंग चैंबर में रखें और पैराफिन फिल्म का उपयोग करके चैंबर को सील करें। कम से कम 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट लेकिन अब एक दिन से नहीं।
    नोट: पीडीएमएस एक असुरक्षित सामग्री है जो गैस को राल39के पार से गुजरने की अनुमति देती है। पीडीएमएस की असुरक्षित संरचना संतुलन तक पहुंचने तक आसपास से पानी के अणुओं का अवशोषण करती है। यह पूर्व उपचार पीडीएमएस के छिद्रों को जल वाष्प से भरता है और पीडीएमएस चैनल के किनारे से सटे जलीय बूंदों के वाष्पीकरण को काफी दबा सकता है।
  2. पीडीएमएस राल से स्कॉच टेप ले लो। सब्सट्रेट(चित्रा 2H)के माइक्रोचैम्बर सरणी क्षेत्र पर पीडीएमएस चैनल की स्थिति।
    नोट: पीडीएमएस राल बैकरिबली CYTOP सतह का पालन करता है। पीडीएमएस राल और सब्सट्रेट के बीच में किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए एक चिमटी के साथ पीडीएमएस ब्लॉक धीरे से दबाएं यदि अस्तित्व में है।
  3. पीडीएमएस चैनल के छेद के एक (आउटलेट के रूप में) के लिए एक 200 μL गैर फ़िल्टर पाइपट टिप डालें।
    नोट: पीडीएमएस और CYTOP के बीच आसंजन शक्ति सीमित है। पीडीएमएस राल के शारीरिक विरूपण के साथ-साथ सतह से पीडीएमएस चैनल की टुकड़ी से बचने के लिए, पिपेट टिप को बहुत गहरा न डालें।

4. इकट्ठे डिवाइस के लिए प्रतिक्रिया समाधान लोड हो रहा है

  1. बर्फ पर एक एल्यूमीनियम माइक्रोट्यूब स्टैंड रखो। एल्यूमीनियम स्टैंड पर 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में फ्लश तेल (ASAHIKLIN AE-3000 तेल 0.1% SURFLON S-386 सर्फेक्टेंट के साथ मिश्रित) को प्रीकहिल करें।
  2. बर्फ पर एक और एल्यूमीनियम ब्लॉक रखो।
  3. सीएफपीएस रिएक्शन सॉल्यूशन की तैयारी
    1. एक पीसीआर ट्यूब में CFPS प्रतिक्रिया समाधान तैयार करें। सीएफपीएस किट के हर एलिकोट घटक, एक पतला टेम्पलेट डीएनए (फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमनेग्रीन40 और एस्चेरिचिया कोलाई क्षारीय फॉस्फेट41)समाधान, और विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार अन्य आवश्यक घटकों (जैसे, RNase अवरोधक, फ्लोरोजेनिक सबस्ट्रेट, चैपरोन) द्वारा उदाहरण के रूप में मिलाएं।
      नोट: CFPS के लिए इस्तेमाल टेम्पलेट डीएनए इसी CFPS किट के निर्देश के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए । इस प्रदर्शन ने T7-आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली४२लागू की । क्योंकि फेमडा डिवाइस में रिएजेंट खपत काफी छोटी है, 10 माइक्रोन पूरे पीडीएमएस चैनल को भरने के लिए काफी बड़ी है।
    2. mNeonGreen फ्लोरोसेंट प्रोटीन संश्लेषण के लिए, निम्नलिखित क्रम में घटकों को मिलाएं: 2.7 माइक्रोन न्यूक्लियेज-फ्री एच2ओ को समाधान ए (सीएफपीएस किट से) के 6 माइक्रोन एलिकोट में जोड़ें; RNase अवरोधक के 0.3 μL जोड़ें; पतला टेम्पलेट डीएनए समाधान के 1.5 माइक्रोन जोड़ें; संक्षेप में मिश्रण को घोल बी (सीएफपीएस किट से) के 4.5 माइक्रोन एलिकोट में मिलाएं और स्थानांतरित करें।
      नोट: कुल मात्रा 15 माइक्रोन है। चूंकि प्रत्येक एलिकोट की मात्रा अंतिम मिश्रण की कुल मात्रा के आनुपातिक होती है, इसलिए 10 माइक्रोन से कम कुल मात्रा में कुछ घटक अलीकोट की बहुत छोटी मात्रा (< 0.2 माइक्रोन) हो सकती है।
    3. क्षारीय फॉस्फेट संश्लेषण के लिए, निम्नलिखित क्रम में घटकों को मिलाएं: समाधान ए के 1.2 माइक्रोन को एच2ओ से 6 माइक्रोन जोड़ें; RNase अवरोधक के 0.3 μL जोड़ें; 1 और 2 (एक किट से) डियूल्फाइड बॉन्ड एन्हांसर का 0.6 माइक्रोल जोड़ें; 5 m 6,8-डिफ्लोरो-4-मेथिलुबेलेफेरिल फॉस्फेट (DiFMUP) के 0.3 माइक्रोल जोड़ें; डीएनए समाधान के 1.5 माइक्रोन जोड़ें; संक्षेप में मिश्रण को 4.5 माइक्रोन में मिलाएं और स्थानांतरित करें समाधान बी।
      नोट: क्षारीय फॉस्फेट की परख में, फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट DiFMUP टर्मिनल फॉस्फेट समूह के एंजाइमेटिक क्लीवेज पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट 6,8-डिफ्लोरो-7-हाइड्रोक्सी-4-मिथाइलकोमरीन (DiFMU) का उत्पादन कर सकता है।
  4. 200 माइक्रोन गैर-फ़िल्टर किए गए पिपेट टिप का उपयोग करके मिश्रण के 10 माइक्रोन को खींचें। पीडीएमएस चैनल के इनलेट होल (चरण 3.3 को संदर्भित) में पिपेट टिप डालें। चैनल के समाधान को इंजेक्ट करने के लिए प्लंजर पर नीचे पुश करें जब तक कि यह आउटलेट से ओवरफ्लो न हो जाए (जहां एक और पिपेट टिप पहले से ही चरण 3.3 पर डाला गया है)।
  5. पिपेट टिप से पिपेट को अलग करें और इन दोनों पिपेट टिप्स को अभी भी इनलेट और आउटलेट में डाला जाए।
    नोट: पाइपिंग के दौरान हवा के बुलबुले पैदा करने से बचें। पीडीएमएस चैनल के अंदर समाधान के बैकफ्लो को रोकने के लिए पिपेट टिप से पिपेट को अलग करने तक प्लंजर से अंगूठे को न छोड़ें।

5. CFPS के लिए फेमटोलिएटर ड्रॉपलेट सरणी (फेमडीए) का उत्पादन करना

  1. इकट्ठे डिवाइस के पूरे सेट को प्री-ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में स्थानांतरित करें (चरण 4.2 देखें)। ध्यान से पुष्टि करें कि माइक्रोचैम्बर सरणी क्षेत्र जल्दी से पारदर्शी(चित्रा 2I)से पारदर्शी(चित्रा 2J)में बदल जाता है।
    नोट: CFPS प्रतिक्रिया समाधान सीधे माइक्रोचेम्बर्स में प्रवेश नहीं कर सकता। पानी में हवा की घुलनशीलता तापमान के विपरीत अनुपात में है। डिवाइस को आरटी से कम तापमान में ले जाने के बाद फंसी हुई हवा समाधान में भंग हो जाएगी । पारदर्शिता परिवर्तन यह निर्णय लेने के लिए एक सुविधाजनक दृश्य संकेतक है कि समाधान माइक्रोचैम्बर्स में प्रवेश करता है या नहीं।
  2. पूर्व ठंडा फ्लश तेल के 30 μL ड्रा (चरण 4.1 देखें), और तुरंत अपने ऊपरी खोलने से इनलेट-डाला पिपेट टिप में तेल स्थानांतरित करें। फ्लश तेल चैनल में ले जाता है और माइक्रोचैम्बर्स के बाहर स्थित अतिरिक्त प्रतिक्रिया समाधान को बाहर निकालता है। हर माइक्रोचैंबर फ्लश तेल से अलग-थलग है।
    नोट: प्रतिक्रिया समाधान और फ्लश तेल के बीच चलती इंटरफ़ेस दिखाई देता है, जो लोगों को चैनल के अंदर तरल पदार्थ के आंदोलन का निरीक्षण करने में मदद करता है। निकाले गए समाधान को पिछली ट्यूब में एकत्र किया जा सकता है, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और एक अन्य फेमडा डिवाइस या समानांतर थोक प्रतिक्रिया (माइक्रोट्यूब या माइक्रोटिटर प्लेट में) के लिए पुन: इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 200 माइक्रोन फ़िल्टर किए गए पिपेट टिप के लिए सीलिंग तेल (फोम्बलिन वाई25) के 30 माइक्रोन को पूर्व-ड्रा करें। पिपेट को कहीं सीधा लटका दें।
  4. इसके साथ ही डिवाइस से दो डाला पिपेट टिप्स (चरण 3.3 और 4.4 देखें) निकालें। तुरंत डिवाइस को एल्यूमीनियम ब्लॉक से पैराफिल्म में ले जाएं।
    नोट: पाइपेट युक्तियों को हटाने की अवधि के दौरान एल्यूमीनियम ब्लॉक पर डिवाइस को ठीक करने के लिए चिमटी का उपयोग करें (लेकिन चैनल क्षेत्र से दूर रखें) ।
  5. तुरंत तैयार पिपेट टिप जिसमें सीलिंग तेल (चरण 5.3 देखें) को पीडीएमएस चैनल के प्रवेश में डालें, और आउटलेट से ओवरफ्लो होने तक चैनल में तेल इंजेक्ट करें।
    नोट: जैसे ही डिवाइस को आरटी में ले जाते हैं, इस कदम को पूरा करें। चैनल के अंदर बैकफ्लो को रोकने के लिए, दुकान से सीलिंग तेल ओवरफ्लो होने तक अंगूठे को प्लंजर से न छोड़ें। फ्लश तेल चैनल के आउटलेट से बाहर जाने के तुरंत बाद वाष्पित हो जाता है, जबकि निम्नलिखित सीलिंग तेल आउटलेट में अपने बेहद कम वाष्पीकरण हानि के कारण जमा होता है।
  6. पिपेट टिप से पिपेट को अलग करें और फिर डिवाइस से पिपेट टिप निकालें। स्वच्छ वाइपर के एक टुकड़े का उपयोग करके पीडीएमएस सतह को साफ करें और फिर क्रमशः इनलेट और आउटलेट पर सीलिंग तेल की एक नई बूंद लागू करें। फेमोलीटर बूंदों को तेल द्वारा व्यक्तिगत माइक्रोचेम्बर में सील कर दिया जाता है।
    नोट: माइक्रोपिपेट टिप को हटाने की अवधि के दौरान सब्सट्रेट पर पीडीएमएस चैनल को ठीक करने के लिए चिमटी का उपयोग करें (लेकिन चैनल क्षेत्र से दूर रहें) ।
  7. कवर ग्लास की निचली सतह पर जमी नमी को पोंछ लें। एएस-तैयार फेमडा डिवाइस अब इनक्यूबेशन और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तैयार है।

6. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

  1. एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शुरू करें। कैमरे के स्थिरीकरण (ठंडा) के लिए प्रतीक्षा करें। 60x या 100x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें। मोटराइज्ड स्टेज पर फेमडा डिवाइस सेट करें। इमेजिंग पैरामीटर सेट करें।
    नोट: इमेजिंग मापदंडों फ़ाइल पथ, इमेजिंग चैनल, फिल्टर, जोखिम समय (सामान्य रूप से, १०० एमएस पर्याप्त है शामिल हैं; कम या लंबा समय भी कैमरे के विनिर्देश के अनुसार संभव है), और प्रकाश तीव्रता ।
  2. फोकल प्लेन का पता लगाएं। उद्देश्य लेंस की जेड-एक्सिस स्थिति को समायोजित करें और आंतरिक ऑटोफोकस सिस्टम का उपयोग करके फोकल प्लेन को ठीक करें। ब्याज के क्षेत्र (आरओआई; यानी, एक्स, वाई-एक्सिस) को इमेज्ड करने के लिए सेट करें ।
    नोट: प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माता (निकॉन, ओलंपस, ज़ीस, लीका) सभी माइक्रोस्कोप के साथ ऑटोफोकस सिस्टम को एकीकृत करने का विकल्प प्रदान करते हैं। यह ऑटोफोकस सिस्टम ऑटोमैटिक मल्टी-एरिया इमेजिंग के दौरान फोकल प्लेन को स्थिर रखने के लिए जरूरी है। आरओआई पीडीएमएस चैनल में फेमडा क्षेत्र को कवर करता है।
  3. फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें। हर आरओआई के लिए एक डिफोकस्ड ब्राइट-फील्ड (बीएफ) छवि के एक फ्रेम पर कब्जा करें। विभिन्न चैनलों इमेजिंग करते समय आरओआई के आदेश और निर्देशांक न बदलें।

7. छवि डेटा विश्लेषण

नोट: प्रत्येक बूंद43की फ्लोरेसेंस तीव्रता निकालने के लिए फिजी (http://fiji.sc) के आधार पर एक घर का बना प्लगइन (नाम "फेमडा" नाम) का उपयोग करके छवि डेटा का विश्लेषण करें। ऑपरेटिंग सिस्टम के अनुसार फिजी का सही संस्करण स्थापित करें। फिजी बिल्ड-इन प्लगइन "बायो-फॉर्मेट" का उपयोग करके अधिकांश छवि फ़ाइल प्रारूपों (उदाहरण के लिए, निकॉन माइक्रोस्कोप से nd2 फ़ाइल, Zeiss माइक्रोस्कोप से सीजी फाइल) का समर्थन करता है।

  1. प्लगइन स्थापना
    1. फिजी के "प्लगइन्स" फ़ोल्डर में प्लगइन फ़ाइल (जो संबंधित लेखक या निम्नलिखित संस्थागत लिंक के माध्यम से जांच पर उपलब्ध है https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) को कॉपी और पेस्ट करें।
    2. फिजी सॉफ्टवेयर शुरू करें; प्लगइन "फेमडा" फिजी के ड्रॉप-डाउन मेनू "प्लगइन्स" में पाया जा सकता है।
  2. इमेज डेटा प्रीप्रोसेसिंग
    1. डिफोकस्ड बीएफ इमेज खोलें (चरण 6.3 देखें)। क्लिक करें प्रक्रिया । घटाना पृष्ठभूमि... छवि डेटा(चित्रा 4B)के हर फ्रेम की चिकनी सतत पृष्ठभूमि को हटाने के लिए । क्लिक करें प्रक्रिया । फिल्टर । औसत छवि डेटा(चित्रा 4C)के हर फ्रेम के शोर को कम करने के लिए ।
    2. क्लिक करें छवि । समायोजित करें । छवि डेटा के हर फ्रेम (चित्र 4ए-सीमें बढ़ाया आवेषण) की पृष्ठभूमि (माइक्रोचम्बर्स के बाहर के क्षेत्र को दर्शाता है) से अग्रभूमि (माइक्रोचेम्बर्स का संकेत) की जांच और अलग करने के लिए दहलीज।
      नोट: दहलीज खिड़की में ड्रॉप-डाउन सूची से एक उचित एल्गोरिदम का चयन करें ताकि केवल माइक्रोचैम्बर क्षेत्रों के साथ-साथ हर माइक्रोचैम्बर के किनारों की पहचान की जा सके और अग्रभूमि के रूप में हाइलाइट किया जा सके। विशेष रूप से, अधिकांश हाइलाइट किए गए किनारों को अंतराल के बिना निरंतर होना चाहिए।
  3. बूंद समन्वय दृढ़ संकल्प
    1. प्लगइन्स पर क्लिक करें । फेमडा । फेमडा विश्लेषण अनुकूलित प्लगइन (चित्रा 4Dका ऊपरी आधा) का ग्राफिक यूजर इंटरफेस (जीयूआई) खोलने के लिए।
    2. एक माइक्रोचैम्बर के पिक्सल की अनुमानित न्यूनतम और अधिकतम संख्या इनपुट करें। माइक्रोचैम्बर्स की अपेक्षित न्यूनतम और अधिकतम गोलाकारता (0: मनमाना आकार; 1: सही सर्कल) इनपुट करें। स्टार्ट फ्रेम और एंड फ्रेम के फ्रेम नंबर को इनपुट करें।
    3. क्लिक करें हर माइक्रोचैम्बर का पता लगाने के लिए जीयूआई पर आरओआई उत्पन्न करें, और सफलतापूर्वक पता लगाने वाले आरओआई को पॉपअप विंडो ROITableमें दिखाया गया है।
    4. विंडो फेमडीए विश्लेषण पर वापस जाएं और बटन पर क्लिक करें आरओआई मास्क को यह जांचने के लिए लागू करें कि क्या फ्रेम पर माइक्रोचेम्बर्स का ठीक से पता लगाया गया था (चित्रा 4Dका निचला बायां)। यदि नहीं, उनमें से कुछ को संशोधित करें और आरओआई उत्पन्न करने पर क्लिक करें और आरओआई मास्क लागू करें। अगर हां तो अगले स्टेप पर जाएं।
      नोट: अग्रभूमि और पृष्ठभूमि के बीच अपर्याप्त विपरीत होने के कारण दहलीज के किसी भी एल्गोरिदम द्वारा आरओआई (चित्रा 4Dके निचले आधे हिस्से को देखें) के रूप में अच्छी तरह से पहचाने जाने वाले बहुत कम माइक्रोचेम्बर्स हो सकते हैं। सांख्यिकीय दृष्टिकोण में यह समस्याग्रस्त नहीं है ।
  4. फ्लोरेसेंस तीव्रता निष्कर्षण
    1. फ्लोरेसेंस इमेज खोलें और सामने लाएं। क्लिक करें फ्लोरेसेंस इमेज (फिगर 4डीका निचला अधिकार) पर निर्धारित आरओआई लागू करने के लिए आरओआई मास्क फिर से लगाएं।
    2. एक अंत बिंदु छवि का विश्लेषण करने के लिए या तो एक शॉट का चयन करें (जैसा कि mNeonGreen डेटा के साथ उदाहरण) या समय-चूक का विश्लेषण करने के लिए समय-पाठ्यक्रम डेटा (जैसा कि क्षारीय फॉस्फेट डेटा के साथ उदाहरण है)।
    3. शीर्ष पिक्सल के बॉक्स नंबर में इनपुट 100 का मतलब है कि केवल प्रत्येक आरओआई के शीर्ष 100 पिक्सल का उपयोग संबंधित बूंद की औसत तीव्रता की गणना करने के लिए किया जाएगा। यदि शीर्ष पिक्सल की संख्यामें इनपुट 0, प्रत्येक आरओआई के सभी पिक्सल का उपयोग संबंधित बूंद की औसत तीव्रता की गणना करने के लिए किया जाएगा।
      नोट: BF और फ्लोरेसेंस छवियों के बीच कई पिक्सल का बहाव हो सकता है, जिसका अर्थ है कि आरओआई के भीतर कुछ पिक्सेल फ्लोरेसेंस इमेज की पृष्ठभूमि से संबंधित हो सकते हैं। इसलिए, प्लगइन हर बूंद की औसत तीव्रता की गणना के लिए शीर्ष तीव्रता-रैंक वाले पिक्सेल की संख्या निर्दिष्ट करने का विकल्प प्रदान करता है।
    4. एंड-पॉइंट इमेज के विश्लेषण के लिए (यानी, चरण 7.4.2 पर वन-शॉट का चयन करें), सभी खोजी गई बूंदों की औसत तीव्रता की गणना करने के लिए बटन उपाय तीव्रता पर क्लिक करें। आरओइटेबल को फ्लोरेसेंस इमेज से नए डेटा के साथ अपडेट किया गया है। इस बीच, एक हिस्टोग्राम एक नई पॉपअप विंडो हिस्टोग्राम (चित्रा 4E)में प्रदर्शित किया जाता है।
      नोट: बॉक्स बिन नंबर में बिन आकार बदलने से हिस्टोग्राम के प्रदर्शन का अनुकूलन हो सकता है। विकसित जीयूआई में गॉसियन वितरण के योग के लिए एक फिटिंग को पूरा किया जा सकता है। फिजी की पॉपअप लॉग विंडो फिटिंग परिणाम प्रदर्शित करता है। वैकल्पिक रूप से, बटन सेव को टेक्स्ट के रूप में क्लिक करके डेटा का निर्यात करें और अन्य सॉफ्टवेयर(चित्रा 4एफ, जी)के साथ विभिन्न सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    5. समय-पाठ्यक्रम छवि के विश्लेषण के लिए (यानी, चरण 7.4.2 पर समय-चूक का चयन करें), पॉपअप विंडो हिस्टोग्रामके बजाय तीव्रता समय पाठ्यक्रम है, जिसमें एक विशिष्ट समय-बिंदु और समय-तीव्रता साजिश(चित्रा 5)के अनुरूप हिस्टोग्राम होता है। पॉपअप विंडो के फाइल मेनू का उपयोग करके टेक्स्टिक डेटा को निर्यात भी किया जा सकता है।

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Representative Results

माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया में सब्सट्रेट सफाई, सतह कार्यात्मकता, साइटोप कोटिंग, फोटोलिथोग्राफी, सूखी नक़्क़ाशी, फोटोरेसिस्ट स्ट्रिपिंग और अंतिम सफाई शामिल हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने माइक्रोचेम्बर्स फिगर 3 एके अंदर हाइड्रोफोबिक CYTOP बहुलक को पूरी तरह से हटाने की अनुमति दी, जो एक मानक कवर ग्लास सब्सट्रेट पर एक अत्यधिक समानांतर हाइड्रोफिलिक-इन-हाइड्रोफोबिक संरचना का उत्पादन करता है। तेल सीलिंग प्रोटोकॉल की सहायता से, परिणामी बूंदों के समान आयाम को माइक्रोचेम्बर्स(चित्रा 3 बी)में फ्लोरोसेंट समाधान को एनकैप्सुलेट करके सत्यापित किया गया था। विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निकाली गई फ्लोरेसेंस तीव्रता बूंदी के आकार का एक अच्छा संकेतक है। फ्लोरेसेंस तीव्रता का सीवी, 3%, पूरे सरणी(चित्रा 3C)पर बूंद आकार के संकीर्ण वितरण को प्रतिबिंबित करता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से खंगाली गई 3डी इमेज में समय के साथ लगातार बूंद की मात्रा(चित्र 3डी, सप्लीमेंट्री मूवी 1)44भी दिखाई दी . इसकी तुलना में, एक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एफसी-40 तेल ने फ्लोरेसेंस तीव्रता45में कई गुना अंतर प्रदर्शित करने वाली बूंदों को उत्पन्न किया। फेमडा में गठित बूंदें कम से कम 24 घंटे(चित्रा 3E)के लिए आरटी पर स्थिर थीं। बूंदों की उच्च गुणवत्ता अंततः मात्रात्मक माप का आधार बनती है।

उच्च-थ्रूपुट डेटा के लिए उच्च-थ्रूपुट डेटा-विश्लेषण उपकरण46,,47की आवश्यकता होती है। विकसित प्लगइन ने छवि डेटा विश्लेषण को बहुत सरल और गति दी। डिजिटल इमेज प्रोसेसिंग48के सिद्धांत के आधार पर, डिफोकस्ड बीएफ इमेज को बिनारीज़ किया जा सकता है और इसका उपयोग पृष्ठभूमि सुधार और शोर में कमी(चित्र 4ए-सी)के बाद हर बूंद की समन्वय जानकारी प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। इस विचार ने अंधेरे बूंदों के सटीक स्थानीयकरण को संभव बनाया।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमनॉनग्रीन को फेमडा में संश्लेषित किया गया था। प्रति बूंद 0.05 अणुओं की एकाग्रता के साथ टेम्पलेट डीएनए को धीरे-धीरे प्रत्येक बूंद में वितरित किया गया था ताकि युग्मित सेल-मुक्त प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं के साथ प्रोटीन संश्लेषण शुरू किया जा सके। क्योंकि प्रति बूंद डीएनए अणुओं की औसत संख्या 1 से छोटी थी, कुछ बूंदों में शून्य टेम्पलेट डीएनए था, जबकि अन्य में एक या अधिक डीएनए अणु थे । आरटी में इनक्यूबेशन के 6 घंटे के बाद, एंड-पॉइंट इमेज को माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। स्टैक इमेज डेटा का विश्लेषण विकसित सॉफ्टवेयर द्वारा समवर्ती डिफोकस्ड बीएफ इमेज(चित्रा 4ए-ई)की सहायता से किया गया था। प्रत्येक बूंद की फ्लोरेसेंस तीव्रता इसी बूंदी में प्रोटीन उपज का एक उपाय है। फ्लोरेसेंस तीव्रता के हिस्टोग्राम ने एक असतत वितरण दिखाया और समान पीक-टू-पीक अंतराल(चित्रा 4F)के गॉसियन वितरण की राशि द्वारा अच्छी तरह से फिट किया गया था, जिसने प्रति बूंद डीएनए अणुओं की विभिन्न संख्याओं के अधिभोग का दृढ़ता से सुझाव दिया था। दोहराया सिक्का-फ्लिपिंग खेल के समान, स्वतंत्र यादृच्छिक घटनाओं की संख्या जो होती है, गणितीय रूप से पॉइसन वितरण द्वारा वर्णित है। डीएनए अणुओं के विभिन्न संख्याओं (इस उदाहरण में 3 तक) युक्त बूंदों की घटना की संभावना एक पॉइसन वितरण के लिए एकदम सही फिट थी (पी = ई-1 k/k!, जहां प्रति बूंद डीएनए अणुओं की अपेक्षित औसत संख्या है और के एक बूंद में डीएनए अणुओं की वास्तविक संख्या है) ०.०५ डीएनए अणुओं प्रति बूंद(चित्रा 4जी)31के औसत के साथ, के रूप में डीएनए अणुओं के एक यादृच्छिक वितरण के लिए उंमीद है । क्योंकि टेम्पलेट डीएनए समाधान की लोडिंग एकाग्रता अंतिम फिट (यानी, 0.05) के समान थी, हमारे फेमडा में सीएफपीएस प्रतिक्रिया दक्षता 100% (या 100% के पास) थी। दूसरे शब्दों में, एक डीएनए अणु फेमोलीटर बूंद में कुशलता से CFPS प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त है ।

क्षारीय फॉस्फेट की सीएफपीएस रिएक्शन हर 5 मिनट में दर्ज किया गया । विकसित सॉफ्टवेयर समय-पाठ्यक्रम डेटा(चित्रा 5)का विश्लेषण करने में भी समर्थन करता है। युग्मित फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया ने पहले के समय-बिंदुओं पर बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता का एक समान असतत वितरण दिखाया। हिस्टोग्राम के परिणामों ने बूंद में डीएनए अणुओं की विभिन्न संख्याओं के अधिभोग का सत्यापन भी किया । फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट DiFMUP की क्रमिक कमी के साथ-साथ फ्लोरेसेस तीव्रता अंततः एक मूल्य के लिए एकाग्र हो गई।

Figure 1
चित्र 1: अल्ट्राहाई-डेंसिटी माइक्रोचमबर सरणी सब्सट्रेट की माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया। (क)अनुकूलित वैक्यूम चक की तकनीकी ड्राइंग। यूनिट: मिमी(बी)CYTOP फिल्म मोटाई बनाम स्पिन गति डेटा। (ग)एक सीलनीकृत ग्लास सब्सट्रेट पर परफ्लोरोपॉलिमर साइटॉप की स्पिन-कोटिंग। तस्वीरों ने समरूप कोटिंग का एक अच्छा उदाहरण दिखाया और क्रमशः अउमोजनेसियस कोटिंग का एक बुरा उदाहरण दिखाया। काले तीर ने अहोमोजेनियस साइटॉप फिल्म की विशिष्ट स्थिति का संकेत दिया। (घ)साइटो-कोटेड सब्सट्रेट पर फोटोरेसिस्ट की स्पिन-कोटिंग । स्पिन-कोटिंग के बाद, सब्सट्रेट किनारे के पास फोटोरेसिस्ट को इथेनॉल से लथपथ क्लीन वाइपर (मध्य तस्वीर) का उपयोग करके हटा दिया जाना चाहिए। तस्वीरों ने समरूप कोटिंग का एक अच्छा उदाहरण दिखाया और क्रमशः अउमोजनेसियस कोटिंग का एक बुरा उदाहरण दिखाया। सफेद तीर ने अहोमोजेनियस फोटोरेसिस्ट फिल्म की विशिष्ट स्थिति का संकेत दिया। (ई)मास्क एलाइनर का उपयोग करके लेपित फोटोरेसिस्ट का एक्सपोजर। (F)एक डेवलपर में उजागर फोटोरेसिस्ट का विकास। फोटोरेसिस्ट का उजागर हिस्सा डेवलपर समाधान में घुलनशील है। (जी)CYTOP की प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी। खुला CYTOP ओ2 प्लाज्मा द्वारा हटा दिया गया था । (ज)फोटोरेसिस्ट मास्क को हटाना। फोटोरेसिस्ट को एसीटोन ने हटा दिया था । सब्सट्रेट को 2-प्रोपेरोल और एच2ओ का उपयोग करके साफ किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोचैम्बर सरणी डिवाइस की तैयारी और उपयोग। (ए)पीडीएमएस के इलाज एजेंट और प्रीपॉलिमर का वजन। (ख)मिश्रित और deaerated मिश्रण को टेप पैटर्न वाली पेट्री डिश में डालना । बहुलक मिश्रण में कुछ नए उत्पन्न हवा के बुलबुले थे। (ग)मिश्रण को फिर से वैक्यूम कक्ष में डीएयर करना। हवा के बुलबुले बढ़ रहे थे और ऊपर की सतह पर फट गए । (घ)डीईएयरेटेड और ठीक पीडीएमएस राल। (ई)पेट्री डिश से ठीक पीडीएमएस इलास्टोमर को छीलने । (च)एक फ्लैट केबल कटर का उपयोग कर पीडीएमएस चैनल ब्लॉक के हर टुकड़े को काटना । (जी)पीडीएमएस चैनल के प्रत्येक छोर पर एक बायोप्सी पंच का उपयोग कर छिद्रण छेद । (ज)असेंबल डिवाइस । पीडीएमएस राल CYTOP सतह का पालन कर सकते हैं। (I)पीडीएमएस चैनल के अंदर पारदर्शी माइक्रोचैम्बर सरणी क्षेत्र जो हल्का होने से पहले जलीय समाधान से भरा हुआ है । (जम्मू)पीडीएमएस चैनल के अंदर पारदर्शी माइक्रोचैम्बर सरणी क्षेत्र हल्का होने के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अल्ट्रा-यूनिफॉर्म और अल्ट्रा-स्थिर फेमेटोलिटर ड्रॉपलेट्स। (A) गढ़ेसब्सट्रेट के लिए 3डी लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग। उदाहरण छवि में बेलनाकार माइक्रोचमर्स ने 3 माइक्रोन की ऊंचाई और 4 माइक्रोन का व्यास दिखाया। (ख)प्लानर सरणी के एक बड़े क्षेत्र में वर्दी फेमोलीटर बूंदें । केवल पूरे सरणी का एक आंशिक क्षेत्र यहां दिखाया गया था। प्रत्येक बूंद में फ्लोरोसेंट समाधान (10 माइक्रोन एटीओ-514) को सील कर दिया गया था। (ग)एक संपूर्ण एकल सरणी पर बूंदों का आकार वितरण । फ्लोरेसेंस तीव्रता का उपयोग बूंदों के आकार के संकेतक के रूप में किया जाता था। सीवी केवल 3% था। (घ)कॉन्फोकल जेड-स्टैक टाइम-कोर्स डेटा का उपयोग करके वॉल्यूमेट्रिक माप। सरणी के ऊपर बूंदों की मात्रा माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (एनआईएस-एलिमेंट्स, निकॉन) द्वारा दी गई थी। (ई)फोटोब्लैचिंग के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी । पहले फ्रेम के बाद, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के सीमित लेजर बीम का उपयोग करके कई बूंदों को पूरी तरह से फोटोब्लाच किया गया था। उनकी फ्लोरेसेंस तीव्रता 24 घंटे के लिए दर्ज की गई थी, और कोई फ्लोरेसेंस रिकवरी (लाल रेखा) नहीं देखी गई थी। देखने के एक ही क्षेत्र में अन्य गैर फोटोयुक्त बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता काली रेखा में दर्ज की गई थी। त्रुटि सलाखों (पारदर्शी रंग) हर बार बिंदु के लिए 1 एसडी थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अंत बिंदु सूक्ष्म छवि डेटा की विश्लेषण प्रक्रिया। प्रत्येक माइक्रोचैम्बर्स/बूंदों के समन्वय को निकालने के लिए डिफोकस्ड ब्राइट-फील्ड इमेज का इस्तेमाल किया गया था । माइक्रोचेम्बर्स (अग्रभूमि के रूप में) और अन्य क्षेत्रों (पृष्ठभूमि के रूप में) के किनारे के बीच तीव्रता अंतर के आधार पर, पृष्ठभूमि से निरंतर और निकट-गोलाकार किनारे निकाले जा सकते हैं। देखने के क्षेत्र में असमान पृष्ठभूमि वितरण(ए)के कारण, कुछ छवि पूर्व प्रसंस्करण आम तौर पर binarizing उत्पादन की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक है । पृष्ठभूमि(बी)को घटाने के बाद, हर फ्रेम की पृष्ठभूमि को एक समान किया गया था। अनुभवजन्य रूप से,"रोलिंग बॉल त्रिज्या"(चरण 1) में इनपुट मूल्य 20-50 पिक्सल × 2048 पिक्सेल छवियों के लिए और 10-20 512 पिक्सेल × 512 पिक्सेल छवियों के लिए था। मूल्य जितना बड़ा होगा, प्रसंस्करण का समय उतना ही कम होगा। पृष्ठभूमि-घटाया छवि में शोर को कम करने के लिए, छवि(सी)के लिए एक औसत फिल्टर लागू होते हैं । सामान्य तौर पर रेडियस (स्टेप 3) में इनपुट वैल्यू 1-2 पिक्सल थी। जैसा कि बढ़ाया डालने में दिखाया गया है, पृष्ठभूमि-घटाया और फ़िल्टर की गई छवि को बिल्ड-इन थ्रेसहोल्ड प्लगइन का उपयोग करके अच्छी तरह से बिनिज़ किया जा सकता है ताकि किनारों के साथ-साथ हितों के क्षेत्र (आरओआई) के अनुरूप अग्रभूमि को सटीक रूप से पहचाना जा सके। छवि के सभी फ्रेम के लिए ROIs का पता लगाने के स्थापित घर का बना प्लगइन फेमडीए विश्लेषण (डी)का उपयोग करके किया गया था । आरओआई के पिक्सेल आकार (चरण 5 और 6) और परिपत्रता (चरण 7 और 8), हम गणना में जिन फ्रेमों को रखना चाहते हैं (चरण 9 और 10) वास्तविक डेटा के अनुसार मैन्युअल रूप से परिभाषित किए गए थे। जेनरेट आरओआई (चरण 11) और प्रतीक्षा पर क्लिक करने के बाद, इनपुट फ्रेम में हर आरओआई का समन्वय निर्धारित किया गया था। लागू आरओआई मास्क (चरण 12) पर क्लिक करने के बाद, हर पता लगाया गया आरओआई संलग्न किया गया था और एक पीली रेखा द्वारा हाइलाइट किया गया था। फ्लोरेसेंस इमेज खोलने और फिर से लागू आरओआई मास्क पर क्लिक करने के बाद, निर्धारित आरओआई मास्क को फ्लोरेसेंस इमेज पर लागू किया गया था। शीर्ष पिक्सल (चरण 14) की संख्या संबंधित बूंदों की औसत तीव्रता की गणना के लिए प्रत्येक आरओआई के शीर्ष तीव्रता-रैंक वाले पिक्सेल की संख्या निर्दिष्ट करती है। उपाय तीव्रता (चरण 15) और प्रतीक्षा पर क्लिक करने के बाद, हिस्टोग्राम उत्पन्न हुआ(ई)। हिस्टोग्राम को हिस्टोग्राम विंडो में उपलब्ध मापदंडों का उपयोग करके गॉसियन वितरण की राशि के साथ फिट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मतलब तीव्रता डेटा को टेक्स्ट फाइल (चरण 16) में निर्यात किया जा सकता है और अन्य सॉफ्टवेयर(एफ)द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। (जी)दी गई सरणी में डीएनए अणुओं की विभिन्न संख्याओं वाली बूंदों की घटना की संभावना। हिस्टोग्राम (ग्रे रंग) को डीएनए अणुओं के यादृच्छिक वितरण के लिए अपेक्षित 0.05 डीएनए अणुओं के औसत के साथ एक पॉइसन वितरण (लाल धराशायी रेखा) द्वारा अच्छी तरह से फिट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: समय-पाठ्यक्रम सूक्ष्म छवि डेटा का विश्लेषण। पता लगाया ROIs (चित्रा 4 के चरण 1-12के बाद) सीधे समय पाठ्यक्रम डेटा के लिए लागू किया गया था । चित्रा 4के चरण 13 में, समय-चूक का चयन करें और समय-अंतराल [न्यूनतम] में आसन्न फ्रेम के बीच वास्तविक समय-अंतराल (मिनटों में)इनपुट करें। उपाय तीव्रता (चित्रा 4के चरण 15) और प्रतीक्षा पर क्लिक करने के बाद, समय-तीव्रता की साजिश और हिस्टोग्राम (चित्र 4Eके समान) उत्पन्न हुए। हिसट पोजीशन ने हिस्टोग्राम के टाइम-पॉइंट को निर्दिष्ट किया, जिसे वर्टिकल रेड लाइन के रूप में दिखाया गया था । प्लगइन हर ट्रेस लाइन के लिए निर्दिष्ट रंगों का भी समर्थन करता है। पीला: 0 डीएनए; नीला 1 डीएनए था; लाल: 2 डीएनए; काला: 3 डीएनए। टाइम-कोर्स डेटा को टेक्स्ट फाइल में भी निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फिल्म 1। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

फेमडा में अत्यधिक समान, स्थिर और जैव संगत बूंदों के आधार पर अत्यधिक मात्रात्मक माप ने असतत वितरण को सक्षम किया, हमारे अध्ययन की अनूठी विशेषता दूसरों से अलग है। हमने इस पेपर में माइक्रोफैब्रिकेशन और ड्रॉपलेट फॉर्मेशन प्रक्रियाओं को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित और विस्तृत किया। स्थापित प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं।

सबसे पहले, आयताकार पतली ग्लास सब्सट्रेट पर अत्यधिक चिपचिपा साइटॉप बहुलक की एक समान कोटिंग काफी हद तक परिणामी सब्सट्रेट की गुणवत्ता निर्धारित करती है। उच्च आवर्धन के साथ उद्देश्य लेंस की आम तौर पर कम काम की दूरी को देखते हुए (चरण 6.1 देखें), पतली कवर ग्लास का उपयोग किया जाना चाहिए। एक पतली और लचीली सब्सट्रेट पर एक उच्च गुणवत्ता वाले स्पिन-कोटिंग आम तौर पर मुश्किल है। हमने अभी तक सभी संभावित डिजाइनों का परीक्षण नहीं किया है लेकिन पाया है कि एक ही आयताकार आयाम के साथ मल्टी-होल वैक्यूम चक ने स्पिन-कोटिंग के लिए अच्छी तरह से काम किया। कवर ग्लास सब्सट्रेट के केंद्र में CYTOP बहुलक को छोड़ना और तुरंत स्पिन-कोटिंग शुरू करना महत्वपूर्ण है (चरण 1.3.2 देखें)। कठिनाई की डिग्री सब्सट्रेट के आकार से कम संबंधित है लेकिन बहुलक की चिपचिपाहट। CYTOP उत्पाद लाइन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पैकेज की कई अलग-अलग सांद्रता प्रदान करती है। पैकेज में साथ पतला भी जरूरत होने पर मूल उत्पाद को कम चिपचिपाहट में पतला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। CYTOP 816 जो हमने प्रयोग में उपयोग किया है वह वाणिज्यिक उत्पाद है जिसमें सबसे अधिक एकाग्रता होती है जो सॉल्वेंट में बहुलक को स्थिर रूप से भंग करने में सक्षम होती है। मोटा कोटिंग कम स्पिन गति या कोटिंग और इलाज के कई दौर की आवश्यकता है । एक नए वातावरण में एक नए स्पिन कोटर का उपयोग करते समय विशिष्ट मोटाई बनाम स्पिन गति वक्र की एक साजिश अत्यधिक अनुशंसित है।

दूसरा, क्लीनरूम की उपयुक्त आर्द्रता आदर्श फोटोलिथोग्राफी के साथ-साथ निर्दिष्ट स्थिति पर फोटोरेसिस्ट को पूरी तरह से हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। फोटोलिथोग्राफी में फोटोकेमिकल रिएक्शन में एच2ओ का उपयोग एक प्रतिक्रियाकर्ताओं के रूप में किया जाता है। हालांकि, एच2ओ के उबलते तापमान से अधिक तापमान पर सॉफ्टबेक को लेपित फोटोरेसिस्ट से एच2ओ सामग्री को हटा देता है। "सूखे" फोटोरेसिस्ट को हवा से फिर से एच2ओ को अवशोषित करने में समय लेना चाहिए (चरण 1.4.6 देखें)। इस बात को अक्सर अनदेखा किया जाता है । यह देखते हुए कि कई प्रयोगशालाओं में आर्द्रता नियंत्रण के बिना केवल कुछ सरलीकृत क्लीनरूम सुविधाएं हो सकती हैं, आर्द्रता मौसम में नाटकीय रूप से उतार-चढ़ाव करेगी या मौसम से प्रभावित होगी। कम लागत वाला समाधान क्लीनरूम में घर में उपयोग करने वाले ह्यूमिडिफायर या डेहुमिडिफायर का उपयोग करना है। विकास के बाद पूरी तरह से उजागर CYTOP परत चुनिंदा और पूरी तरह से RIE द्वारा हटाया जा सकता है, पूरी तरह से कांच के नीचे उजागर । अंततः, हाइड्रोफिलिक ग्लास बॉटम और हाइड्रोफोबिक साइटॉप साइडवॉल की हाइब्रिड संरचना फेमोलीटर अंतरिक्ष के लिए जलीय समाधान को स्थिर रूप से फँसाने के लिए महत्वपूर्ण है।

तीसरा, नए पाए गए तेलों (ASAHIKLIN AE-३०००, Fomblin Y25) और सर्फेक्टेंट (SURFLON एस-३८६) फ्लोरोपॉलिमर रिएक्टर13के लिए अभूतपूर्व सीलिंग प्रदर्शन दिखाया । फ्लश तेल का इंजेक्शन ठंडा फ्लैट धातु ब्लॉक पर किया जाना चाहिए (चरण 5.2 देखें); अन्यथा, चैनल के प्रवेश के पास बूंदें नहीं बनाई जा सकतीं। दूसरे सीलिंग तेल का इंजेक्शन आरटी में किया जा सकता है (चरण 5.5 देखें)। इन तेलों और सर्फेक्टेंट का इस्तेमाल पहले कभी जैविक शोध में नहीं किया गया है । अभी के लिए कोई बेहतर विकल्प नहीं मिल पाया है । बूंद तैयारी के लिए तेलों और सर्फेक्टेंट के उपयोगी संयोजन के शस्त्रागार का विस्तार करने के लिए, तेलों के नए सदस्य (या एक ही उत्पाद लाइन में समान) और सर्फेक्टेंट (या एक ही उत्पाद लाइन में समान) माइक्रोफ्लूइडिक ड्रॉपलेट सिस्टम में लागू होने की कोशिश करने के योग्य हैं।

यहां नोटिस करने के लिए दो अतिरिक्त बिंदु हैं । एक तथ्य यह है कि माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के दौरान आरओआई के बीच एक समय अंतराल है। एक चक्र के लिए कुल इमेजिंग समय मुख्य रूप से सरणी आकार और उद्देश्य लेंस के आवर्धन पर निर्भर है। एक्सपोजर समय, शटर गति, और मोटर चालित चरण की चलती गति भी मामूली कारक हैं। अंगूठे के नियम के रूप में, 60 × आवर्धन पर10 6 बूंदों इमेजिंग को कम से कम 10-20 मिनट की आवश्यकता होगी। यह अपरिहार्य समय अंतराल डेटा विश्लेषण में कुछ त्रुटियों का परिचय देता है, जिसे हमेशा सावधानीपूर्वक ध्यान में रखा जाना चाहिए। दूसरा तथ्य यह है कि एक सब्सट्रेट पर बूंदों की कुल संख्या 108 -109से अधिक नहीं होगी, यहां तक कि बूंदों के घनत्व को बढ़ाना या बूंदों के व्यक्तिगत आकार को कम करना। इसका कारण यह है कि ग्लास सब्सट्रेट का आकार जिसे मास्क एलाइनर (4 इंच वेफर्स के लिए) द्वारा संभाला जा सकता है, सीमित है। कवर ग्लास के आकार को और बढ़ाना अनुशंसित नहीं है क्योंकि एक बड़ा, पतला और नाजुक ग्लास सब्सट्रेट को संभालना मुश्किल है।

फेमडा को सुपर मिनिएचर माइक्रोटिटर प्लेट माना जा सकता है। 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में किए गए किसी भी जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को फेमडीए का उपयोग करके संचालित करने की कोशिश की जा सकती है। यह निश्चित रूप से जटिल प्रोटीन शुद्धिकरण के बिना एंजाइम गतिविधि माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह डिजिटल पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (डिजिटल पीसीआर) और डिजिटल एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (डिजिटल एलिसा)31,,49के साथ भी संगत हो सकता है। छोटी मात्रा, बड़ी सरणी, और उच्च स्थिरता मौजूदा डिजिटल बायोसे विधियों पर कुछ फायदे लाएगी। फेमडा प्रणाली जो विभिन्न प्रकार के टेम्पलेट डीएनए अणुओं को फेमोलेटर बूंदों में हल करने में सक्षम है , वह पहले ही सटीक प्रोटीन स्क्रीनिंग13पर शक्ति दिखा चुकी है । फेमडा एक नया इन विट्रो कंपार्टमेंटलाइजेशन सिस्टम है जो विभिन्न प्रकार के एंजाइमों को तेजी से विकसित करने में सक्षम है। जैव सूचना विज्ञान और पुस्तकालय निर्माण तकनीकों में प्रगति के साथ, उच्च प्रदर्शन प्रोटीन के एक त्वरित पर मांग निर्माण के युग निश्चित रूप से आ रहा होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर JP18K14260 और मरीन-अर्थ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के लिए जापान एजेंसी के बजट द्वारा समर्थित किया गया था। हम लक्षण वर्णन सुविधाएं प्रदान करने के लिए शिगेरू डेगुची (जेएसटेक) और टेत्सुरो इकुटा (JAMSTEC) को धन्यवाद देते हैं। हम वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर समर्थन के लिए केन ताकाई (JAMSTEC) का शुक्रिया अदा करते हैं। माइक्रोफैब्रिकेशन टोक्यो विश्वविद्यालय के टेकडा सेंटांची सुपरक्लीनरूम में आयोजित किया गया था, जो शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (एमईएक्सटी), जापान, ग्रांट नंबर JPMXP09F19UT0087 के "नैनोटेक्नोलॉजी प्लेटफॉर्म प्रोग्राम" द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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